Resposta adaptativa e efeitos das substâncias oxidantes - K2TeO3, H2O2 e paraquate - na produção de biofilme de amostras de Corynebacterium diphtheriae isolados de origens diversas

A difteria é uma doença imunoprevinível que permanece endêmica em diversas regiões do mundo. Além dos casos de difteria clássica, doenças invasivas como endocardite, osteomielite, pneumonia e infecções relacionadas à cateter, tem acometido indivíduos adultos parcialmente imunizados. A natureza multifatorial dos fatores de virulência que favorecem a formação de biofilme e sobrevivência em macrófagos tem sido evidenciada para o Corynebacterium diphtheriae. Entretanto, escassos são os trabalhos que investigaram a influência de condições ambientais na virulência do patógeno. Uma vez que agentes oxidantes são capazes de gerar radicais livres e levar ao estresse oxidativo que, consequentemente, podem resultar em resposta adaptativa e influenciar na formação do biofilme e na virulência bacteriana, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar os efeitos do peróxido de hidrogênio (H2O2), paraquate e telurito de potássio (K2TeO3) em propriedades biológicas de cepas de C. diphtheriae de origens diversas. Os resultados demonstraram que as amostras de C. diphtheriae apresentaram níveis de resistência ao K2TeO3, H2O2 e paraquate, porém em intensidades variadas e independentes da capacidade de produção da toxina diftérica. Algumas amostras, toxinogênicas ou não, isoladas do trato respiratório superior demonstraram resposta adaptativa para H2O2 passando, portanto, a expressar resistência aumentada após uma prévia exposição ao referido agente oxidante. C. diphtheriae não exibiu respostas adaptativas para o K2TeO3 e paraquate. C. diphtheriae foi capaz de produzir biofilme na superfície de substratos abióticos de natureza hidrofílica (vidro) e hidrofóbica (poliestireno) na presença de agentes oxidantes K2TeO3, H2O2 e paraquate. A presença dos agentes oxidantes influenciou na formação de biofilme de algumas amostras. O paraquate inibiu a produção de biofilme de todas amostras. A amostra TR241 teve a produçao de biofilme inibida na presença dos três agentes oxidantes analisados. Por outro lado, a presença de H2O2 e do K2TeO3 estimulou a produção de biofilme de algumas amostras. Para todas as amostras de C. diphtheriae testadas, independentes das origens, biotipos e da capacidade de produção de toxina diftérica, os ensaios moleculares indicaram a presença de sequências gênicas cromossômicas homólogas, codificadores da proteína DIP 0906 (TeR) e da proteína DIP 1421 (OxyR), envolvidos na resistência ao telurito e na proteção contra o estresse oxidativo, respectivamente. Não foi observada correlação da suscetibilidade e a resposta adaptativa aos agentes oxidantes com as diferentes características bacterianas: origem, sítio de isolamento, produção de toxina diftérica, metabolização de sacarose e produção de biofilme. Em conclusão, o estresse oxidativo foi capaz de influenciar fatores de virulência do C. diphtheriae, como a capacidade de produçao de biofilme, que podem estar contribuindo para a patogenia da difteria clássica assim como de doenças invasivas causadas por cepas atoxinogênicas.

Avaliação de novos processos de limpeza para quantificação de pireno em amostra de mexilhão

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) constituem um grupo de poluentes ambientais persistentes são moléculas com dois ou mais anéis aromáticos condensados, pouco solúveis em água e estão presentes no ambiente como resultante de processos naturais e também de atividades antrópicas; desta forma, os HPA podem ser encontrados em diversas matrizes ambientais. No presente trabalho foram utilizados mexilhões da região de Búzios, no Estado do Rio de Janeiro. Esse organismo foi selecionado devido à facilidade de acumulação de HPA nos tecidos, decorrente das propriedades hidrofóbicas dos HPA. O presente projeto teve como objetivo estudar um novo material de limpeza capaz de minimizar os compostos interferentes da matriz. Os cartuchos de SPE Florisil 5 g, são convencionalmente usados na limpeza de amostras de organismos, porém para diminuir os custos foram testados outros materiais adsorventes que pudessem ser eficientes na remoção dos interferentes presentes nos tecidos de mexilhão. Sendo assim, na etapa de limpeza conhecida como clean-up, foi estudada a recuperação do pireno após a extração por micro-ondas através de duas abordagens diferentes; a) utilização de cartuchos de SPE comerciais de 5 g de Florisil; b) cartuchos preenchidos com argila comercial K-10 bentonite, simulando os cartuchos comerciais. A recuperação e eficiência dos procedimentos de limpeza foram testadas e comparadas. A clean-up com argila K-10 apresentou uma recuperação de até 77% de pireno, sendo eficiente na remoção de compostos de colesteróis; confirmando a eficiência do material escolhido para a limpeza da amostra. A técnica de Cromatografia Gasosa e detecção por Espectrometria de Massas (GC-MS) foi aplicada para identificação e quantificação do contaminante pireno no extrato finaa

Propriedades adesivas a substratos abióticos e bióticos, invasão e indução de apoptose celular de Corynebacterium pseudodiphtheriticum

A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento.