Melatonina, isoenzimas de glutationa S-transferases e estresse oxidante em pacu Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887)

O oxigênio é fundamental para os vertebrados. No entanto, variações dos níveis de oxigênio na água podem provocar estresse oxidante em peixes porque privação de oxigênio seguida de reoxigenação forma espécies reativas de oxigênio (ERO) em células. Níveis intracelulares de ERO aumentados favorecem que moléculas de proteínas, fosfolipídios e ácidos nucleicos sofram alterações, vindo a prejudicar muitas funções celulares. No Pantanal, habitat do pacu, o nível de oxigênio varia circadianamente na água das lagoas rasas que acabam isoladas dos rios na seca. O pacu evoluiu sob a pressão contínua da exposição aos efeitos prejudiciais das ERO causados pelos pulsos de inundação. A melatonina, uma indolamina produzida na glândula pineal, influencia os níveis de atividade de enzimas antioxidantes que reduzem ERO, além de ser capaz de doar elétrons ou captar radicais livres de forma não enzimática. Os níveis de melatonina no pacu são mais altos no verão e menores no inverno. Isoenzimas de glutationa S-transferases que conjugam o tripetídeo glutationa com o 4-hidroxinonenal, aldeído derivado da peroxidação de ácidos graxos por ERO, são importantes para evitar alteração funcional de proteínas por ligação do 4-hidroxinonenal à sua estrutura. Neste trabalho procuramos relação entre estresse oxidante, níveis de atividades de glutationa S-transferase e melatonina, para estabelecer se a melatonina ajudaria pacus a superar os efeitos deletérios das espécies reativas de oxigênio. Ensaiamos atividades de isoenzimas de glutationa S-transferases no citosol de fígado de pacus mantidos em normoxia, hipoxia, reoxigenação e hiperoxia no inverno e no verão. Medimos o efeito da melatonina in vitro e in vivo sobre as atividades de isoenzimas de glutationa S-transferase. Medimos os efeitos do estresse oxidante sobre a ligação do 4-hidroxinonenal com proteínas nos fígados de pacus tratados com melatonina. Somente as isoenzimas que conjugam 4-hidroxinonenal com glutationa mostraram menor atividade no inverno em relação ao verão; outras isoenzimas de glutationa S-transferases não alteram suas atividades sazonalmente. In vitro a melatonina não alterou a atividade de isoenzimas de glutationa S-transferase que conjugam o 4-hidroxinonenal, mas inibiu outras isoenzimas de glutationa S-transferase. In vivo a melatonina aumentou a atividade encontrada no inverno das isoenzimas que conjugam o 4-hidroxinonenal para os níveis do verão. A ligação de 4-hidroxinonenal com proteínas foi menor em pacus inoculados com melatonina. Nossos resultados mostram que a melatonina pode influenciar os efeitos de ERO em fígado de pacus. Ficou claro que a melatonina do plasma mantém os níveis de atividade conjugadora de 4-hidroxinonenal do fígado em pacus e que a baixa produção de melatonina no inverno não é adequada para a conjugação do 4-hidroxinonenal em fígado de pacus.

Caracterização das estratégias ecofisiológicas de samambaias em resposta à inundação na restinga de Maricá, Rio de Janeiro, Brasil

As matas inundáveis e brejos presentes nas restingas desencadeiam uma série de processos que influenciam as características físico-químicas e biológicas do solo, levando as plantas a apresentarem mecanismos de aclimatação ou adaptação ao estresse da inundação, como alterações morfológicas e fisiológicas de forma a minimizar os efeitos da falta de oxigênio. Dentre as espécies vegetais de samambaias ocorrentes em ambientes inundáveis nas restingas, se destacam três espécies: Acrostichum danaeifolium Langsd. & Fisch., Blechnum serrulatum Rich. e Thelypteris interrupta (Willd.) K.Iwats. O objetivo deste trabalho é caracterizar os aspectos ecofisiológicos que os esporófitos dessas samambaias apresentam para sobreviver em ambientes de inundação na restinga de Maricá, estado do Rio de Janeiro. Neste sentido, foi determinada a caracterização física e química dos sítios de ocorrências destas samambaias, as variações foliares entre elas, espessura, densidade, massa por unidade de folha, teor de clorofilas e atributos quantitativos das células epidérmicas, além da quantificação e determinação à distribuição dos carboidratos. Para as variáveis dos vegetais foram feitas coletas na estação chuvosa e seca e para variáveis do solo na estação seca. Os sítios analisados se mostraram extremamente ácidos, de baixa fertilidade e com toxidez por macro e micro nutrientes, indicando que as samambaias apresentam tolerância a estes fatores. Na época chuvosa (inundação), as samambaias apresentaram queda na densidade foliar, acompanhada de um aumento de massa por unidade de folha. Esta habilidade de conseguir ganhar massa seca por área classifica todas as samambaias analisadas como tolerantes à inundação. Os altos valores de carboidratos solúveis nas folhas indicam aumento da degradação do amido foliar e o menor teor de carboidrato solúvel encontrado nos caules explicita a redução na respiração das raízes destas plantas sob anoxia/ hipoxia, para evitar a oxidação e o incremento do estoque de amido de reserva, elucidando estratégia de tolerância à inundação. A menor disponibilidade de água na estação seca afeta diretamente os atributos foliares diminuindo o índice estomático, a suculência e a massa por unidade de folha, no qual reflete na queda das concentrações de clorofilas. Os menores valores nas concentrações de clorofila têm influencia direta na presença de amidos foliar que são estocado e, alterando toda a dinâmica dos carboidratos nestas espécies. A análise do sítio onde cresce Acrostichum danaeifolium indica níveis críticos de Na no solo e provavelmente, a produção de mucilagem no caule e no pecíolo é uma estratégia de tolerância ao ambiente salino e inundado. O elevado índice de cobertura de Blechnum serrulatum em ambientes inundados indica que esta espécie possui adaptações a solos hidromórficos, entre elas, grande capacidade de estocagem de amido no caule. A maior sinuosidade das células epidérmicas em T. interrupta permite uma alta suculência mantendo o status hidrológico da folha em ambas as estações. Os resultados apresentados, além de agregar informações sobre a biologia das samambaias nos neotrópicos, irão contribuir para a compreensão da dinâmica de ocupação de espécies herbáceas em ambientes alagáveis nas restingas brasileiras

Alterações comportamentais e a análise do estresse oxidativo na idade adulta de animais expostos a hipóxia pré-natal

A Hipóxia-Isquêmica (HI) pré-natal é caracterizada por uma redução no aporte de oxigênio e nutrientes para o feto durante o período gestacional, que pode acarretar, a longo prazo, em dificuldade de concentração e aprendizagem, hiperatividade e déficit de memória. Esses prejuízos podem persistir ou se agravar até a idade adulta, levando ainda ao aparecimento de doenças como epilepsia e paralisia cerebral (PC). A privação de oxigênio e nutrientes, assim como o estresse materno, anemia, eclâmpsia e uso de drogas durante a gestação, podem causar estresse oxidativo durante os períodos críticos do desenvolvimento, e pode ser a principal razão para as mudanças que levam a programação fetal. O objetivo deste estudo foi relacionar a geração de espécies reativas e a consequente formação de estresse oxidativo nos animais adultos, com as alterações da biodisponibilidade do óxido nítrico de forma sistêmica, além de mudanças nos comportamentos motor e de ansiedade, manutenção da memória e aprendizado. Para a hipóxia, foi utilizado o modelo de clampeamento das artérias uterinas das ratas no 18 dia gestacional por 45 min, analisando os filhotes após 90 dias de nascidos. Foram utilizados os testes Open Field e labirinto em cruz elevada para a análise comportamental, e análises das enzimas glutationa peroxidase (GPx), superóxido desmutase (SOD) e catalase, além de quantificação de nitritos, TBARs e carbonilação de proteínas para avaliação de mecanismos oxidantes e antioxidantes. Os resultados demonstraram que o insulto durante a gestação pode acarretar em redução na formação da enzima GPx, além de maior concentração de nitritos analisados nos soros dos animais hipoxiados quando comparados aos controles, contribuindo para o dano oxidativo. Também foi observada redução na memória de habituação e comportamento motor, além de elevado comportamento ansioso em animais hipoxiados, diferentemente de controles. Concluímos assim que a hipóxia isquêmica pré-natal pode alterar permanentemente o estado oxidativo dos animais, além de atuar na formação do comportamento motor, memória de habituação e ansiedade. As descobertas aqui apresentadas contribuem para ampliar o entendimento acerca do evento de hipóxia isquêmica pré-natal, além de prover ferramentas para o desenvolvimento de mecanismos protetores e preventivos aos possíveis danos por ela causados.

Susceptibilidade de pacus, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887), sob hipoxia aos agrotóxicos organofosforados

A ação inibitória dos organofosforados sobre as esterases, por ser específica, pode ser empregada como um eficiente biomarcador da exposição de seres vivos aos organofosforados. A inibição da acetilcolinesterase (AChE; EC 3.1.1.7) provoca acúmulo do neurotransmissor acetilcolina nas fendas sinápticas colinérgicas, o que pode resultar na morte do indivíduo. Outra atividade também afetada por organofosforados é a da enzima carboxilesterase (CarbE; EC 3.1.1.1). CarbE estão envolvidas na fase I da biotransformação de xenobióticos e atuam como captadoras (scavengers) de organofosfatos, incluindo os formados pela biotransformação dos organofosforados. As CarbE estudadas até hoje se ligam com maior velocidade aos organofosfatos do que as colinesterases. Por isto se admite que CarbE possam diminuir, por captação estequiométrica, a ligação tóxica de moléculas de organofosfatos às acetilcolinesterases das sinapses colinérgicas e das placas motoras dos músculos. Experimentos realizados em nosso laboratório mostraram que a atividade da CarbE está aproximadamente 50% menor no soro e no fígado de pacus submetidos à hipoxia. Por causa disso, em razão de uma possível diminuição da capacidade captadora da CarbE, decidimos verificar se o pacu em hipoxia seria mais sensível aos agrotóxicos organofosforados. Para este propósito foram colocados seis pacus divididos em dois tanques. No primeiro tanque, os animais foram submetidos a 24 horas de hipoxia seguidos por mais 4 horas de exposição ao organofosforado metilparation em duas concentrações diferentes (0,02 ou 0,01 mg / L). No segundo tanque os animais permaneceram em normoxia durante o mesmo período de 24 horas e depois foram expostos ao metilparation como no primeiro tanque. As atividades da AChE ensaiada com acetiltiocolina, a da butirilcolinesterase (BChE) ensaiada com butiriltiocolina e a da CarbE ensaiada com p-nitrofenilacetato foram avaliadas no soro, fígado, cérebro, músculo e coração dos pacus. Houve redução de aproximadamente 35% da atividade de CarbE no soro dos pacus submetidos a 24 horas de hipoxia. Uma queda de 85% na atividade de CarbE do soro foi observada nos animais que sofreram hipoxia e subsequente exposição a 0,02 mg de metilparation por litro. Com metilparation a 0,01 mg/L a diminuição observada foi de 48,2%. No músculo dos pacus expostos a 0,02 mg/L, as atividades de AChE e BChE cairam pela metade quando os mesmos foram submetidos à hipoxia quando comparados a animais que permaneceram em normoxia. Nos diversos tecidos dos pacus expostos a 0,01 mg/L de metilparation não observamos diferenças significativas nas atividades de AChE, BChE ou CarbE. Concluímos que a duplicação da concentração de metilparation de 0,01 para 0,02 mg/L levou à atividade residual de CarbE do soro de 51,8% para 15%. A ausência de mudanças nas atividades das esterases dos tecidos de animais expostos a 0,01 mg/L entre os grupos hipoxia e normoxia deve ter ocorrido porque a concentração de organofosforado não foi suficiente para superar a primeira barreira de proteção das esterases séricas e atingir os tecidos. Mas, no experimento com 0,02 mg/L de metilparation, as inibições de AChE e de BChE no músculo dos animais em hipoxia podem ser explicadas pela diminuição da atividade de CarbE do soro dos pacus.

Corpo carotídeo e hipertensão: alterações celulares e da matriz extracelular

O aumento de doenças cardiovasculares possui como fator primordial e, mais comum, o aumento da pressão arterial (PA). Esta, pode gerar complicações em outros órgãos e acarretar diversas patologias, podendo levar a morte. A hipertensão é uma síndrome multifatorial, cuja maior incidência ocorre em indivíduos obesos, sedentários e consumidores em excesso de bebidas alcoólicas e sal. O corpo carotídeo (CC) é um órgão quimiorreceptor localizado na bifurcação da artéria carótida, formado de estruturas básicas chamadas glomus. Cada glomus carotídeo é constituído de células tipo 1 envoltas por células tipo 2 ou sustentaculares. Este trabalho teve como objetivo analisar as alterações morfofuncionais que ocorrem no CC, causada por hipertensão arterial induzida pelo L-NAME, um inibidor da enzima óxido nítrico sintase. Para isso, o estudo utilizou 20 ratos Wistar divididos em dois grupos: controle (C) e L-NAME (LN). Após a administração de 40mg/kg/dia de L-NAME por 45 dias, o CC foi coletado. Observou-se aumento significativo da pressão arterial a partir da segunda semana de administração de L-NAME. Análise quantitativa mostrou uma redução no número de núcleos do glomus carotídeo e o aumento na área total do órgão no grupo LN. Não foi encontrado diferença significativa no número de núcleos totais do corpo carotídeo entre os grupos. Na análise morfológica do grupo LN, observamos a formação de vacúolos nas células tipo 1 do glomus, bem como uma redução do número total de núcleos das células de cada glomus carotídeo. A análise qualitativa sugeriu um aumento no número de fibras colágenas e fibras do sistema elástico na matriz extracelular e grânulos no grupo LN. Imunomarcações com anticorpo anti VEGF e NF-kB e nNOS mostram-se aumentadas e dispersas por todo CC no grupo LN em relação ao grupo C. Além disso, marcações para Substância-P também foram observadas em maior quantidade nas células tipo 1 do grupo LN. Quanto à marcação para PGP 9.5, houve a redução desta marcação caracterizada dentro do glomus carotídeo grupo LN comparado ao grupo C. O estudo sugere que o corpo carotídeo, em resposta à hipertensão induzida pela inibição da enzima óxido nítrico sintase, gera mudanças morfofisiológicas semelhantes as encontradas em hipóxia.

Alterações em genes relacionados à via glicolítica em tumores de carcinoma epidermoide de esôfago

O carcinoma epidermoide de esôfago (CEE) representa 90% dos casos de câncer de esôfago no Brasil. O CEE tem detecção tardia, um comportamento extremamente agressivo e baixa sobrevida, sendo, portanto, um alvo interessante para o estudo dos mecanismos envolvidos em sua carcinogênese, a fim de se identificar possíveis alvos terapêuticos ou marcadores moleculares que ajudem na prática clínica. Mudanças no metabolismo energético da célula tumoral parecem ter papel de destaque na transformação maligna. Sabe-se que células tumorais consomem glicose avidamente produzindo ácido lático, mesmo em condições de normóxia. Dentre os fatores que podem contribuir para o estímulo da glicólise em células tumorais destacam-se as alterações em enzimas da via glicolítica tais como: as piruvato-cinases M1 e M2 (PKM1 e PKM2), a hexocinase II (HKII), isofoma 1 do transportador de glicose, GLUT-1, e o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF1α), responsável pela transcrição das proteínas citadas. O objetivo do estudo é avaliar a relação entre a expressão de HIF1α, HK2, PKM2, PKM1 e GLUT-1 e dados clínico-patológicos no CEE. Para tal, foram avaliados tumores conservados em parafina de 44 pacientes com CEE matriculados no INCA e no Hospital das Clínicas de Porto Alegre. Além disso, foram coletadas amostras de biópsia de esôfago em 67 pacientes sem doença esofágica, que foram submetidos à endoscopia no Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE). A expressão das proteínas foi avaliada nos tecidos por imuno-histoquímica, enquanto que a expressão do mRNA de GLUT-1 também foi avaliada nas amostras controle. Foi observado que as amostras controle expressam HK2, PKM1, PKM2, HIF1α nas camadas do epitélio esofágico. Já GLUT-1 e Ki-67 são vistos apenas na camada basal. Além disso, a expressão do mRNA de GLUT-1 não teve correlação com fatores etiológicos da doença. Em CEE a expressão de HK2, PKM2 e GLUT-1 foi vista em todos os tumores, já a expressão de HIF1α e PKM1 foi variável. Além disso, observou-se que maior expressão de HIF-1α apresenta correlação com invasão linfonodal e diferenciação, enquanto que a expressão de HK2 tem relação com sobrevida e PKM1 com diferenciação. As correlações clínicas encontradas sugerem que alterações no metabolismo energético é um alvo de estudo interessante para desenvolvimento de marcadores moleculares que auxiliem a prática clínica.

Efeitos da hipóxia-isquemia perinatal sobre o comportamento motor, distribuição da Tirosina Hidroxilase na substância negra e da NADPH diaforase no hipocampo durante o desenvolvimento em ratos

A hipóxia isquemia (HI) pré-natal é uma das principais causas de mortalidade e doenças neurológicas crônicas em neonatos, que podem apresentar déficits remanentes como: retardamento, paralisia cerebral, dificuldade de aprendizado ou epilepsia. Estes prejuízos, provavelmente, estão relacionados com o atraso no desenvolvimento neural, astrogliose e com a perda de neurônios e oligodendrócitos. Déficits funcionais e cognitivos estão associados à degeneração de vias dopaminérgicas e de estruturas hipocampais. A enzima tirosina hidroxilase (TH) é a enzima limitante na síntese de dopamina e seus níveis são alterados em eventos de HI. O óxido nítrico (NO) é um gás difusível que atua modulando diferentes sistemas, participando de eventos como plasticidade sináptica e neuromodulação no sistema nervoso central e é produzido em grandes quantidades em eventos de injúria e inflamação, como é o caso da HI. O presente estudo teve por objetivos avaliar, utilizando o modelo criado por Robinson e colaboradores em 2005, os efeitos da HI sobre o comportamento motor e avaliar o desenvolvimento de estruturas encefálicas relacionadas a este comportamento como a substância negra (SN) e o complexo hipocampal. A HI foi induzida a partir do clampeamento das artérias uterinas da rata grávida, por 45 minutos no décimo oitavo dia de gestação (grupo HI). Em um grupo de fêmeas a cirurgia foi realizada, mas não houve clampeamento das artérias (grupo SHAM). A avaliação do comportamento motor foi realizada com os testes ROTAROD e de campo aberto em animais de 45 dias. Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P9, P16, P23 e P90, sendo então realizada imunohistoquímica para TH e histoquímica para NADPH diaforase (NADPH-d), para avaliação do NO. Nossos resultados demonstraram redução da imunorreatividade para a TH em corpos celulares na SN aos 16 dias no grupo HI e aumento na imunorreatividade das fibras na parte reticulada aos 23 dias, com a presença de corpos celulares imunorreativos nesta região no grupo HI. Demonstramos também aumento do número de células marcadas para NADPH-d no giro dentado nos animais HI, nas idades analisadas, assim como aumento na intensidade de reação no corno de Ammon (CA1 e CA3) aos 9 dias no grupo HI, e posterior redução nesta marcação aos 23 e 90dias neste mesmo grupo. Nos testes comportamentais, observamos diminuição da atividade motora no grupo HI com uma melhora do desempenho ao longo dos testes no ROTAROD, sem entretanto atingir o mesmo nível do grupo SHAM. Os animais HI não apresentaram maior nível de ansiedade em relação ao grupo SHAM, descartando a hipótese das alterações observadas nos testes de motricidade estarem relacionadas a fatores ansiogênicos. O modelo de clampeamento das artérias uterinas da fêmea se mostrou uma ferramenta importante no estudo das alterações decorrentes do evento de HI pré-natal, por produzir diversos resultados que são similares aos ocorridos em neonatos que passam por este evento.

Efeitos da hipóxia-isquemia pré-natal durante o desenvolvimento: receptores e transportadores glutamatérgicos e comunicação celular in vitro

O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão.

Carboxilesterase como biomarcador de hipoxia em peixes

Quando as esterases acetilcolinesterase (AChE), butirilcolinesterase (BChE) e carboxilesterase (CarbE) hidrolisam ésteres de fosfato seus sítios ativos sofrem fosfatação inibitória. Por isto, tal fosfatação pode proteger seres vivos contra o espalhamento de xenobióticos organofosforados dentro de seus corpos, já que estas enzimas têm a capacidade de captar moléculas de pesticidas organofosforados estequiometricamente. Os organismos terrestres vivem em um ambiente com mais oxigênio do que os organismos aquáticos. Na água, quando o nível de oxigênio atinge aproximadamente 2,6 mg/L o ambiente está em hipoxia. Este fenômeno afeta ecossistemas aquáticos, uma vez que muitos organismos não conseguem se adaptar à baixa do oxigênio. Estudamos peixes em hipoxia e hiperoxia para entender melhor a bioquímica do funcionamento de suas enzimas captadoras de organofosforados quando eles estão expostos às variações físico-químicas de seus habitats. Dois grupos de no mínimo seis pacus (Piaractus mesopotamicus), seis peixes dourados (Carassius auratus auratus), seis tilápias (Oreochromis niloticus niloticus), seis piavussus (Leporinus macrocephalus), seis apaiaris (Astronotus ocellatus), ou seis carpas (Cyprinus carpio carpio) foram aclimatados à temperatura ambiente em dois aquários de 250 L. No primeiro aquário, pelo menos três animais ensaio de cada espécie sofreram hipoxia por diminuição da concentração de oxigênio até 0,5 mg/L através de borbulhamento de nitrogênio na água. Quando estes animais atingiram a hipoxia foram mantidos a 0,5 mg/L de oxigênio por 6, 8, 24 ou, no máximo, por 42 horas. Três peixes controle de cada espécie foram mantidos em normoxia (4,5 até 7,0 mg/L de oxigênio). Após estes tempos houve a retirada de cerca de 3,5 mL de sangue e dos fígados. Depois de coagular, o sangue foi centrifugado para retirada do soro sobrenadante, que foi usado como amostra para ensaios das esterases. Os fígados foram armazenados em freezer a -70 C e, no momento do ensaio, homogeneizados e centrifugados para obter as frações citosólica e microssomal. As atividades das esterases foram ensaiadas em espectrofotômetro com os substratos acetiltiocolina, butiriltiocolina ou p-nitrofenilacetato. As atividades sobre p-nitrofenilacetato (CarbE) do soro e do fígado sofreram queda em todos os exemplares das espécies submetidos à hipoxia. Tipicamente, esta atividade caiu cerca de 50% nos soros de pacus mantidos por 42 h sob concentrações de oxigênio abaixo de 1,0 mg/L. O tempo para que ocorresse a queda desta atividade enzimática variou de espécie para espécie.

Distribuição da caspase-3 clivada no cerebelo de ratos durante o desenvolvimento em um modelo de hipóxia-isquemia sistêmica pré-natal

A Hipóxia-isquemia (HI) perinatal é um problema de saúde pública, e ocorrem aproximadamente 1,5 casos de encefalopatias por HI por 1000 nascidos vivos. Dos que sobrevivem 25-60% sofrem de deficiências permanentes do desenvolvimento neurológico, incluindo paralisia cerebral, convulsões, retardo mental, e dificuldade de aprender. Neurônios e oligodendrócitos, especialmente os progenitores, são os mais afetados pela HI. Existem vários modelos de HI, no entanto, poucos levam em consideração as intercorrências maternas, a importância da atividade placentária, e as trocas entre mãe-filho, que são clinicamente observadas em humanos. Robinson estabeleceu um modelo de HI sistêmica pré-natal transitório, onde o fluxo das artérias uterinas da rata grávida era obstruído por 45 minutos no décimo oitavo dia (E18) de gestação. Neste modelo foram observadas alterações que são similares às observadas em cérebros humanos que passaram por hipóxia perinatal, dentre as quais foram relatados aumento no nível de apoptose. Caspase-3 é descrita como uma enzima que atua na apoptose, e é amplamente utilizada como marcador para células apoptóticas. Vários autores vêm mostrando, entretanto, que a enzima caspase-3 pode estar ativada para fins não apoptóticos. No modelo de HI sistêmica pré-natal, foram observados astrogliose na substância branca, morte de oligodendrócitos, lesão em axônios tanto na substância branca como no córtex cerebral, e danos motores. Pouco se sabe da influencia do insulto HI no desenvolvimento do cerebelo, considerando que o cerebelo junto com o córtex motor, contribui para o controle motor. O objetivo desse trabalho foi avaliar a distribuição da caspase-3 clivada durante o desenvolvimento do cerebelo em um modelo de HI pré-natal. Os resultados deste trabalho demonstram que as células caspase-3 clivadas apresentaram duas morfologias distintas em ambos os grupos. Uma onde a caspase-3 foi observada apenas no núcleo, oscilando entre células com imunorreatividade fraca a intensa, e de células com a presença da caspase-3 no corpo celular, nos prolongamentos condensados e presença de fragmentos ao redor do soma, morfologia típica de célula em apoptose. A HI pré-natal, assim como nos hemisférios cerebrais, levou ao aumento de células caspase-3 clivadas com morfologia de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo do grupo HI em P2, mas não em P9 e P23. Também foi demonstrado que a HI pré-natal não levou a uma ativação da apoptose em oligodendrócitos, neurônios e microglia (identificados por seus respectivos marcadores, CNPase, NeuN e ED1) apresentando marcação no núcleos de células GFAP+, na substância branca, camada granular e nas células da glia de Bergmann, em P9 e P23 no cerebelo. Podemos concluir que a HI pré-natal aumentou o número de células imunorreativas para a caspase-3 em um período crítico do desenvolvimento da oligodendroglia no cerebelo, e que a diminuição de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo decorrente do insulto pré-natal visto em trabalhos anteriores, pode estar relacionada a morte celular por apoptose, embora não se possa descartar a hipótese da participação dessas células que apresentam caspase-3 clivada em outros eventos não apoptóticos desencadeados pela hipóxia-isquemia.

Avaliação morfofuncional do complexo hipocampal em ratos submetidos a um modelo de hipóxia-isquemia pré-natal

A diminuição do aporte de oxigênio e nutrientes na vida perinatal resulta em danos, como astrogliose, morte de neurônios e de células proliferativas. Déficits cognitivos podem estar relacionados a danos no hipocampo. Neste trabalho avaliamos a citoarquitetura do giro dentado (DG) durante o desenvolvimento e a memória de ratos submetidos à HI. Para tal, utilizamos a técnica de imunohistoquímica para marcador de proliferação celular (KI67), neurônio jovem (DCX), de astrócitos (GFAP) e de óxido nítrico sintase neuronal (NOSn). Para avaliar a memória de curta e de longa duração foi utilizado o teste de reconhecimento de objetos (RO). Ratas Wistar grávidas em E18 foram anestesiadas (tribromoetanol) e as quatro artérias uterinas foram ocluídas com grampos de aneurisma (Grupo HI). Após 45 minutos, os grampos foram removidos e foi feita a sutura por planos anatômicos. Os animais do grupo controle (SHAM) sofreram o mesmo procedimento, excetuando a oclusão das artérias. Os animais nasceram a termo. Animais com idades de 7 a 90 dias pós-natal (P7 a P90), foram anestesiados e perfundido-fixados com paraformaldeído a 4%, e os encéfalos submetidos ao processamento histológico. Cortes coronais do hipocampo (20m) foram submetidos à imunohistoquímica para KI67, DCX, GFAP e NOSn. Animais P90 foram submetidos ao RO. Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética (CEA/019/2010). Observamos menor imunomarcação para KI67 no giro dentado de animais HI em P7. Para a marcação de DCX nesta idade não foi observada diferença entre os grupos. Animais HI em P15, P20 e P45 tiveram menor imunomarcação para DCX e Ki67 na camada granular. Animais P90 de ambos os grupos não apresentaram marcação para KI67 e DCX. Vimos aumento da imunomarcação para GFAP nos animais HI em todas as idades. A imunomarcação para NOSn nos animais HI foi menor em todas as idades. O maior número de células NOSn positivas foi visto em animais P7 em ambos os grupos na camada polimórfica. Em P15, animais HI apresentam células NOSn+ em todo o DG. Em P30 animais HI apresentam células NOSn+ nas camadas polimórfica e sub-granular. Animais adultos (P90) de ambos os grupos apresentam células NOSn positivas apenas nas camadas granular e sub-granular. Embora animais HI P90 não apresentaram déficits de memória, estes apresentaram menor tempo de exploração do objeto. Comportamento correspondente a déficits de atenção em humanos. Nossos resultados sugerem que HI perinatal diminui a população de células proliferativas, de neurônios jovens, de neurônios NOSn+, além de causar astrogliose e possivelmente déficits de atenção. O modelo demonstrou ser útil para a compreensão dos mecanismos celulares das lesões hipóxico-isquêmicas e pode ser usado para testar estratégias terapêuticas.

Enzimas antioxidantes em sangue de peixes expostos à hipoxia e hiperoxia

O oxigênio é importante não só por sua participação no metabolismo energético, mas também por sua conversão em derivados parcialmente reduzidos, as espécies reativas de oxigênio (ERO). ERO participam de funções importantes em diversas vias do metabolismo, entretanto, em concentrações desequilibradamente elevadas deflagram a peroxidação lipídica, processo deletério que forma aldeídos tóxicos, como o 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE). A manutenção de concentrações não deletérias das ERO é realizada por moléculas componentes do sistema antioxidante. Peixes podem ser expostos a grandes variações das concentrações de oxigênio, o que provoca ciclos oxidantes. A maioria dos estudos usa fígado e rim para avaliar estresse oxidante por meio de ensaios das atividades antioxidantes, o que requer o sacrifício dos animais. Contudo, o sangue sofre efeitos das ERO e avaliações no sangue podem permitir o estudo de antioxidantes no mesmo animal, sem a necessidade de sacrifício. Em consequência, foram nossos objetivos estabelecer uma técnica de cateterismo branquial em peixes, a padronização dos ensaios e a avaliação em sangue de componentes do sistema antioxidante de duas espécies de teleósteos em diferentes tensões de oxigênio. Pacus e tilápias foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1 e em hipoxia a 0,5 mg de O2.L-1 por 42 horas . Para os ensaios de hiperoxia os animais foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1, depois de 6 horas em 9,5 mg de O2.L-1 e depois de 30 horas de recuperação a 6,0 mg de O2.L-1. A utilização de materiais para o cateterismo de humanos permitiu a implantação de um acesso branquial. Infelizmente, houve formação de trombo após 24 horas. Mesmo assim, a observação de fluxo sanguíneo no interior da cânula e a sobrevida dos animais testados, confirmam a viabilidade da técnica. Verificamos em sangue uma maior atividade da enzima glutationa S-transferase (GST) sobre o 4-HNE em relação ao 1-cloro-2-dinitrobenzeno (CDNB). Isto reflete a importância de avaliações de atividade de enzimas, como a GST, sobre substratos endógenos. As respostas enzimáticas de tilápias mostraram-se mais sensíveis que as dos pacus quando comparadas em diferentes tensões de oxigênio.

Associação entre o consumo de oxigênio e as alterações na microcirculação de pacientes pediátricos com choque séptico

Choque séptico é caracterizado por desequilíbrio entre o transporte e o consumo de oxigênio, podendo acarretar hipóxia tecidual. A disfunção microcirculatória, característica cardinal da fisiopatologia do choque séptico, causa má distribuição de fluxo sanguíneo microvascular e, consequentemente, shunt de oxigênio, disóxia tissular e, teoricamente, diminuição no consumo de oxigênio (VO2) pela célula. No presente estudo, foi investigada a associação entre alterações microcirculatórias causadas pela sepse e o consumo de oxigênio em pacientes pediátricos. Dezessete crianças com choque séptico ressuscitadas foram estudadas em quatro momentos durante a internação na unidade de terapia intensiva (dentro de 24, 48 e 72 horas após a admissão ou diagnóstico de choque e após a resolução deste, antes da extubação traqueal). A microcirculação sublingual foi avaliada utilizando o método de imagem Sidestream dark field (SDF) e o VO2 foi calculado através da calorimetria indireta. Outras variáveis hemodinâmicas, como transporte de oxigênio, índice cardíaco, pressão arterial invasiva, lactato arterial e saturação venosa central, foram coletadas. Embora as variáveis hemodinâmicas tenham se mantido em níveis satisfatórios, graves alterações na microcirculação foram visualizadas, especialmente na densidade de vasos pequenos perfundidos (DVPP), na proporção de vasos pequenos perfundidos (PVPP) e no índice de fluxo microvascular (MFI). Foram encontradas assosciações significativas entre o VO2 e os parâmetros da microcirculação: dVO2 e dDVPP (β coefficient= 6,875; p<0,001), dVO2 e dPVPP (β coefficient=92,246; p<0,001) e dVO2 e dMFI (β coefficient=21,213; p<0,001). Não foram encontradas correlações entre as alterações microcirculatórias e as outras variáveis. Em conclusão, este estudo mostrou que pacientes pediátricos com choque séptico apresentaram grave disfunção microvascular e que o fluxo microcirculatório alterado estava associado ao VO2, podendo estar implicado na fisiopatologia da disóxia tecidual da sepse.

Carboxilesterase na adaptação do metabolismo de lipídios do pacu à hipoxia

Os peixes são vertebrados que vivem em vários habitats. Adaptações de sua fisiologia e de sua bioquímica são estudadas para entender como conseguem sobreviver aos desafios presentes em cada ambiente. A diminuição da concentração de oxigênio dissolvido na água é um fenômeno natural cíclico em águas do Pantanal e da Amazônia. A crescente poluição antrópica dos rios da Amazônia e do Pantanal pode, somada à hipoxia, oferecer ameaça à permanência de muitas espécies de peixes. Ao estudarmos a carboxilesterase (CarbE), enzima importante para a biotransformação de xenobióticos, observamos que sua atividade diminuía em plasma de pacu, um peixe típico do Pantanal, mantido em hipoxia durante 42 horas. As carboxilesterases participam de inúmeras reações químicas no organismo, incluindo uma transesterificação capaz de produzir ésteres etílicos tóxicos de ácido graxo (FAEE, fatty acid ethyl esters) a partir de etanol e ésteres de ácidos graxos. Já que a diminuição da atividade de CarbE poderia ser uma vantagem, pois que o etanol (um produto da glicólise em peixes sob hipoxia) seria menos esterificado, resolvemos saber mais sobre a bioquímica da CarbE do plasma e do fígado de pacus. Os pacus foram submetidos à hipoxia por diminuição da concentração até 0,5 mg O2/L por meio de borbulhamento de nitrogênio na água. Os animais ficaram nessas condições por 42 horas, quando então coletamos sangue e retiramos seus fígados. A atividade de CarbE ensaiada foi 50% menor no soro e 25% menor nos microssomos de fígado se comparada com a de peixes sob 6 mg O2/L. A CarbE isolada do soro dos pacus em normoxia possui massa molecular relativa de 56.000. A eletroforese em gel desnaturante com a fração purificada rendeu três bandas, mas o gel nativo apresentou só duas bandas com atividades sobre α-naftil acetato. Inferimos que mais do que uma isoforma da enzima está no plasma dos pacus. A CarbE isolada do soro não possui atividade de lipase sobre o Tween 20, mas os microssomos dos fígados dos animais em normoxia e hipoxia possuem. No entanto, a CarbE possui atividade sobre acil-CoA assim como o microssomo de fígado. A enzima pura apresenta Vmáx três vezes maior e uma KM quatro vezes maior do que a atividade presente nos microssomos. Além disso, os microssomos do fígado dos pacus em normoxia podem hidrolisar acil-CoA com o dobro da velocidade daqueles em hipoxia. A atividade clássica de CarbE do soro foi inibida por 4-HNE a 4 mM. A atividade de acil-CoA dos microssomos de fígado também foi sensível a 4-HNE a 4 mM, enquanto 2 mM de 4-HNE inibiu metade desta atividade do soro.