Estudo fenotípico e molecular de resistência aos antimicrobianos em amostras clínicas e ambientais de enterobactérias

Buscamos detectar evidências da presença de genes envolvidos na produção de Enzimas Modificadoras de Aminoglicosídeos (EMAs), Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e Mecanismos Plasmidiais de Resistência a Quinolonas (PMQRs) em cepas de K. pneumoniae, K. ozaenae e E. coli isoladas de amostras de água de rios afluentes da Baía de Guanabara e de materiais clínicos de origem hospitalar, além de avaliar o "status sanitário" dos corpos aquáticos abordados no tocante à contaminação fecal recente e indicações de contaminação hospitalar e por outros ambientes de alta seletividade. As cepas de materiais clínicos foram selecionadas entre Maio e Julho de 2010, a partir da semeadura em meio de cultura contendo 8g/mL de gentamicina. As amostras de água foram coletadas em Abril e em Julho de 2009. Realizamos testes de colimetria, empregando para tal, a metodologia convencional e outra, na qual adicionamos 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina aos caldos Lactosado e Escherichia coli (caldo EC), a fim de detectar e quantificar coliformes resistentes. Para o isolamento das cepas empregamos meios de cultura contendo 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina. As cepas foram identificadas e submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos (TSA), testes presuntivos para presença de ESBLs, extração de DNA plasmidial e ensaios de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para a detecção dos genes. A utilização de agentes antimicrobianos nos testes de colimetria nos permitiu detectar a presença e quantificar coliformes totais e fecais resistentes nas amostras de água analisadas nos diferentes pontos. O TSA das cepas isoladas de amostras de água exibiu perfis de multirresistência, compatíveis com o de bactérias de origem hospitalar, semelhante ao encontrado nas cepas isoladas de materiais clínicos. Todas as cepas isoladas de amostras de água e 90% das cepas de materiais clínicos apresentaram pelo menos uma banda plasmidial. Os ensaios de PCR evidenciaram a presença de produtos de amplificação para EMAs, ESBLs e PMQRs, sendo que 7,4% das cepas de amostras de água e 20% das cepas de materiais clínicos apresentaram produtos de amplificação para as três classes de antimicrobianos. A realização de testes de colimetria empregando antimicrobianos, como gentamicina e cefalotina, pode ser uma ferramenta adicional importante ao teste convencional, quando o interesse for, o monitoramento e a prevenção de contaminação ambiental, especialmente associada a microrganismos carreando genes de resistência. O uso criterioso de antimicrobianos em atividades de cunho hospitalar e veterinário e medidas no sentido de prevenção de lançamento de esgoto e/ou tratamento dos efluentes, são fundamentais para o controle da disseminação de elementos genéticos de resistência transferíveis entre os microrganismos. A detecção e identificação de microrganismos apresentando elementos de resistência em ambiente extra-hospitalar como em água e solo, em particular, o emprego de testes de colimetria empregando antimicrobianos, se faz necessária, como forma de prevenção e controle de disseminação destes microrganismos com potencial de causar infecções em humanos e outros animais que eventualmente entram em contato com estes ambientes.

Avaliação de diferentes estratégias de biorremediação no tratamento de solo contaminado por diesel B5

No Brasil, a contaminação do solo por derramamentos de combustíveis representa um dos mais graves problemas ambientais e o impacto da introdução de novas misturas como diesel/biodiesel na matriz energética requer investigação quanto a tecnologias apropriadas de remediação. O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes estratégias de biorremediação no tratamento de solo contaminado experimentalmente com óleo diesel B5. Foram conduzidos três experimentos. No primeiro, quatro microcosmos em duplicata, contendo 500 g de solo e 5% (p/p) de óleo diesel B5, todos suplementados com oxigênio através de revolvimento manual e com ajuste de umidade, tiveram como tratamentos: bioestímulo com ajuste de pH (BE1); bioestímulo com ajuste de pH e nutrientes (BE2); bioaumento com ajuste de pH, nutrientes e adição de consórcio microbiano comercial KMA (BAM) e; controle abiótico, com ajuste de pH e solo esterilizado em autoclave (PA). Paralelamente, foi conduzido tratamento por bioaumento com ajuste de pH e nutrientes, suplementação de oxigênio e consórcio KMA, em solo contaminado apenas por diesel a 5% (BAD). A população microbiana foi monitorada através da contagem de UFC e os tratamentos, avaliados pela remoção de carbono orgânico e de hidrocarbonetos de petróleo (n-alcanos C10-C36). No segundo experimento, o metabolismo microbiano aeróbio foi avaliado através da produção de CO2 em respirômetros de Bartha (triplicatas), em solo contaminado com 5% (p/p) de óleo diesel B5, ajustado para pH e umidade, nas seguintes condições: solo com adição do consórcio KMA; solo com adição de cultura microbiana obtida a partir de outro solo proveniente de um posto de combustível com histórico de vazamento de tanques (RES) e; solo esterilizado por adição de azida de sódio a 0,3% (p/p). Como controle, solo sem contaminação, com sua população microbiana autóctone. No terceiro experimento, a capacidade da microbiota autóctone (EX), assim como do consórcio KMA e da cultura RES, em biodegradar óleo diesel B5, diesel e biodiesel de soja foi testada através do uso de indicadores de oxirredução DCPIP e TTC. Os experimentos em microcosmos indicam que houve uma complementaridade metabólica entre a população nativa e o consórcio comercial de microorganismos KMA, cuja presença promoveu um decaimento mais rápido de n-alcanos nas primeiras semanas do experimento. No entanto, após 63 dias de experimento, os tratamentos BAM, BAD e BE2 apresentaram, respectivamente, em média, 92,7%, 89,4% e 81,7% de remoção dos hidrocarbonetos n-alcanos C10-C36, sendo tais diferenças, sem significância estatística. Nos respirômetros, o bioaumento com cultura microbiana RES apresentou a maior produção de CO2 e a maior remoção de hidrocarbonetos (46,2%) após 29 dias. Tanto nos ensaios em microcosmos quanto nos respirométricos, não foi possível estimar a contribuição dos processos abióticos, tendo em vista evidências da existência de atividade microbiana no solo esterilizado térmica ou quimicamente. Os ensaios com os dois indicadores redox mostraram que apenas a microbiota nativa do solo em estudo e a cultura microbiana RES apresentaram potencial para degradar óleo diesel B5, biodiesel de soja ou diesel, quando colocadas em meio mineral contendo tais combustíveis como única fonte de carbono.

Estudo em Escala Piloto de Parâmetros de Monitoramento e Operação de Biopilhas no Tratamento de Solos Contaminados por Hidrocarbonetos de Petróleo

O objetivo do trabalho foi identificar ferramentas e indicadores adequados ao monitoramento e à otimização de processos de biorremediação, incluindo parâmetros físicos, químicos e microbiológicos definidos em estudos de tratabilidade de solos contaminados por óleo cru em escala de laboratório e comparar estratégias de biorremediação, tais como bioestímulo e bioaumento conduzidas em simulações de biopilhas dinâmicas ou estáticas. Quando três métodos de extração de hidrocarbonetos de petróleo de solo arenoso e franco-argiloso para análise cromatográfica (Soxhlet-SOX, microondas-MARS e extração acelerada por solvente-ASE) foram comparados entre si, concluiu-se que a técnica que promove a melhor recuperação depende da fração de interesse (n-alcanos, HRP, MCNR, HPA), das características texturais do solo (teores de areia, silte e argila) e da idade da contaminação. Dentre os indicadores de densidade populacional microbiana (microrganismos heterotróficos totais-PHT, população de fungos-PF e população microbiana degradadora de óleo (PDO) passíveis de utilização para indicar a taxa de degradação de compostos orgânicos presentes no solo tais como os hidrocarbonetos de petróleo, o PDO mostrou-se o mais adequado em conjunto com a produção de CO2 aferida pelo método respirométrico. Quando a estratégia de biorremediação de solo franco-argiloso contaminado com óleo cru a 3% (m m-1) utilizando bioestímulo (ajuste de pH, umidade e taxa C:N:P) foi comparada ao bioaumento (bioestímulo e adição de inóculo de microrganismos extraídos, enriquecidos e aclimatizados ao óleo cru como fonte de carbono), em sistemas de bancada simulando biopilha dinâmica (microcosmo M) e biopilha estática com aeração forçada (reator B), o tratamento que apresentou melhor remoção (32%) de HTP após 121 dias foi o bioaumento em biopilha estática. Para HPA, o tratamento que alcançou a melhor remoção (33%) foi com bioestímulo também em biopilha estática. A avaliação da taxa de mortalidade (%) de Eisenia andrei exposta tanto a solos recém-contaminados por óleo cru e preparados para bioestímulo (BIOS) e bioaumento (BIOA) a serem tratados em biopilhas dinâmicas e estáticas em escala de laboratório mostrou que após 56 dias de exposição da E. andrei, todos os solos produziram letalidade de 100%, quer fossem os solos recém-contaminados e preparados para os diferentes tratamentos (BIOS M, BIOS B, BIOA M, BIOA B) ou após 121 dias de tratamento. Tal resultado confirma que a biorremediação foi incipiente também do ponto de vista de remoção da ecotoxicidade. Em linhas gerais, a biorremediação de solo franco-argiloso contaminado por óleo cru, contendo tanto contaminação antiga quanto recente, reúne os maiores desafios à biorremediação, tanto do ponto de vista da composição textural do solo quanto da natureza do contaminante. Os processos são aparentemente lentos e requerem ferramentas auxiliares para aceleração dos mesmos. Recomenda-se no futuro, condução de experimentos com o uso de diferentes surfactantes, com ênfase em biosurfactantes