Produção de carotenoides em culturas in vitro de Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae) e avaliação de sua toxicidade e potencial antioxidante

A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 μM, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de β-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 μg.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de β-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro.

Neurotoxicidade de pesticidas organofosforados durante o desenvolvimento: alterações bioquímicas e comportamentais

Pesticidas organofosforados são amplamente usados e seu uso constitui um grave problema de saúde pública. A ação clássica destes compostos é a inibição irreversível da acetilcolinesterase, promovendo acúmulo de acetilcolina nas sinapses e hiperestimulação colinérgica. No entanto, as consequências da exposição a baixas doses podem se estender a outros mecanismos de ação e sistemas neurotransmissores. Considerando que crianças constituem um grupo particularmente vulnerável aos efeitos de pesticidas, neste trabalho investigamos os efeitos da exposição aos organofosforados metamidofós (MET) e clorpirifós (CPF) durante o desenvolvimento sobre os sistemas colinérgico e serotoninérgico e sobre o comportamento de camundongos. Para isso, camundongos suíços foram expostos a injeções subcutâneas de MET, clorpirifós ou veículo do terceiro (PN3) ao nono (PN9) dias de vida pós-natal. As doses de exposição foram previamente escolhidas através da construção de uma curva dose-resposta que identificou como mais adequadas para este estudo as doses de 1mg/kg de MET e 3mg/kg de CPF, as quais promoveram em torno de 20% de inibição da acetilcolinesterase. Em PN10, parte dos animais foi sacrificada e foram avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico no tronco encefálico e córtex cerebral. De PN60 a PN63, os animais foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais. Em seguida, estes animais também foram sacrificados tendo sido avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico. Em PN10, MET e CPF causaram alterações que sugerem aumento da atividade colinérgica respectivamente no tronco e córtex em fêmeas. No sistema serotoninérgico, apenas CPF promoveu alterações, aumentando a ligação ao receptor 5HT1A e transportador 5HT em fêmeas e diminuindo na ligação ao 5HT2. Em PN63, a atividade da acetilcolinesterase foi reestabelecida em todos os grupos. Ainda assim, MET diminuiu a atividade da colina acetiltransferase no córtex e a ligação ao transportador colinérgico no tronco. Quanto aos efeitos do CPF, no tronco, houve redução da atividade da colina acetiltransferase em fêmeas e aumento em machos. Sobre o sistema serotoninérgico, MET e CPF promoveram diminuições no 5HT1A respectivamente no tronco e córtex das fêmeas e CPF aumentou a ligação no córtex de machos. A ligação ao 5HT2 foi aumentada após o tratamento com MET e ao transportador 5HT foi diminuída em fêmeas após o tratamento com clorpirifós. Sobre o comportamento, identificamos comportamento associado à depressão em animais expostos a MET e aumento dos níveis de ansiedade, além de prejuízo de aprendizado/memória após exposição à CPF. Desta forma, nossos resultados indicam que a exposição à metamidofós e clorpirifós durante o desenvolvimento é capaz de alterar, de diferentes formas, a atividade colinérgica e serotoninérgica, mesmo que as doses de exposição sejam toxicologicamente equivalentes. Foram verificados efeitos nas vias neuroquímicas logo após a exposição e após um longo período de interrupção do tratamento, indicando efeitos tardios em sistemas importantes que podem estar associados às alterações comportamentais. Finalmente, o presente estudo reforça a associação epidemiológica entre pesticidas e alterações psiquiátricas e a capacidade da programação de alterações a longo-prazo quando a exposição se dá durante o desenvolvimento.

Avaliação de alterações morfológicas da pele após lesão radioinduzida em ratos Wistar

A radioterapia é uma das modalidades terapêuticas mais utilizadas no tratamento do câncer, visando à destruição das células neoplásicas, a partir da utilização de radiação ionizante. Um dos fatores limitantes da radioterapia é o dano em tecidos sadios vizinhos ao tumor. A irradiação da pele, acidental ou para fins terapêuticos, pode desencadear uma série de lesões culminando na fibrose, o que implica na alteração funcional deste órgão. A avaliação dos efeitos morfológicos associados à irradiação da pele torna-se fundamental para estabelecer estratégias de irradiação mais eficazes e diminuição da morbidade; e em caso de acidentes, adequado manuseio da vítima. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações dérmicas radioinduzidas, utilizando um modelo em ratos. Ratos Wistar, machos, com três meses de idade, tiveram sua pele irradiada, em um campo de 3cm2, com doses únicas de 10, 40 e 60 Gy de elétrons com energia nominal de 4MeV. Após a irradiação, os animais permaneceram sob avaliação constante, sendo as lesões registradas fotograficamente. Os animais foram divididos em grupos e eutanasiados: no dia da irradiação, 5, 10, 15, 25 e 100 dias após a irradiação. Parte da pele foi fixada em formaldeído, incluída em parafina e submetida à microtomia. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina, picrosirius red e imunomarcados com anticorpo anti-TGF-beta1. Outra parte do tecido foi fixada em glutaraldeido e processada para microscopia eletrônica de varredura. Foi observado macroscopicamente o surgimento de lesões cutâneas semelhantes a queimaduras em toda área irradiada. Ao microscópio óptico foi verificado o inicio de desenvolvimento de lesão 5 dias após irradiação. Decorridos 10 dias da irradiação observou-se indícios de cicatrização epidérmica abaixo da crosta formada pela lesão. Aos 15 dias após a irradiação o tecido abaixo da lesão apresentava epiderme reconstruída e características de cicatrização tecidual. Foi visualizado também um infiltrado de polimorfonucleares significativo. Após 25 dias nas doses mais elevadas as lesões persistiam, o que não ocorreu na menor dose, na qual a área irradiada dos animais já se encontrava completamente cicatrizada. Após 100 dias da irradiação na dose de 40 Gy ocorreu a cicatrização da ferida. Na dose de 60 Gy em alguns animais a lesão persistia. Nos animais em que ocorreu a cicatrização houve uma hipertrofia da epiderme (acantose). Foi visualizado um tecido com aspecto morfológico totalmente descaracterizado, e necrosado. Os resultados encontrados na analise através de microscopia eletrônica de varredura corroboram os dados encontrados na microscopia de luz, onde observou-se a descaracterização das fibras de colágeno nas doses mais elevadas. Os resultados indicam que as doses utilizadas induziram um processo inflamatório importante na pele, ativando o sistema imunológico. Este fato promoveu um aumento na expressão do TGFbeta1, um dos responsáveis pelo aumento da produção da matriz extracelular por vários tipos celulares, principalmente por fibroblastos em tecidos lesionados. Alem do aumento de expressão da MEC, o TGFbeta1 também promove a inibição dos processos de degradação da mesma. A intensa expressão desta citocina na pele irradiada pode desencadear o processo de fibrose e, conseqüentemente, afetar a homeostase deste órgão devido ao acúmulo da MEC.

O papel do óleo de peixe na via L-arginina-óxido nítrico e no estresse oxidativo em eritrócitos: um estudo dose-resposta

Os ácidos graxos poli-insaturados n-3 derivados do óleo de peixe estão associados a benefícios cardiovasculares, que podem ser decorrentes da ativação da óxido nítrico sintase (NOS). Assim como as células endoteliais, os eritrócitos possuem NOS endotelial (eNOS) e induzível (iNOS) e, portanto, são capazes de sintetizar óxido nítrico (NO). O presente estudo testou a capacidade que diferentes concentrações de óleo de peixe tem de ativar a via L-arginina-NO e, em seguida, alterar os níveis de guanosina monofosfato cíclica (GMPc) em eritrócitos de camundongos alimentados com dieta hiperlipídica. Além disso, foram analisados os marcadores de estresse oxidativo nos eritrócitos, objetivando investigar a biodisponibilidade do NO. O transporte de L-arginina, avaliado através da incubação com L-[3H]-arginina, mostrou-se ativado quando da administração de dietas contendo elevadas concentrações de óleo de peixe, em comparação com as dietas contendo baixas concentrações e controle. A atividade da NOS, medida pela conversão de L-[3H]-arginina em L-[3H]-citrulina, e a expressão da eNOS também aumentaram nos animais que se alimentaram com dietas ricas em óleo de peixe. Apesar da ativação da via L-arginina-óxido nítrico observada em nossos experimentos, os níveis de GMPc intraeritrocitário não foram afetados. O dano oxidativo nos eritrócitos aumentou linearmente conforme o óleo de peixe era acrescido na dieta, sem afetar a atividade das enzimas antioxidantes. Além do endotélio, os eritrócitos contribuem para o metabolismo do NO. Desta forma, a ativação da via L-arginina-NO nessas células pode ser benéfica para saúde cardiovascular. Estudos futuros poderão investigar outros marcadores de estresse oxidativo durante o consumo de óleo de peixe para assegurar que o seu uso não resulta em efeitos prejudiciais secundários e para garantir a biodisponibilidade de NO.

Efeito do treinamento físico intenso e da dose única de polifenóis sobre indicadores cardiometabólicos em militares fisicamente condicionados

O exercício físico pode promover o desequilíbrio oxidativo e na secreção e ação das adipocinas, leptina e adiponectina, que desempenham papel fundamental no desenvolvimento de doenças cardiometabólicas, incluindo a síndrome metabólica, disfunção endotelial, desordens inflamatórias e vasculares. Militares são submetidos a exercícios físicos intensos e podem apresentar maior risco de doenças cardiovasculares. A identificação de parâmetros capazes de detectar o risco cardiovascular precoce em grupos muito ativos fisicamente é complexa. A razão leptina/adiponectina (L/A) e a concentração de LDL eletronegativa (LDL (-)) vem sendo considerados bons indicadores de risco cardiovascular precoce porém não há estudos que investiguem a utilidade destes marcadores em militares. Os polifenóis, presentes na uva (Vitis vinífera), apresentam efeitos cardioprotetores como inibição da oxidação das lipoproteínas e controle glicêmico. Na presente tese objetivou-se identificar o risco cardiovascular em jovens militares altamente treinados, utilizando diferentes parâmetros, incluindo a razão L/A e investigar a influência do exercício militar e do uso de dose única de Vitis vinifera sobre parâmetros cardiometabólicos de militares fisicamente treinados. O primeiro estudo contou com a participação de 54 militares d gênero masculino, condicionados fisicamente, após descanso de 24h. No segundo estudo, participaram 54 militares do gênero masculino distribuídos aleatoriamente, de forma duplo-cego, para receber única dose contendo 200 mg de extrato seco de Vitis vinifera (GS, n = 27) ou 200 mg de placebo (amido) (GP, n = 27). Considerados em conjunto, os resultados sugerem que militares treinados poderiam ser classificados como limítrofes quanto ao risco cardiovascular, quando somente o perfil lipídico é empregado como marcador. As medidas de CC e CC/E são parâmetros de fácil obtenção e podem ser empregados na identificação do potencial risco cardiovascular, enquanto outros estudos não confirmam a eficácia da razão L/A para este fim. A comparação das concentrações plasmáticas de adiponectina e leptina apresentou diferença significativa apenas intragrupo para ambos os grupos. As concentrações plasmáticas das adipocinas foram influenciadas pelo treinamento. Os indicadores de homeostase glicêmica, glicemia de jejum e insulina plasmática, foram semelhantes entre os grupos, não sendo sendo influenciada pelo treinamento ou suplementação. A suplementação de polifenóis reduziu as concentrações de LDL(-) do GS em relação ao GP em T24h e T48h (p<0,05). Estes achados sugerem que o treinamento físico afeta a secreção das adipocinas independentemente do uso da Vitis vinífera. Entretanto, a dose única de polifenóis pode reduzir o risco cardiometabólico proveniente da oxidação da LDL (-)

Dose terapêutica de radiação ionizante induz um fenótipo migratório em células de carcinoma de colon humano (caco-2): vias de sinalização envolvidas

O câncer colo-retal é a terceira neoplasia mais frequente em todo o mundo e a recorrência local e neoplasia refratária são desafios no tratamento do câncer colo-retal após a cirurgia convencional. Com o intuito de controlar a recorrência e aumentar a média de sobrevida dos pacientes, uma estratégia multidisciplinar que combina a radioterapia (RT) e a quimioterapia com o processo cirúrgico tem sido protocolo clínico de escolha. Embora esta combinação seja capaz de otimizar o tratamento, nem todos os pacientes são beneficiados com o protocolo quimio-rádio combinado, uma vez que existem os insucessos terapêuticos relacionados com a incidência de neoplasias secundárias tardias em pacientes que foram submetidos à RT para tratamento de neoplasias anteriores. Além da doença refratária, outro agravante da RT são os efeitos colaterais produzidos pela radiação ionizante (IR), em especial àqueles do trato gastrointestinal. Estes efeitos estão relacionados com alterações da homeostase do epitélio intestinal, através da desorganização dos complexos juncionais. Porém, os mecanismos que medeiam estes efeitos ainda não estão elucidados. Este estudo avaliou as vias de sinalização que medeiam os efeitos da IR em células Caco-2. Foi observado que a IR causa uma desorganização da junção aderente via Src, EGFR e MAPK, sendo estas alterações acompanhadas por desorganização do citoesqueleto de actina em todo o volume celular. Src, EGFR e MAPK participam de maneira diferenciada na modulação destes efeitos. Observamos também que a radiação aumenta a motilidade dessas células via Src e MAPK e não induz alteração na proliferação celular até 48 horas após o tratamento. Este é o primeiro trabalho que correlaciona vias de sobrevivência celular como Src, EGFR e MAPK com alterações nas proteínas de junção aderente, alterações do citoesqueleto e migração celular. Estes eventos são relacionados aos efeitos colaterais primários e tardios induzidos pela IR, e podem favorecer à aquisição de um fenótipo maligno herdável durante o fracionamento de doses na RT, favorecendo a progressão tumoral do câncer colo-retal. Logo, além da correlação das vias de sinalização envolvidas nos eventos induzidos pela IR mostrados neste estudo, os resultados também corroboram para um melhor entendimento da atividade farmacológica dos inibidores químicos utilizados, uma vez que muitos deles encontram-se em fase de ensaios pré-clínicos e clínicos.