Análise proteômica comparativa dos componentes da superfície celular e do secretoma de Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado.

Análise da viabilidade celular de um monobiofilme de Streptococcus mutans após exposição a colutórios bucais presentes no mercado brasileiro

Este estudo tem como propósito analisar a eficácia de diferentes formulações de antissépticos bucais presentes no mercado brasileiro sobre um monobiofilme de Streptococcus mutans (ATCC 25175). O experimento foi realizado expondo as amostras às formulações por 1 minuto. Os biofilmes foram desenvolvidos semeando as cepas em tubos de ensaio contendo meio de cultura TSB acrescido de 1% de sacarose por 7 dias, com trocas de meio a cada 48 horas. A amostra foi dividida em grupos: monobiofilme tratado com solução contendo clorexidina (controle positivo); monobiofilme tratado com solução contendo óleos essenciais; monobiofilme tratado com solução contendo triclosan; biofilme tratado com solução contendo triclosan acrescido de cloreto de zinco; monobiofilme tratado com solução contendo cloreto de cetilpiridínio; monobiofilme tratado com solução salina fisiológica estéril (controle negativo). Para a análise do efeito pós antibiotico, as cepas foram removidas e plaqueadas imediatamente após a exposição e após 2 horas de crescimento em meio TSB. A média do crescimento bacteriano foi convertida em unidades formadoras de colônia (UFC) para análise. Para analizar a capacidade de recolonização as cepas foram inoculadas em TSB acrescido de sacarose por 48hs. os valores submetidos à análise estatística pelo teste t-student e ANOVA com modificação de Tukey e Dunnett. Os resultados nos permitem concluir que: todos os grupos tratados com antissépticos apresentaram redução das concentrações de microrganismos viáveis em relação ao controle negativo, nos dois tempos analizados. As formulações contendo triclosan e óleos essenciais não apresentaram diferença nem relação ao controle positivo e nem entre eles mesmos, também nos dois tempos. As formulações de antissépticos, contendo clorexidina, óleos essenciais, triclosan podem alterar a capacidade de recolonização do monobiofilme, neste modelo.

Toxicidade e bioacumulação de cobre em micro-organismos fotoautotróficos

Microalgas e cianobactérias têm sido amplamente recomendadas para biomonitoração de metais pesados e outros poluentes, sendo considerados indicadores sensíveis às alterações ambientais e utilizados como organismos testes na regulamentação dos níveis de metal. Estes micro-organismos fotossintetizantes são produtores primários da base da cadeia alimentar aquática e são os primeiros a serem afetados pela poluição por metais pesados. O cobre é um metal normalmente considerado como nutriente essencial para a vida aquática mas pode ser tóxico para algumas espécies. Portanto, neste estudo foram avaliados o efeito tóxico e a bioacumulação de cobre (II) em quatro espécies de micro-organismos fotoautotróficos componentes do fitoplâncton dulcícola, duas cianobactérias filamentosas (Anabaena sp. e Oscillatoria sp) e duas microalgas da classe das clorofíceas (Monorraphidium sp. e Scenedesmus sp.). O meio de cultivo utilizado nos ensaios foi o ASM-1 com e sem a presença de cobre (0,6 mg/L a 12 mg Cu2+/L) onde, o efeito tóxico do metal foi monitorado por contagem celular para as microalgas e por peso seco para as cianobactérias. A bioacumulação do metal foi avaliada da mesma forma para todos os micro-organismos, através de coletas de amostras no decorrer do experimento e determinação da concentração de cobre em solução por espectrometria de absorção atômica com chama. Os resultados obtidos mostram que o efeito tóxico do metal é diretamente proporcional à concentração inicial para os micro-organismos estudados, mas que o cobre (II) foi mais tóxico para as cianobactérias que para as microalgas verdes. A bioacumulação teve uma relação direta com o efeito tóxico do metal sobre os micro-organismos. Os resultados obtidos permitem sugerir que cobre (II) tem efeito negativo no fitoplâncton, inibindo o crescimento e alterando parâmetros metabólicos como a fotossíntese. A bioacumulação do metal pode comprometer os níveis tróficos da cadeia alimentar, afetando seu transporte para seres superiores

Avaliação técnico-econômica da implementação de um sistema de cultivo de microalgas na usina termelétrica Barbosa Lima Sobrinho com vista à biofixação de CO2

Este estudo teve como finalidade levantar dados para uma avaliação das alternativas tecnológicas (cultivos de microalgas e reflorestamento) para a biofixação de CO2 da atmosfera próxima à usina termelétrica; tendo sido utilizada como referência a Usina Barbosa Lima Sobrinho. Já existe um projeto de avaliação do efeito do reflorestamento na fixação do CO2 nesta usina e, neste trabalho, foi avaliada a alternativa do cultivo de microalgas. Uma pesquisa inicial foi feita na literatura para verificar qual a espécie de microalga seria a mais adequada para ser utilizada no estudo, tendo sido a espécie Chlorella sp. a selecionada. Posteriormente os sistemas de cultivo de microalgas mais comumente empregados no mercado foram levantados e foi selecionado o cultivo em tanques abertos como referência para a modelagem do processo. Utilizando os dados da termelétrica e da literatura foi possível estimar a quantidade de CO2 que será retirada da atmosfera caso um sistema de cultivo seja efetivamente instalado na usina termelétrica. Uma análise econômica foi realizada para determinar a viabilidade do projeto. Os resultados indicam que a utilização deste tipo de tecnologia é promissora

Potencial antiinflamatório do extrato aquoso de Echinodorus macrophyllus e de suas frações em modelo de inflamação aguda

A Echinodorus macrophyllus (Alismataceae), conhecida como chapéu de couro no Brasil, é usada popularmente para tratar doenças reumáticas e inflamatórias. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos antiinflamatórios do extrato aquoso de E. macrophyllus (EAEm) e suas frações etanólicas no modelo murino de air pouch. Para a obtenção das frações, 7 g do EAEm foram aplicadas em uma coluna cromatográfica aberta de sílica gel eluída com diferentes concentrações de etanol. Os cromatogramas do EAEm/frações foram obtidos usando um sistema de HPLC. Foram obtidas quatro frações, duas delas com maior rendimento. Resumidamente, a bolha de ar foi induzida pela injeção de 5 mL de ar estéril (s.c) no dorso de camundongos SW machos (25-35 g). Após 3 dias, mas 3 mL de ar estéril foram injetados para manter a bolha. No sexto dia, cada grupo (n = 4) foi tratado intraperitoneal (ip) ou oralmente (v.o) com EAEm (25 ou 250 mg/kg), Fr20 ou Fr40 (2,5, 25, 50 ou 100 mg/kg) e os controles com indometacina (10 mg/kg, v.o.) ou veículo (salina). Uma hora depois, 1 mL de salina ou de carragenina 1% estéril foi injetada dentro da bolha. Após 4 h, a cavidade foi lavada com NaCl 0,9%, EDTA 2 mM (1 mL), para a determinação do número de leucócitos, volume do exsudato e concentração de proteínas. Células do exsudato foram preparadas em citocentrífuga e coradas pelo método do Panótico para a contagem diferencial dos leucócitos. Cortes histológicos coletados dos diferentes grupos foram fixados com formol tamponado 10% (pH 7,4) por 7 dias, corados com HE e analisados em MO. A análise da expressão da iNOS e da COX-2 foi realizada em células do exsudato por RT-PCR. O acúmulo de nitrito (NO2−) no sobrenadante do cultivo de células RAW 264.7 foi determinado usando um ensaio colorimétrico baseado na reação de Griess. Os resultados foram expressos como média EP e comparados usando ANOVA seguido de teste de Dunnet. Os experimentos foram realizados em triplicata. No modelo air pouch, a injeção de carragenina 1% aumentou tanto a migração celular quanto a concentração de proteína no exsudato. Contudo, enquanto o pré-tratamento com a Fr40 aumentou a resposta inflamatória, o pré-tratamento com o EAEm e a Fr20, sobretudo por via i.p., inibiu esta resposta quando comparado ao grupo controle tratado apenas com o veículo. Assim, foram observadas as seguintes razões de inibição da migração de células: EAEm, i.p. a 25 mg/kg (66,44%) e a 250 mg/kg (87,27%) e Fr20 a 2,5 mg/kg (26,89%), 25 mg/kg (60,06%), 50 mg/kg (63,13%) e a 100 mg/kg (77,47%). Em relação à contagem diferencial, o EAEm e a Fr20 afetaram principalmente o número de neutrófilos, inibindo sua migração no exsudato. O EAEm e a Fr20 também reduziram a concentração total de proteínas no exsudato principalmente no tratamento i.p.; EAEm a 25 e 250 mg/kg mostrou 3,33 0,55 e 2,05 0,51 mg/mL, respectivamente, quando comparado aos grupos controles (Indometacina 2.88 0.64 mg/mL; Veículo 5.48 0.88 mg/mL). A Fr20 a 2,5, 25, 50 e 100 mg/kg mostrou 4,788 0,444, 1,417 0,519, 2,474 0,529 e 2,215 0, 361 mg/mL. A análise histológica mostrou infiltrado celular, principalmente composto de leucócitos polimorfonucleares ao longo da derme inflamada de animais tratados com veículo. O tratamento com o EAEm ou Fr20 reduziu a infiltração de leucócitos no tecido inflamado. Além disso, o tratamento com o EAEm e a Fr20 mostrou atividade supressora sobre a expressão de iNOS e COX-2, e mostrou efeitos inibitórios na produção de NO induzida por LPS. Concluindo, todos estes resultados confirmam o potencial antiinflamatório sugerido para esta planta e fornecem uma base para a compreensão de seus mecanismos moleculares de ação. Contudo, outros estudos devem ser realizados para melhor elucidar as vias pelas quais o EAEm e a Fr20 exercem seus efeitos antiinflamatórios. Além disso, estudos fitoquímicos devem ser realizados para identificar os compostos ativos no EAEm e na Fr20.

A mobilidade eletroforética e o perfil de potencial da membrana celular

O objetivo do presente trabalho foi estudar o comportamento dos potenciais superficiais e do perfil de potencial atraves da membrana de eritr ocito em func ao da forca i onica e das cargas superficiais, usando um modelo que leva em conta as cargas el etricas do glicoc alix e das proteınas citoplasm aticas, al em das cargas superficiais da bicamada lipıdica e os efeitos dos eletr olitos divalentes. Programas especıficos em linguagem C foram elaborados para o c alculo desses potenciais, tomando como dados num ericos resultados experimentais de medidas de mobilidade eletrofor etica de eritr ocitos para diferentes valores de forca i onica. Neste c alculo, o metodo para tratamento dos dados eletrofor eticos indicado por Hsu et al.[57] foi incluıdo em nosso modelo. A equac ao de Poisson-Boltzmann nao linear foi resolvida por computac ao num erica, usando o metodo de Runge-Kutta de quarta ordem, obtendo-se os perfis de potencial. Os resultados mostraram que a estimativa da densidade de carga el etrica na superfıcie de c elulas usando a equac ao cl assica de Helmholtz-Smoluchowski conduz a valores que nao conseguem refletir as forcas que regem o comportamento eletrofor etico das mesmas. O presente modelo gerou valores de potenciais superficiais e perfis de potencial para a membrana do eritr ocito bem distintos daqueles obtidos anteriormente para um modelo descrito por uma equac ao de Poisson-Boltzmann linear. Nossos resultados confirmam que a avaliac ao de parametros el etricos superficiais da membrana de eritr ocito, envolvendo dados oriundos de eletroforese, deve incluir c alculos hidrodin amicos al em de eletroest aticos, como sugerido por Hsu et al. [57].

Avaliação de sistema de cultivo integrado, a partir da reciclagem de águas residuais submetidas a tratamento primário: pesquisa de espécies dos gêneros Salmonella, Shigella, Vibrio e Aeromonas

Para avaliar um sistema integrado de aquicultura foram realizadas análises microbiológicas da água utilizada neste sistema e determinada a incidência e resistência antimicrobiana dos enteropatógenos no ecossistema relacionado. As amostras de água testadas apresentaram 32,9% de taxas de coliformes fecais (≤1.600/100mL), de acordo com a OMS para piscicultura em águas residuais. Salmonella spp. foram detectadas em 14,5% das amostras. De um total de 33 cepas, 15,1% eram resistentes a um ou dois antimicrobianos testados e resistência a múltiplas drogas não foi observada. Aeromonas spp. foram identificadas em 91,6% das amostras. De um total de 416 cepas, resistência a uma classe de antimicrobianos foi observada em 66,3% e a multirresistência às drogas em 37,7%. Na avaliação da virulência dos isolados de Aeromonas hydrophila, 85,3% das cepas apresentaram Beta-hemólise nos três diferentes tipos de eritrócitos empregados e 99,1% nos eritrócitos de coelho e cavalo, sendo possível a caracterização através da PCR do gene aerA e lip, em 100% das amostras. Os resultados obtidos apontam para a relevância quanto às vantagens da implementação de um sistema integrado, disponibilizando alimentos com custo reduzido, porém este sistema necessita de um controle rígido e efetivo para que estes produtos não constituam veículos para a disseminação de doenças.

Quantificação das células estreladas ativadas / miofibroblastos e análise da apoptose das células do fígado durante a terapia celular na fibrose hepática em ratos

A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (α-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas α-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de α-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de α-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para α-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e α-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de α-SMA por morfometria mostraram que a expressão de α-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram α-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático.

Modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a modulação celular na regeneração da fratura óssea padronizada em tíbia de ratos

O propósito do presente trabalho foi investigar a participação da proliferação celular e da expressão dos componentes da matriz extracelular na cascata de eventos do processo de reparo da fratura óssea, empregando as técnicas histológica, imunohistoquímica e morfométrica, em um modelo experimental padronizado para a indução da lesão na tíbia de ratos a partir do método empregado por Yuehuei e Friedman7. É importante padronizar um modelo de indução da fratura, para posterior investigação da participação das células e dos componentes da matriz extracelular no processo de reparo da fratura, considerando que o tempo de consolidação depende significantemente da natureza e do tipo da lesão produzida. Quarenta (n = 40) ratos Wistar foram submetidos a fratura . Os animais foram avaliados em oito (n = 8) grupos de cinco (n = 5) animais, cada grupo emperimental com 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 e 240 horas após a fratura (12h até 10 dias). As fraturas foram classificadas de acordo com o sistema de classificação internacional de fratura de Muller100, AO (Associação para Osteosíntese). Foram encontradas fraturas simples em 86% do total, sendo 68% de fraturas transversas e 18% de fraturas obliquas, 14% do total de fraturas foram complexas, sendo 8% de fraturas irregulares e 6% de fraturas segmentares. Esses resultados demonstram que o aparelho permite padronizar radiológicamente o tipo de fratura, caracterizado pela linha que separa os fragmentos ósseos. Os resultados qualitativos dos componentes da matriz extracelular para TGF-β, VEGF, colágeno I e II, osteopontina, proteoglicanos, fibras do sistema elástico com a coloração de resorcina funcsina de Weigert, e para proliferação celular pelo PCNA, assim como os resultados morfométricos, sugerem que a modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a proliferação celular durante o processo de reparo da fratura não é homogênea para todos os componentes teciduais, dependendo significantemente das tensões locais geradas pelo tipo da linha de fratura que pode ser determinante no tempo de regeneração do osso e na qualidade da restauração das propriedades biomecânica. Nossos achados podem contribuir para melhor compreensão da reparo de fratura óssea e para novas abordagens terapêuticas que considerem as propriedades biomecânicas do tecido ósseo em reparo nas suas diferentes etapas

Papel de metaloproteases de Estreptococos do grupo B na interação,viabilidade celular e indução de apoptose e necrose em células endoteliais e epiteliais humanas

Estreptococos do grupo B (EGB) é a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patógeno responsável por infecções invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenças crônicas). Os EGB produzem inúmeras enzimas extracelulares, várias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e são importantes durante a interação EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doença. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases estão envolvidas em várias vias metabólicas em diferentes tipos celulares. Por esta razão, nós decidimos investigar o possível envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interação celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitélio respiratório (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) não induziu alterações no crescimento bacteriano, mas promoveu alterações na expressão de proteínas de superfície, capacidade adesiva e perfil de sobrevivência intracelular do patógeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das células HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana estão envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminação bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e células A549 após 24h de incubação, respectivamente. Nós também observamos redução da pró-caspase-3 após infecção das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativação da caspase-3. Além disso, o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e diminuição dos níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apoptótico mitocondrial (via intrínseca). A melhor compreensão das bases moleculares da patogênese do EGB contribui para identificar novas moléculas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos terapêuticos ou imunoprofiláticos contra a doença causada por esse patógeno neonatal.

Efeito da deficiência de tiamina sobre a inflamação, estresse oxidante e migração celular em modelo experimental de sepse

A sepse é uma condição de elevada letalidade muito frequente em pacientes graves e pode estar associada à deficiência de vitamina B1 ou tiamina. Sendo a tiamina fundamental para produção de energia, restauração do poder redutor e síntese de ribose e desoxirribose celulares, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da deficiência de tiamina sobre a resposta inflamatória, através da medida de interleucinas, o estresse oxidante, pela determinação do 4-hidróxi 2-nonenal (4-HNE) um produto de peroxidação de lipídeos de membrana e a migração celular em modelo experimental de sepse. Em um primeiro experimento foi determinada a concentração de pirofosfato de tiamina (PPT) no sangue de camundongos c57bl6 alimentados com ração completa e com ração deficiente em tiamina, para determinação do tempo necessário para a indução de deficiência dessa vitamina. Em um segundo experimento foi utilizada a ligadura e perfuração cecal (CLP) como modelo de sepse em quatro grupos: SHAM ração completa, SHAM ração deficiente em tiamina, CLP ração completa, CLP ração deficiente em tiamina. As concentrações de PPT no sangue foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência. As dosagens séricas e no líquido peritoneal de TNF-α, IL-1β, IL-6, KC e MCP-1/CCL2 foram realizadas por ELISA. O nível de 4-hidroxi,2-nonenal (4-HNE) no fígado foi avaliado por Western Blot. Contagem de leucócitos no sangue e no líquido peritoneal foi feita por microscopia óptica. Foi avaliada a concentração de bactérias no líquido peritoneal. Nos animais alimentados com ração completa a concentração média de PPT foi 303 42,6 nM, e a deficiência de tiamina foi induzida após 10 dias de ingestão da ração pobre em tiamina, quando observou-se concentração de 12,5 2,4 nM. No lavado peritoneal dos animais submetidos à CLP e privados de tiamina observou-se nível significativamente maior de TNF-α e MCP-1. A IL-1β foi menor no sangue do mesmo grupo. A expressão de 4-HNE foi maior nos grupos privados de tiamina. Quanto à celularidade sanguínea, observou-se apenas maior contagem de mononucleares no grupo submetido à CLP e privado de tiamina. No líquido peritoneal, a contagem de leucócitos totais, mononuleares e monócitos foi mais elevada nos grupos CLP, mas sem relação com o tipo de dieta. No entanto, no líquido peritoneal o grupo CLP deficiente em tiamina revelou população bacteriana significativamente menor que o grupo alimentado com ração completa e os grupos sham. Concluiu-se que a deficiência de tiamina associou-se com aumento da morte bacteriana na cavidade peritoneal, aumento do estresse oxidante, e mudanças na resposta inflamatória. Palavras-chave: Tiamina. Sepse. Estresse oxidante. Inflamação. Modelo de sepse.A sepse é uma condição de elevada letalidade muito frequente em pacientes graves e pode estar associada à deficiência de vitamina B1 ou tiamina. Sendo a tiamina fundamental para produção de energia, restauração do poder redutor e síntese de ribose e desoxirribose celulares, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da deficiência de tiamina sobre a resposta inflamatória, através da medida de interleucinas, o estresse oxidante, pela determinação do 4-hidróxi 2-nonenal (4-HNE) um produto de peroxidação de lipídeos de membrana e a migração celular em modelo experimental de sepse. Em um primeiro experimento foi determinada a concentração de pirofosfato de tiamina (PPT) no sangue de camundongos c57bl6 alimentados com ração completa e com ração deficiente em tiamina, para determinação do tempo necessário para a indução de deficiência dessa vitamina. Em um segundo experimento foi utilizada a ligadura e perfuração cecal (CLP) como modelo de sepse em quatro grupos: SHAM ração completa, SHAM ração deficiente em tiamina, CLP ração completa, CLP ração deficiente em tiamina. As concentrações de PPT no sangue foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência. As dosagens séricas e no líquido peritoneal de TNF-α, IL-1β, IL-6, KC e MCP-1/CCL2 foram realizadas por ELISA. O nível de 4-hidroxi,2-nonenal (4-HNE) no fígado foi avaliado por Western Blot. Contagem de leucócitos no sangue e no líquido peritoneal foi feita por microscopia óptica. Foi avaliada a concentração de bactérias no líquido peritoneal. Nos animais alimentados com ração completa a concentração média de PPT foi 303 42,6 nM, e a deficiência de tiamina foi induzida após 10 dias de ingestão da ração pobre em tiamina, quando observou-se concentração de 12,5 2,4 nM. No lavado peritoneal dos animais submetidos à CLP e privados de tiamina observou-se nível significativamente maior de TNF-α e MCP-1. A IL-1β foi menor no sangue do mesmo grupo. A expressão de 4-HNE foi maior nos grupos privados de tiamina. Quanto à celularidade sanguínea, observou-se apenas maior contagem de mononucleares no grupo submetido à CLP e privado de tiamina. No líquido peritoneal, a contagem de leucócitos totais, mononuleares e monócitos foi mais elevada nos grupos CLP, mas sem relação com o tipo de dieta. No entanto, no líquido peritoneal o grupo CLP deficiente em tiamina revelou população bacteriana significativamente menor que o grupo alimentado com ração completa e os grupos sham. Concluiu-se que a deficiência de tiamina associou-se com aumento da morte bacteriana na cavidade peritoneal, aumento do estresse oxidante, e mudanças na resposta inflamatória.

A leptina regula a proliferação celular e a apoptose na próstata humana

A hiperplasia prostática benigna (HPB) é a doença na qual a próstata demonstra um crescimento anormal e sua prevalência aumenta com o envelhecimento. Leptina, a adipocina mais notável, tem um importante papel na regulação do sistema reprodutivo. Esse trabalho tem por fim avaliar o papel da leptina no tecido prostático humano, utilizando a cultura de tecido in vitro, avaliando a proliferação celular e a expressão dos genes do fator de crescimento do fibroblasto 2 (FGF2), da enzima aromatase e dos genes apoptóticos. De 2009 a 2011, amostras de tecido hiperplásico humano foram obtidas pela prostatectomia transvesical em quinze pacientes com próstatas de volume aumentadas. Cada amostra foi dividida em quatro partes simétricas, mantidas no meio RPMI suplementado com soro fetal bovino a 10%, e 1ng/mL de gentamicina, adicionados a 16 ng/mL de leptina (Leptina) ou não (Controle). Após três horas a expressão dos genes de FGF2, aromatase, Bax, Bcl-x e Bcl-2 foram avaliados por RT-PCR em tempo real. A proliferação celular foi avaliada por imunohistoquímica para PCNA. O tratamento com leptina levou a um aumento na expressão de Bax (C=0.40.1; L=0.90.2; p<0.05), enquanto as expressões de Bcl-2 (C=19.95.6; L=5.61.8; p< 0.05) e Bcl-x (C=0.20.06; L=0.070.02; p<0.05) foram significativamente reduzidas. Não houve alteração significativa na expressão de FGF2, enquanto a expressão da aromatase foi significativamente (C=1.90.6; L=0.40.1; p<0.04) reduzida. A leptina também levou a um aumento na proliferação celular (C=21.80.5; L=64.80.9; p<0.0001). Dessa forma, concluímos que a leptina tem um importante papel na manutenção do crescimento fisiológico da próstata, desde que estimula tanto a proliferação celular como a apoptose, com diminuição na expressão do gene da aromatase.

Relação entre biomarcadores inflamatórios, de adesão celular, de estresse oxidativo, de lesão endotelial, remodelamento tecidual e vascular e os diferentes estágios da doença venosa crônica primária (classes clínicas CEAP C0a, C2, C3, C4)

A doença venosa crônica (DVC) é uma desordem complexa que compreende sinais e sintomas que variam das telangiectasias às úlceras ativas. A DVC é classificada de acordo com aspectos clínicos, etiológicos, anatômicos e fisiopatológicos (CEAP) em sete classes variando de C0 à C6. A principal causa da DVC é a hipertensão venosa que altera o fluxo venoso e, consequentemente, a força de cisalhamento que induz alterações fenotípicas nas células endoteliais que passam a expressar mediadores pró-inflamatórios e pró-trombóticos, que levam à adesão de leucócitos, ao aumento do estresse oxidativo, da permeabilidade vascular e do dano endotelial e ao remodelamento tecidual e vascular.Em virtude dos inúmeros mecanismos e da diversidade de moléculas envolvidas na patogênese e progressão da DVC, é essencial conhecer a interação entre elas e também saber quais são as moléculas (biomarcadores) que se correlacionam positivamente ou negativamente com a gravidade da doença. Foram avaliados os níveis de Interleucina-6 (IL-6), sL-selectina, sE-selectina, sP-selectina, molécula de adesão intercelular-1solúvel (sICAM-1), molécula de adesão das células vasculares-1 solúvel (sVCAM-1), ativador tecidual do plasminogênio (tPA), atividade do inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1), trombomodulina solúvel (sTM), fator de von Willebrand (vWF), metaloproteinase de matriz (MMP)-2, MMP-3, MMP-9, inibidor tecidual das MMPs -1 (TIMP-1), angiopoietina-1 e -2, sTie-2 e s-Endoglina e fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) no sangue coletado da veia braquial de 173 mulheres com DVC primária divididas em grupos C2, C3, C4 e C4 menopausadas (C4m) e de 18 voluntárias saudáveis (grupo C0a). Foram também analisados os níveis urinários de ent-prostaglandina F2α nesses grupos. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas com relação às concentrações sanguíneas e urinárias de sE-selectina, sP-selectina, sICAM-1, atividade de PAI-1, MMP-3, razão TIMP-1/MMP-3, angiopoietin-2, razão angiopoietina-1/angiopoietina-2, s-Endoglina e ent-prostaglandina F2α entre os grupos estudados, possivelmente devido à alta variabilidade na concentração desses biomarcadores entre as participantes do mesmo grupo. Entretanto, as concentrações sanguíneas de IL-6 sL-selectina, sVCAM-1, tPA, vWF, sTM, MMP2, MMP-9, TIMP-1, razão TIMP-1/MMP-2, razão TIMP-1/MMP-9, angiopoietina-1 e VEGF foram estatisticamente diferentes entre os grupos. Não foi identificado nenhum biomarcador que se correlacionasse diretamente ou inversamente com a progressão da DVC, provavelmente devido à diversidade de fatores envolvidos e à complexa interação entre eles durante o curso da doença.

Atividade in vitro da pterocarpanoquinona LQB-118 sobre o Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é endêmica na América Latina sendo considerada uma doença negligenciada com grande impacto socioeconômico. A infecção é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi que é transmitido pela forma vetorial, entre outros mecanismos. O tratamento consiste basicamente no uso de dois fármacos, o benznidazol e o Nifurtimox que apresentam uma série de efeitos colaterais e atuam muito pouco nas formas amastigotas intracelulares o que faz com que o tratamento atual seja restrito e insatisfatório.Várias atividades farmacológicas foram atribuídas ao lapachol e a pterocarpanos, tais como atividade antitumoral e antiparasitária. Devido a esse potencial foi sintetizado uma molécula híbrida, a pterocarpanoquinona LQB-118, e algumas moléculas derivadas. A LQB-118 mostrou anteriormente atividade antitumoral e anti-Leishmania. O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade in vitro da LQB-118 e suas moléculas derivadas sobre o Trypanosoma cruzi clone Dm28c. Para avaliação inicial do efeito anti-parasitário das moléculas, amastigotas intracelulares, tripomastigotas metacíclicos e epimastigotas foram incubados com 20 M das LQBs 118, 168, 187, 182 e 236. A LQB-118 demonstrou atividade antiparasitária nas três formas evolutivas (90% na forma amastigota, 44% na forma tripomastigota e 70% na forma epimastigota) do parasito, enquanto as moléculas derivadas não mostraram atividade significativa. Sendo assim os estudos foram continuados com a molécula LQB-118. A ação da LQB-118 sobre as amastigotas intracelulares foi dose dependente, com redução do índice de infecção em 81% e 88% nas concentrações de 20 e 30 M respectivamente. Já sobre tripomastigotas, a LQB-118 foi menos ativa reduzindo a mobilidade dessas formas em até 45% a 30 M. Sobre a forma epimastigota a ação foi dose-dependente chegando a inibir 96% o crescimento dos parasitos a 20 M, com alterações da morfologia tais como arrendondamento do corpo celular e perda do flagelo. A dose capaz de inibir 50% foi de 4,2 M para amastigota intracelular e 38,1 M para tripomastigotas. Para macrófagos, a LC50 ficou em 40 M, uma concentração quase dez vezes maior que a IC50 para amastigotas. A capacidade das formas amastigotas intracelulares se diferenciarem em tripomatigotas e lisar os macrófagos foi avaliada após o tratamento com a LQB-118 por 72h. Observou-se um atraso do ciclo intracelular do parasito de modo dose-dependente, onde na concentração de 30 M o surgimento de tripomastigota foi no 9 dia enquanto nos controles foi no 5 dia de cultura. Para delinear o mecanismo de ação, foi avaliado o efeito direto sobre o parasito como a indução da fragmentação de DNA. A análise de indução da fragmentação do DNA feita pela marcação pelo TUNEL mostrou que o tratamento com a LQB-118 induziu seletivamente a fragmentação do núcleo das amastigotas enquanto o núcleo dos macrófagos se mantiveram íntegros. Macrófagos peritoneais pré-tratados com LQB-118 por 24 horas foram capazes de reduzir o número de amastigotas após 72h de cultivo na ausência da molécula, mas sem alteração na produção de óxido nítrico. Esses resultados mostram que a LQB-118 é ativa contra o T. cruzi, principalmente sobre a forma amastigota intracelular, que é a forma presente na fase crônica da infecção. O mecanismo de ação sugere que a LQB-118 é capaz de ser seletivamente tóxica para o parasito e também ativar os mecanismos microbicidas dos macrófagos de modo independente da produção de óxido nítrico.

Estudo da resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN- durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-α e IFN- que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram.