Desenvolvimento de técnica de análise de imagens digitais para avaliação do estágio da fibrose em biópsias hepáticas de pacientes portadores de hepatite crônica por vírus da hepatite B e C

As hepatites crônicas por vírus são as mais frequentes, destacando-se os vírus das hepatites B (VHB) e C (VHC). O estudo anatomopatológico da biópsia hepática é considerado o padrão ouro para avaliar com precisão a distorção arquitetural e o grau de fibrose do parênquima do fígado, importantes fatores prognósticos para os pacientes portadores de hepatites crônicas virais. Na avaliação histopatológica atual, em adição aos relatos subjetivos das alterações histológicas, escores semiquantitativos que correlacionam achados morfológicos com graus numéricos são usados, tais como os reconhecidos escores de Ishak e METAVIR. Entretanto, em todos estes sistemas há a desvantagem da subjetividade do examinador e da incorporação de alterações categóricas, sem referências às mudanças quantitativas do colágeno hepático. Técnicas de análise de imagens digitais (AID) que fornecem quantificação objetiva dos graus de fibrose em amostras histológicas têm sido desenvolvidas. Todavia, o alto custo e dificuldade ao acesso das tecnologias descritas restringem seu uso a poucos centros especializados. Este estudo visa o desenvolvimento de uma técnica de custo acessível para a análise de imagens digitais da fibrose hepática em hepatites crônicas virais. Foram estudadas 304 biópsias de pacientes com hepatite crônica por vírus B e C, obtidas através de agulhas Menghini. Todas as amostras tinham pelo menos 15 mm de comprimento ou cinco espaços-porta completos e foram coradas pelo método Tricrômico de Masson. O estadiamento foi feito por um único hepatopatologista experiente, sem o conhecimento dos dados clínicos dos pacientes. Os escores de Ishak e METAVIR foram aplicados. As imagens microscópicas foram digitalizadas. Os índices de fibrose foram determinados de forma automatizada, em técnica desenvolvida no programa Adobe Photoshop. Para o escore de Ishak, observamos os seguintes índices de Fibrose (IF) médios: 0,8% 0,0 (estágio 0), 2.4% 0,6 (estágio 1), 4,7% 1,6 (estágio 2), 7,4% 1,4 (estágio 3), 14,9% 3,7 (estágio 4), 23,4% 2,9 (estágio 5) e 34,5% 1,5 (estágio 6). Para a classificação METAVIR: 0,8% 0,1 (estágio F0), 3,8% 1,8 (estágio F1), 7,4% 1,4 (estágio F2), 20,4% 5,2 (estágio F3) e 34,5% 1,5 (estágio F4). Observamos uma excelente correlação entre os índices de fibrose da AID e os escores de Ishak (r=0,94; p<0,001) e METAVIR (r=0,92; p<0,001). Em relação à indicação de tratamento antiviral, foi observado IF médio de 16,4%. Em relação ao diagnóstico de cirrose, foi observado IF médio de 26,9%, para o escore de Ishak, e 34,5% para a classificação METAVIR. A reprodutibilidade intra-observador foi excelente. Este novo método de análise de imagens digitais para a quantificação de fibrose hepática tem custo acessível e foi desenvolvido com tecnologia que está disponível em todo o mundo, permitindo identificar com precisão todos os estágios de fibrose, com excelente reprodutibilidade intra-observador.

Desenvolvimento e manutenção de memória imunológica após imunização contra Neisseria meningitidis B com a vacina VA-MENGOC-BC

Neisseria meningitidis é uma das principais causas de meningite bacteriana e septicemia em todo o mundo, acometendo principalmente crianças menores de 4 anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A imunidade protetora contra o meningococo caracteriza-se pela presença e persistência de anticorpos bactericidas, porém pouco se sabe sobre os mecanismos de desenvolvimento desta memória sorológica. Avaliamos em modelo animal e em humanos, a geração e manutenção das células secretoras de anticorpos (ASC) e dos linfócitos B de memória (LBm) após vacinação contra MenB. Utilizamos como referência a vacina diftérica (dT ou DTP), considerada ter ótima eficácia em humanos. Para o estudo em modelo animal, grupos de 6 a 8 camundongos suíços, fêmeas, de 5 a 6 semanas, foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC ou DTP, via intramuscular, com intervalo de 2 semanas entre as doses. Aproximadamente 2, 4 ou 6 meses após a última dose, os animais receberam a dose reforço. A vacina anti-MenB induziu uma resposta primária de ASC maior que a resposta à dose reforço. Ao contrário, a resposta de ASC à vacina dT foi maior após o booster. A resposta de LBm anti-MenB permaneceu constante (média de 1%) ao longo de todo o estudo, mas a resposta ao toxóide diftérico (TD) foi maior após o booster (média de 1,9%) que após a imunização primária. A concentração de IgG, anticorpos bactericidas e opsonizantes contra MenB foi dose-dependente e foi reativada após a administração das doses reforços. Esses resultados sugerem que os LBm presentes no baço foram responsáveis pela forte resposta de anticorpos observada após a dose reforço. Para o TD, ambos ASC e LBm foram importantes na manutenção da memória sorológica. Para o estudo em humanos, seis voluntários foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC, via intramuscular, com intervalo de 6 a 7 semanas entre as doses. Seis meses após a imunização primária, os indivíduos receberam uma dose reforço. Outro grupo de voluntários (n = 5) foi imunizado com uma dose reforço da vacina dT. Somente após a terceira dose da vacina anti-MenB foi possível detectar a presença de LBm em todos os indivíduos. Seis meses após a imunização primária, a frequência de LBm voltou ao seu nível basal e não foi reativada após a dose booster. A vacina dT também induziu uma resposta de LBm heterogênea, mas esta foi 5 vezes maior que a induzida por VA-MENGOC-BC. A resposta de anticorpos funcionais anti-MenB foi de curta duração com pequena reativação após a dose reforço. As duas vacinas induziram diferentes frequências de LT de memória central (TCM) e de memória efetora (TEM) após a vacinação primária e após o booster. A resposta à dose booster foi caracterizada pelo aumento da população de linfócitos TCM e diminuição de TEM. A população de linfócitos TCM apresentou maior ativação (CD69+) que os linfócitos TEM, especialmente após a vacinação contra MenB. Concluindo, os dados desta tese indicam que a administração de 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC teve uma eficiência limitada em humanos e sugerem que a baixa eficácia da vacina, quando utilizada na década de 90 em São Paulo e no Rio de Janeiro, pode estar relacionada à deficiência na geração e manutenção de LBm específicos.

Estudo do efeito da adição de poli(glicol etilênico-b-glicol propilênico) na formação de dispersões aquosas poliuretânicas à base de poli(glicol propilênico)

Foram produzidas dispersões aquosas não-poluentes e inovadoras de poli(uretano-uréia) à base de poli(glicol propilênico) (PPG) e de copolímeros em bloco, poli(glicol etilênicob-glicol propilênico), (EG-b-PG) com teor de 7% de unidades de glicol etilênico. Os poli(uretano-uréia)s foram preparados, em duas etapas, pelo método do prepolímero. Na primeira etapa, foram obtidos anionômeros, sintetizados em massa, à base do copolímero EG-bPG, PPG, ácido dimetilol propiônico (DMPA) (gerador dos sítios aniônicos) e diisocianato de isoforona (IPDI). Ainda na primeira etapa, os grupos carboxílicos do DMPA foram submetidos à neutralização com trietilamina (TEA). Na segunda etapa, foi realizada a dispersão do prepolímero anionômero e, em seguida, foi conduzida a reação de extensão de cadeia com a hidrazina (HYD). Nas diferentes formulações, foram variadas a razão NCO/OH e as proporções de PPG e do copolímero em bloco EG-b-PG. Além disso, foram obtidas dispersões aquosas programadas para teores de sólidos de 40 e 50%. As dispersões foram avaliadas quanto ao teor de sólidos totais, tamanho médio de partícula e viscosidade. Os filmes, obtidos por vazamento das dispersões, foram avaliados quanto à absorção de água, termogravimetria (TG) e propriedades mecânicas (ensaio de tração). Os filmes vazados e os monômeros foram caracterizados por espectrometria na região de infravermelho (FTIR) As dispersões obtidas se mostraram adequadas para serem aplicadas como revestimento para madeira, metais e vidro

Carcinoma epidermóide invasivo de pênis: subexpressão dos fragmentos C3 e C4A/B do sistema complemento detectado no plasma pela plataforma proteômica ClinProt/MALDI/TOF

O carcinoma epidermóide de pênis (CEP) representa 95% das neoplasias penianas e afeta quase sempre pacientes não circuncidados estando muitas vezes associado à falta de higiene local adequada e à fimose. No Brasil a sua incidência é de 2,7 % porém em algumas áreas do país pode chegar a 17% dos casos diagnosticados por ano. O tumor pode ocorrer em qualquer parte do órgão sexual masculino e o tipo de estadiamento empregado é controverso. A classificação de Broders é a mais utilizada. Estudos sugerem a relação entre o desenvolvimento do carcinoma de pênis com a infecção por HPV (Papiloma Vírus Humano). O método de avaliação dos linfonodos inguinais permanece controverso sendo difícil a diferenciação entre linfadenomegalia inflamatória reacional e metastática. O exame físico não é um preditor confiável do comprometimento linfonodal pois pacientes com linfonodos palpáveis podem não apresentar metástases. Há poucas publicações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na gênese e progressão do CEP. Apesar de vários marcadores terem sido avaliados, atualmente a aplicação clínica destes é limitada. A maior parte dos marcadores estudados requer procedimentos invasivos para obtenção do tecido tumoral. Existe a necessidade de encontrar através de uma técnica pouco invasiva marcadores tumorais circulantes capazes de diferenciar portadores de CEP com e sem envolvimento metastático. Neste tipo de neoplasia, a descoberta de biomarcadores que avaliem o prognóstico é relevante, pois o exame físico não é um indicador confiável do comprometimento linfonodal e da sobrevida.Os objetivos foram 1) revisar e discutir a epidemiologia, a etiologia, os diversos tipos de abordagem cirúrgica e as controvérsias no tratamento cirúrgico do câncer de pênis 2) investigar através da plataforma ClinProt/ MALDI / TOF a presença de marcadores plasmáticos capazes de discriminar indivíduos saudáveis de pacientes afetados por carcinoma epidermóide de pênis (CEP) 3) avaliar a importância destes marcadores na evolução da doença. Foram coletados e analisados pela plataforma ClinProt / MALDI / TOF o plasma de 36 indivíduos saudáveis e 25 pacientes com CEP invasivo, submetidos a tratamento cirúrgico entre junho de 2010 e junho de 2011, nos serviços de urologia do Instituto Nacional de Câncer e do Hospital Mário Kröeff (Rio de Janeiro). Nossos resultados apontaram para um conjunto de dois peptídeos (A = m / z 1897,22 + -9 Da e B = m / z 2021,99 + -9 Da) que foram capazes de diferenciar pacientes com CEP de indivíduos controles. Esses peptídeos foram posteriormente identificados como fragmentos C3 e C4 A/B do sistema complemento. A validação cruzada, utilizando toda casuística apresentou 62,5% e 86,76% de sensibilidade e de especificidade, respectivamente, com uma alta sensibilidade (100%) e especificidade (97%) nos pacientes que morreram pela doença. Além disso, os pacientes com envolvimento ganglionar obtiveram uma sensibilidade e uma especificidade de 80 % e 97%, respectivamente. Ficou demonstrado que à medida que a doença progride mais subexpressos está o conjunto de peptídeos quando comparados com indivíduos saudáveis. Estes resultados podem ser úteis como ferramentas para a avaliação do prognóstico destes pacientes.

Efeito da radiação ionizante e quimioterapicos em tecido cardíaco e expressão do peptídeo natriurético do tipo B

A utilização de biomarcadores cardioespecíficos vem sendo recomendado como ferramenta útil na monitoração e identificação precoce de lesão cardíaca, em decorrência do potencial de cardiotoxicidade da terapêutica oncologica. O objetivo do presente estudo foi avaliar o nível plasmático do peptídeo natriurético do tipo B (BNP) e da expressão gênica do BNP e outros genes relacionados a sua síntese, a interleucina-6 (IL-6), fator β1 de transformação de crescimento (TGF-β1) e procolágeno tipo I, mediante a associação dos agentes antineoplásicos docetaxel e ciclofosfamida (TC) e da radiação ionizante (IR) no coração de ratas Wistar, 2 meses após o término do tratamento. Para isso, Ratas Wistar (3-4 meses, n=7) foram irradiadas no coração com dose única de 20Gy, em um campo ântero-posterior de 2x2cm2, em acelerador linear com feixe de energia nominal de 6 MeV; outras (n=7) foram tratadas (4 ciclos, com 7 dias de intervalo) com docetaxel (12,5 mg/Kg) e ciclofosfamida (50 mg/Kg) e irradiadas após 7 dias do tratamento quimioterápico. Como controle (n=7), animais não irradiados e não tratados com quimioterápicos. Após 2 meses do fim do tratamento, a eutanásia dos animais foi realizada. Amostras de plasma e tecido cardíaco, ventrículo esquerdo (VE), foram coletadas. Por ensaio ELISA foi quantificada a concentração plasmática de BNP; parte do tecido cardíaco foi fixado, incluído em parafina e cortado em micrótomo, para assinalar a presença de BNP no VE, avaliação qualitativa, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ); e a outra parte para a técnica RT-qPCR, onde foram avaliados a expressão relativa de mRNA dos genes do BNP, IL-6, TGF-β1 e procolágeno tipo I. Na IHQ o grupo controle apresentou uma marcação pontual, enquanto que os grupos tratados apresentaram uma marcação mais difusa, sendo que o grupo TC+IR foi o que apresentou maior dispersão na marcação do BNP no tecido cardíaco. Embora não tenha sido observado no ensaio ELISA uma diferença significativa entre as concentrações plasmáticas de BNP dos grupos tratados em relação ao controle, nota-se uma tendência de aumento no grupo TC+IR. Na analise por RT-qPCR, a expressão relativa de BNP foi similar ao apresentado no ELISA. O grupo TC+IR foi o grupo que apresentou maior expressão gênica de BNP, porém a diferença não é significativa em relação ao controle. A única análise em que se obteve diferença na expressão gênica em relação ao controle foi a do gene IL-6 que apresentou expressão reduzida. Todos os demais genes analisados por RT-qPCR apresentaram uma expressão similar ao controle. Assim, os resultados obtidos sugerem que o BNP não se apresentou como um bom biomarcador cardioespecífico para identificação precoce de lesão cardíaca, no período a qual foi avaliado. As ratas Wistar, 2 meses após a submissão do tratamento, não apresentaram um resultado diferenciado em relação ao controle, nos genes TGF-β1 e procolágeno tipo I, sugerindo ausência de um quadro de remodelamento cardíaco. Entretanto, apresentou redução significativa do gene IL-6, no grupo TC+IR, propondo ação anti-inflamatória do BNP, que no mesmo grupo, apresentou uma tendência de aumento em sua expressão gênica.

O peptídeo natriurético tipo B (BNP) como preditor de mortalidade a longo prazo em pacientes com síndrome coronariana aguda sem supradesnível do segmento ST

Fundamentos: Apesar dos conhecimentos adquiridos sobre marcadores preditores de mortalidade na síndrome coronariana aguda (SCA), a capacidade de avaliação a longo prazo permanece desconhecida. O peptídeo natriurético tipo B (BNP) tem sido extensamente utilizado, porém as evidências existentes se restringem ao seguimento de curto e médio prazos. Objetivos: Determinar se o BNP é um preditor independente de mortalidade por todas as causas a longo prazo em pacientes com síndrome coronariana aguda sem supradesnível do segmento ST (SCASSST). Métodos: No período de 1o de Janeiro de 2002 a 31 de Dezembro de 2003, foram selecionados 224 pacientes consecutivos atendidos na sala de emergência com SCASSST. A dosagem do BNP à admissão foi incorporada no protocolo diagnóstico, tendo o seu valor sido correlacionado com a mortalidade ao final do seguimento. Resultados: Os pacientes foram acompanhados por 9,34 anos (mediana), tinham 71,5 anos (intervalo IQ=60,5;79,0) e com predomínio do gênero masculino (62,9%). A hipertensão arterial esteve presente em 82,1% e o diabetes em 23,7%. A angina instável (AI) foi diagnosticada em 52,2% e o infarto agudo do miocárdio sem supradesnível do segmento ST (IAMSSST) em 47,8%. O BNP mediano foi de 81,9 pg/ml (intervalo IQ 22,2; 225). A mortalidade se correlacionou com os quartis crescentes do BNP: 14,3; 16,1; 48,2; e 73,2% (p<0,0001). A curva ROC determinou o BNP=100 pg/ml como o melhor ponto de corte, tendo apresentado área sobre a curva (AUC) de 0,79 (IC 95%=0,72-0,85) e sendo preditor de mortalidade ao final do seguimento: 17,3% vs. 65,0%, p<0,001, RR=3,76 (IC 95%=2,49-5,63). O BNP teve poder prognóstico tanto nos pacientes com (26,7 vs. 71,2%, p<0,001) como nos sem (12,9 vs. 56,8%, p<0,001) alteração da função ventricular, e também conforme o diagnóstico de AI (18,7 vs. 48,6%, p=0,001) e IAMSSST (14,9 vs. 75,0%, p<0,001). Na análise de regressão logística, a idade>72 anos (OR=3,79, IC 95%=1,62-8,86, p=0,002), o BNP≥100 pg/ml (OR=6,24, IC 95%=2,95-13,23, p<0,001) e a taxa de filtração glomerular estimada (TFGE)(OR=0,98, IC 95%=0,97-0,99, p=0.049) foram preditores independentes de mortalidade. Conclusões: O BNP dosado à admissão dos pacientes com SCASSST é um forte e independente preditor de mortalidade a longo prazo.