Estudo proteômico da interação do Aspergillus fumigatus com células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)

O Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete, principalmente, pacientes de Unidades Hematológicas, como aqueles com neutropenia profunda e prolongada. Após a filamentação este fungo angioinvasivo é capaz de ativar e causar danos em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) que passam a expressar um fenótipo pró-trombótico. A ativação destas células, dependente de contato célulacélula, é mediada por TNF-α e caracterizada pela expressão de moléculas próinflamatórias, como citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão. Recentemente, nosso grupo comparou a ativação endotelial de HUVECs desafiadas com cepas selvagens e uma cepa mutante para o gene UGM1. Nestes experimentos a cepa mutante Δugm1, que apresenta um fenótipo de maior produção de galactosaminogalactana (GAG) na parede celular, mostrou um fenótipo hiperadesivo e uma capacidade maior de ativar células endoteliais. Entretanto, os receptores e as vias de sinalização envolvidos nesta ativação permanecem desconhecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar as proteínas envolvidas nestes processos através do estudo das proteínas diferencialmente expressas nas HUVECs após a interação com A. fumigatus, usando a técnica proteômica 2D-DIGE. Brevemente, as HUVECs foram infectadas com tubos germinativos da cepa selvagem (AF293) e da cepa Δugm1 de A. fumigatus. Em seguida, as proteínas foram marcadas com diferentes fluorocromos e separadas por eletroforese bidimensional. A análise quantitativa foi realizada utilizando o software DeCyder. Foram identificadas por MS/MS cinco proteínas diferencialmente expressas, incluindo a galectina-1 e a anexina A2, ambas mais expressas após a interação, sendo a primeira ~25% mais expressa após a interação com a mutante Δugm1. Este trabalho propõe que a galectina-1 poderia ser o receptor endotelial para polímeros de galactose presentes na parede celular do A. fumigatus, e que a Anexina A2 poderia estar envolvida na sinalização intracelular em resposta a este patógeno. No entanto, experimentos complementares, em curso, são necessários para comprovar esta hipótese.

Modelagem do potencial elétrico através da membrana do neurônio ganglionar e células de neuroblastoma: efeitos das cargas superficiais.

O objetivo do presente trabalho é comparar, do ponto de vista elétrico, a membrana do neurônio ganglionar com a da célula de neuroblastoma, analisando os efeitos das cargas fixas sobre o potencial elétrico nas superfícies da bicamada lipídica e também sobre o comportamento do perfil de potencial através da membrana, considerando as condiçõesfísico-químicas do estado de repouso e do estado de potencial de ação. As condições para a ocorrência dos referidos estados foram baseadas em valores numéricos de parâmetros elétricos e químicos, característicos dessas células, obtidos na literatura. O neurônio ganglionar exemplifica um neurônio sadio, e a célula de neuroblastoma, que é uma célula tumoral, exemplifica um neurônio patológico, alterado por esta condição. O neuroblastoma é um tumor que se origina das células da crista neural (neuroblastos), que é uma estrutura embrionária que dá origem a muitas partes do sistema nervoso, podendo surgir em diversos locais do organismo, desde a região do crânio até a área mais inferior da coluna. O modelo adotado para simular a membrana de neurônio inclui: (a) as distribuições espaciais de cargas elétricas fixas no glicocálix e na rede de proteínas citoplasmáticas; (b) as distribuições de cargas na solução eletrolítica dos meios externo e interno; e (c) as cargas superficiais da bicamada lipídica. Os resultados que obtivemos mostraram que, nos estados de repouso e de ação, os potenciais superficiais da bicamada interno (ÁSbc) e externo (ÁSgb) da célula de neuroblastoma não sofrem alteração mensurável, quando a densidade de carga na superfície interna (QSbc) torna-se 50 vezes mais negativa, tanto para uma densidade de carga na superfície externa da bicamada nula (QSgb = 0), como para um valor de QSgb 6= 0. Porém, no estado de repouso, uma leve queda em ÁSbc do neur^onio ganglionar pode ser observada com este nível de variação de carga, sendo que ÁSgb do neurônio ganglionar é mais negativo quando QSgb = 1=1100 e/A2. No estado de ação, para QSgb = 0, o aumento da negatividade de QSbc não provoca alteração detectável de ÁSbc e ÁSgb para os dois neurônios. Quando consideramos QSgb = 1=1100 e/A2, ÁSgb do neurônio ganglionar se torna mais negativo, não se observando variações detectáveis nos potenciais superficiais da célula de neuroblastoma. Tanto no repouso quanto no estado de ação, ÁSgb das duas células não sofre variação sensível com o aumento da negatividade da carga fixa distribuída espacialmente no citoplasma. Já a ÁSbc sofre uma queda gradativa nos dois tipos celulares; porém, no estado de ação, esta queda é mais rápida. Descobrimos diferenças importantes nos perfis de potencial das duas células, especialmente na região do glicocálix.

Associação entre polimorfismos dos genes IL1B, IL1RN e TNFA e a periodontite agressiva e a periodontite crônica severa

A periodontite é um processo inflamatório crônico de origem bacteriana mediado por citocinas, em especial, interleucina-1 (IL1) e fator de necrose tumoral (TNFα). Polimorfismos genéticos de IL1 e TNFA têm sido associados com a variação de expressão dessas proteínas, o que poderia justificar as diferenças interindividuais de manifestação da doença. O objetivo do presente estudo foi investigar possíveis associações entre os genes IL1B, IL1RN e TNFA e a suscetibilidade à periodontite agressiva e à periodontite crônica severa. Foram selecionados 145 pacientes do Estado do Rio de Janeiro, 43 com periodontite agressiva (PAgr) (33,1 4,8 anos), 52 com periodontite crônica severa (PCr) (50,6 5,8 anos) e 50 controles (40,1 7,8 anos). Os DNAs genômicos dos integrantes dos grupos PAgr, PCr e controle foram obtidos através da coleta de células epiteliais bucais raspadas da parte interna da bochecha com cotonete. Os SNPs IL1B -511C>T, IL1B +3954C>T e TNFA -1031T>C foram analisados pela técnica de PCR-RFLP, utilizando as enzimas de restrição Ava I Taq I e Bpi I, respectivamente. O polimorfismo de número variável de repetições in tandem (VNTR) no intron 2 do gene IL1RN foi feita pela análise direta dos amplicons. Todos os polimorfismos foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%. As frequências alélica e genotípica do polimorfismo IL1B +3954C>T no grupo PCr foram significativamente diferentes das observadas no grupo controle (p=0,003 e p=0,041, respectivamente). A freqüência do alelo A2 do polimorfismo IL1RN VNTR intron2 no grupo PAgr foi significativamente maior do que no grupo controle (p=0,035). Não houve associação entre os polimorfismos IL1B -511C>T e TNFA -1031T>C e as periodontites agressiva e crônica. A presença dos alelos 2 nos genótipos combinados de IL1RN VNTR intron2 e IL1B +3954C>T no grupo PCr foi significativamente maior quando comparada ao grupo controle (p=0,045). Entretanto, não se observou associação entre as combinações genotípicas IL1B -511C>T / IL1B +3954C>T e IL1RN VNTR / IL1B -511C>T e a predisposição à doença periodontal. De acordo com os nossos resultados podemos sugerir que, para a população estudada, o polimorfismo IL1B +3954C>T interfere no desenvolvimento da periodontite crônica, enquanto a presença do alelo A2 do polimorfismo IL1RN VNTR intron2 pode ser considerado como indicador de risco para a periodontite agressiva. O presente estudo também nos permite sugerir que a ausência de homozigose dos alelos 1 nos genótipos combinados de IL1RN VNTR intron2 e IL1B +3954C>T pode representar maior suscetibilidade à periodontite crônica severa.

Avaliação difratográfica da microestrutura de três resinas compostas submetidas à aplicação de um agente clareador a base de peróxido de hidrogênio

A odontologia moderna utiliza métodos e técnicas ultraconservadores no intuito de corrigir os diversos tipos de alterações cromáticas observadas clinicamente. Os meios empregados baseiam-se na utilização de substâncias químicas à base de peróxidos presentes em diversas concentrações. O presente estudo objetivou avaliar a microestrutura de três resinas compostas fotossensíveis submetidas à aplicação de um agente clareador a base de peróxido de hidrogênio a 35% (Whiteness HP Maxx - fabricante: FGM), ativado por uma fonte híbrida de energia luminosa (Aparelho de Laser-Led Whitening Lase, fabricante: DMC). Para isso, foram confeccionados 30 corpos de prova (CDP) 10 para cada grupo, no formato de discos, com 13 mm de diâmetro e 2,0 mm de espessura em uma matriz de teflon e aço inox, fotoativados por um aparelho de luz halógena convencional (Optilux 401 - Demetron/UR) por 40 segundos com densidade de potência média igual a 450 mW/cm2. Os grupos foram dispostos da seguinte forma: Grupo 1 - resina microparticulada (Durafill VS - fabricante: Heraeus Kulzer); Grupo 2 - resina micro-híbrida (Esthet-X - fabricante: Dentsply); e Grupo 3 resina nanoparticulada (Filtek Supreme XT fabricante: 3M ESPE). Todos os materiais restauradores utilizados eram da cor A2. Após serem submetidos à sequência de acabamento e polimento os CDP foram armazenados por sete dias em saliva artificial, limpos em ultra-som, envelhecidos artificialmente de acordo com a norma ASTM G 154. Os CDP dos três grupos foram aleatoriamente divididos em 2 subgrupos (ST sem tratamento e CT com tratamento) e finalmente submetidos aos experimentos. Os CDP dos subgrupos 1-ST, 2- ST e 3-ST foram triturados (SPEX SamplePrep 8000-series, marca: Mixer/Mills) seguido pela verificação dos materiais por meio de um espectrômetro (marca/modelo: Shimadzu EDX 720) para certificação da ausência de elementos pertencentes ao meio de moagem e por fim foram levados a um difrator de raios-X (marca / modelo: Philips -PW 3040 -X'Celerator- 40kV; 30mA; (λ): CuKα; 0,6; 0,2mm; 0,05 (2θ); 2s; 10-90 (2θ). Em seguida os CDP dos subgrupos 1-CT, 2- CT e 3-CT foram tratados com o peróxido de hidrogênio de acordo com o protocolo do fabricante para a fonte híbrida luminosa de energia selecionada, totalizando 9 aplicações de 10 minutos, onde eram respeitados os tempos de 3 minutos de ativação por 20 segundos de descanso, finalizando 10 minutos em cada aplicação. Mediante a este tratamento, os CDP dos subgrupos CT eram verificados e avaliados pelo mesmo método descrito anteriormente. Após interpretação gráfica, análise comparativa por meio do processamento digital das imagens no programa KS400 3.0 (Carl Zeiss Vision) e análise de concordância por cinco avaliadores calibrados utilizando um escore, pôde-se concluir que houve degradação estrutural e que as estruturas cristalinas das resinas estudadas foram afetadas de forma distinta quando tratadas pelo peróxido de hidrogênio; onde observou-se que: Grupo 1 > Grupo 3 > Grupo 2. Foi sugerido a realização de novos estudos, relacionados à interação do peróxido de hidrogênio às resinas compostas.

A atividade da pterocarpanoquinona LQB 118 in vitro e in vivo em Leishmania braziliensis

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-α. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Atividade pró-trombótica da toxina ExoU de Pseudomonas aeruginosa detectada em modelos experimentais in vivo e in vitro

Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de pneumonia, particularmente em pacientes submetidos à ventilação mecânica, que pode evoluir para sepse, com elevadas taxas de letalidade. Na sepse, o processo inflamatório sistêmico exacerbado favorece o desequilíbrio entre as vias de coagulação e fibrinólise e a instalação de um estado pró-coagulante, com o aparecimento de trombose microvascular, coagulação intravascular disseminada e falência de múltiplos órgãos. Conhecendo a potente atividade pró-inflamatória da toxina ExoU produzida por P. aeruginosa, decorrente de sua atividade fosfolipásica A2, o objetivo desta tese foi investigar seu potencial de indução de alterações hemostáticas relacionadas à patogênese da sepse. Utilizando modelo de sepse em camundongos inoculados, por via intratraqueal, com suspensões de P. aeruginosa produtora de ExoU (PA103) ou de cepa com deleção do gene exoU, não produtora da toxina, foi mostrado que ExoU determinou maior gravidade da infecção, maior taxa de letalidade, leucopenia, trombocitose, hiperpermeabilidade vascular e transudação plasmática, evidenciadas, respectivamente, pela maior concentração de proteínas nos lavados broncoalveolares (LBAs) e acúmulo do corante Azul de Evans, previamente inoculado nos animais, por via endovenosa, no parênquima renal. ExoU favoreceu, também, a ativação plaquetária, confirmada pela maior concentração de plaquetas expressando P-selectina em sua superfície, maior número de micropartículas derivadas de plaquetas e maior concentração plasmática de tromboxano A2. A histopatologia dos pulmões e rins dos animais infectados com PA103 confirmou a formação de microtrombos, que não foram detectados nos animais controles ou infectados com a cepa mutante. Nos pulmões, a produção de ExoU determinou intensa resposta inflamatória com maior concentração de leucócitos totais e polimorfonucleados, interleucina-6 e fator de necrose tumoral-α nos LBAs. A análise imunohistoquímica mostrou intensa deposição de fibrina nos alvéolos e septos interalveolares. A atividade pró-coagulante dependente do fator tissular detectada nos LBAs dos camundongos infectados com PA103 foi independente da produção do inibidor da via de ativação do fator tissular (TFPI), mas associada ao aumento da produção do inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1). Para investigar a participação do fator de ativação plaquetária (PAF) na liberação de PAI-1, foi pesquisada a atividade da enzima PAF-acetil-hidrolase (PAF-AH) nos LBAs dos camundongos. A atividade de PAF-AH apresentou-se significativamente elevada nos LBA dos camundongos infectados com PA103. O tratamento dos animais com um inibidor do PAF, antes da infecção, resultou na diminuição significativa das concentrações de PAI-1 e de leucócitos totais, bem como da atividade pró-coagulante dos LBAs. In vitro, ExoU induziu maior expressão do RNA mensageiro de PAI-1 e maior liberação da proteína PAI-1 nos sobrenadantes de células epiteliais respiratórias da linhagem A549. O tratamento das células A549 com um anticorpo anti-receptor de PAF, antes da infecção, reduziu significativamente a concentração de PAI-1 nos sobrenadantes de células infectadas com a cepa selvagem. Estes resultados demonstraram um novo mecanismo de virulência de P. aeruginosa através da atividade pró-trombótica de ExoU e a possibilidade de utilização da identificação de ExoU em isolados clínicos de pacientes graves como um marcador prognóstico para estes pacientes.

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Estudos dos polimorfismos dos genes da apolipoproteína E (ApoE) e do receptor de LDL (RLDL - A370T) em indivíduos jovens pertencentes ao estudo do Rio de Janeiro em seguimento de 28 Anos

Estudos demonstram a associação de alterações da apolipoproteína E (ApoE) e do receptor do LDL (RLDL) com a ocorrência de doenças cardiovasculares e dislipidemia. O objetivo principal deste trabalho foi investigar a associação entre genótipos diferenciais da ApoE e do RLDL com a persistência de alterações de variáveis lipídicas em indivíduos jovens acompanhados há 28 anos no Estudo do Rio de Janeiro (ERJ). Através de um estudo longitudinal, tipo coorte, investigou-se 56 indivíduos (35M) em três avaliações. Em A1 (13.301.53 anos), A2 (22.091.91 anos) e A3 (31.231.99). Nas três ocasiões foi realizada avaliação clínica. Em A2 e A3 foram dosados colesterol total, HDL, LDL e triglicerídeos. Em A3 acrescentou-se o estudo dos polimorfismos genéticos da ApoE e do RLDL. Os fragmentos de interesse neste estudo foram amplificados por PCR (polymerase chain reaction) e os genótipos foram identificados através de reações de restrição. As frequências genotípicas de ApoE foram ε3/ε3 (62,5%), ε3/ε4 (25%), ε2/ε3 (5,4%) ,ε2/ε4 (5,4%) e ε4/ε4 (1,8%) e para os genótipos de RLDL foram AA (85,7%), AT (12,5%) e TT (1,8%). O genótipo ε2/ε2 não foi observado. A análise da distribuição dos genótipos de ApoE segundo a permanência de dislipidemia mostrou que todos os indivíduos com genótipo de ApoE dos tipos ε2/ε4 e ε4/ε4 mantiveram pelo menos um lípide alterado em A2 e A3 entretanto, todos os indivíduos com genótipo de ApoE do tipo ε2/ε3 não apresentaram lípides alterados em A2 e A3. Para o genótipo do RLDL não houve diferença significativa. Quando analisadas isoladamente, não foi identificado nenhum resultado significativo em A2 e/ou A3 associado a estes genótipos. O polimorfismo do gene da ApoE esteve associado à permanência de dislipidemia em indivíduos jovens acompanhados em estudo de seguimento longitudinal

Caracterização do maciço Santa Clara no município de Cujubim (RO) com base em litogeoquímica, geocronologia e estudos isotópicos

A Suíte Intrusiva Santa Clara está inserida na Província Estanífera de Rondônia, na porção SW do Cráton Amazônico. Essa suíte intrusiva é composta pelos maciços Santa Clara, Oriente Velho, Oriente Novo, Manteiga-Sul, Manteiga-Norte, Jararaca, Carmelo, Primavera e das Antas. Os litotipos que perfazem a Suíte Santa Clara ocorrem hospedados nas rochas do Complexo Jamari, uma associação polideformada composta por gnaisses ortoderivados e paraderivados. Características observadas em campo e em análises petrográficas permitiram subdividir o Maciço Santa Clara em cinco fácies distintas: fácies porfirítica, fácies isotrópica, fácies fina, fácies piterlítica e fácies viborgítica. Os litotipos observados correspondem a hornblenda-biotita granitos e biotita granitos intermediários a ácidos, com composições médias semelhantes àquelas verificadas para sienogranitos e monzogranitos. Geoquimicamente, três magmas podem ser identificados. O magma menos evoluído corresponde às rochas das fácies porfirítica e equigranular, e o mais evoluído compreende as fácies de granulometria fina e piterlítica. A fácies viborgítica representa o terceiro líquido magmático, e aparentemente é diferente de todas as outras fácies em termos de aspectos de campo e geoquímica. A análise litogeoquímica indica que estes granitoides são subalcalinos, bastante empobrecidos em MgO e exibem caráter metaluminoso a fracamente peraluminoso. Os padrões de elementos-traços evidenciam que tais granitóides possuem alto conteúdo em elementos incompatíveis (Rb, Zr, Y, Ta, Ce) e ETR, com exceção do Eu. Além disso, também exibem leve enriquecimento em LILE, forte depleção em elementos como Sr e Ti, e leve empobrecimento de Ba, indicando que o fracionamento de minerais como plagioclásio e titanita foi importante na evolução do líquido magmático analisado. A anomalia negativa de Nb indica envolvimento de material crustal nos processos magmáticos que geraram estes granitoides. Os litotipos analisados possuem características típicas de granitos tipo-A ferroan, e as razões FeOt/MgO entre 4,27 e 26,22 sugerem tratar-se de uma série de granitos félsicos fracionados. Os padrões de ETR observados para os litotipos analisados exibem um considerável enriquecimento em ETRL, e anomalia negativa de Eu, sugerindo fracionamento de feldspato durante o processo de diferenciação do líquido magmático. Diagramas discriminantes de ambientes tectônicos sugerem que os litotipos do Maciço Intrusivo Santa Clara são típicos de ambiente intraplaca, do tipo-A2, isto é, associados a ambientes pós-colisionais/pós-orogênicos. As características isotópicas observadas para os granitoides do Maciço Santa Clara sugerem que os mesmos foram gerados a partir da fusão parcial de uma crosta inferior pré-existente. As idades U-Pb entre 1,07 e 1,06 Ga são compatíveis com um magmatismo ocorrido nos estágios finais da colagem do supercontinente Rodínia (1,2-1,0 Ga) e estágios finais do Ciclo Orogênico Sunsás-Aguapeí (1320-1100 Ma). Sugere-se ainda que na verdade o Maciço Santa Clara seja formado por uma coalescência das três intrusões graníticas que são representadas pelos três magmas anteriormente descritos.

Efeito da 1,10-fenantrolina e seus derivados complexados em metal na atividade proteolítica de Leishmania braziliensis

Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao óbito. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através da marcação com anexina/iodeto de propídio e ensaio TUNEL. O pré-tratamento de promastigotas com os inibidores de metalopeptidases induziram uma diminuição na expressão de moléculas de superfície gp63, assim como uma redução significativa no índice de associação com macrófagos. Em paralelo, macrófagos infectados com L. braziliensis e tratados com 1,10-fenantrolina e seus derivados promoveram uma potente redução sobre o número de amastigotas intracelulares. O tratamento de macrófagos com 1,10-fenantrolina e seus derivados não induziram o aumento de óxido nítrico. A ação combinatória sobre a capacidade de crescimento entre os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e Glucantime, quando ambos foram utilizados em concentracões sub-inibidoras, também foi observada. In vivo os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e seus drivados foram capazes de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado em hamsters infectados quando administrado por via intraperitoneal. Os animais tratados com os compostos apresentaram maior resposta intradérmica (DTH) aos antígenos de L. braziliensis. Coletivamente, a 1,10-fenantrolina e seus derivados metálicos apresentam uma nova perspectiva de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos anti-L. braziliensis

Velocidade da onda de pulso em adultos jovens acompanhados por 18 anos: impacto de variáveis pressóricas, antropométricas, metabólicas, inflamatórias e de função endotelial. Estudo do Rio de Janeiro.

Dados sobre a avaliação não invasiva da rigidez vascular e suas relações com variáveis de risco cardiovascular são escassos em jovens. Objetiva avaliar a relação entre a velocidade de onda de pulso (VOP) e a pressão arterial (PA), variáveis antropométricas, metabólicas, inflamatórias e de disfunção endotelial em indivíduos adultos jovens. Foram estudados 96 indivíduos (51 homens) do Estudo do Rio de Janeiro, em duas avaliações, A1 e A2, com intervalo de 17,691,58 anos (16 a 21 anos). Em A1 foram avaliados em suas escolas (10-15 anos - média 12,421,47 anos) e em A2 foram novamente avaliados em nível ambulatorial (26-35 anos - média 30,091,92 anos). Em A1 foram obtidos pressão arterial (PA) e índice de massa corporal (IMC). Em A2 foram obtidos a velocidade da onda de pulso (VOP)-método Complior, PA, IMC, circunferência abdominal (CA), glicose, perfil lipídico, leptina, insulina, adiponectina, o índice de resistência à insulina HOMA-IR, proteína C-Reativa ultrassensível (PCRus) e as moléculas de adesão E-selectina, Vascular Cell Adhesion Molecule-1(VCAM-1) e Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1). Foram obtidos, ainda, a variação da PA e do IMC entre as 2 avaliações. Em A2 os indivíduos foram estratificados segundo o tercil da VOP para cada sexo. Como resultados temos: 1) Os grupos foram constituídos da seguinte forma: Tercil 1:homens com VOP < 8,69 m/s e mulheres com VOP < 7,66 m/s; Tercil 2: homens com VOP ≥ 8,69 m/s e < 9,65m/s e mulheres com VOP ≥ 7,66 m/s e < 8,31m/s;Tercil 3:homens com VOP ≥ 9,65 m/s e mulheres com VOP ≥ 8,31 m/s. 2) O grupo com maior tercil de VOP mostrou maiores médias de PA sistólica (PAS) (p=0,005), PA diastólica (PAD) (p=0,007), PA média (PAM) (p=0,004), variação da PAD (p=0,032), variação da PAM (p=0,003), IMC (p=0,046), variação do IMC (p=0,020), insulina (p=0,019), HOMA-IR (p=0,021), E-selectina (p=0,032) e menores médias de adiponectina (p=0,016), além de maiores prevalências de diabetes mellitus/intolerância à glicose (p=0,022) e hiperinsulinemia (p=0,038); 3) Houve correlação significativa e positiva da VOP com PAS (p<0,001), PAD (p<0,001), PP (p=0,048) e PAM (p<0,001) de A2, com a variação da pressão arterial (PAS, PAD e PAM) (p<0,001) entre as duas avaliações, com o IMC de A2 (p=0,005) e com a variação do IMC (p<0,001) entre as duas avaliações, com CA (p=0,001), LDLcolesterol (p=0,049) e E-selectina (p<0,001) e correlação negativa com HDLcolesterol (p<0,001) e adiponectina (p<0,001); 4)Em modelo de regressão múltipla, após ajuste do HDL-colesterol, LDLcolesterol e adiponectina para sexo, idade, IMC e PAM, apenas o sexo masculino e a PAM mantiveram correlação significativa com a VOP. A VOP em adultos jovens mostrou relação significativa com variáveis de risco cardiovascular, destacando-se o sexo masculino e a PAM como importantes variáveis no seu determinismo. Os achados sugerem que a medida da VOP pode ser útil para a identificação do acometimento vascular nessa faixa etária.

Uso das técnicas de microbalança de cristal de quartzo e espectroscopia fotoacústica para estudo e monitoramento do processo de fotocura de resinas odontológicas

As resinas fotocuradas são amplamente utilizadas em odontologia. Este processo de cura é assistido pela luz visível que promove ligações químicas que as endurecem. Nesta dissertação, as resinas odontológicas fotocuradas comerciais das marcas Opallis Flow A1, A2, AO 3,5, T, Opallis DA2, Natural Flow e Ebecryl 3720-TP25 foram caracterizadas empregando as técnicas de microbalança de cristal de quartzo (QCM) e espectroscopia fotoacústica (PAS) à temperatura ambiente. A espectroscopia fotoacústica foi utilizada para avaliar a região do espectro eletromagnético responsável pela fotocura das resinas odontológicas. Desta forma, conhecendo-se o comprimento de onda da absorção da resina, possibilitou realizar o processo de fotocura. Adicionalmente, foi possível monitorar o processo de fotocura com a técnica de microbalança. A frequência de ressonância do cristal da microbalança se modifica com a fotocura das resinas estudadas. Deste modo, foi possível estimar por QCM, o tempo de cura para os comprimentos de ondas caracterizados por PAS.

Propriedades adesivas a substratos abióticos e bióticos, invasão e indução de apoptose celular de Corynebacterium pseudodiphtheriticum

A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento.

Ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante por ExoU de Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante

Papel regulatório da proteína anexina-1 e de seu derivado Ac2-26 no modelo experimental de asma alérgica em camundongos

A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma.