Susceptibilidade de pacus, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887), sob hipoxia aos agrotóxicos organofosforados

A ação inibitória dos organofosforados sobre as esterases, por ser específica, pode ser empregada como um eficiente biomarcador da exposição de seres vivos aos organofosforados. A inibição da acetilcolinesterase (AChE; EC 3.1.1.7) provoca acúmulo do neurotransmissor acetilcolina nas fendas sinápticas colinérgicas, o que pode resultar na morte do indivíduo. Outra atividade também afetada por organofosforados é a da enzima carboxilesterase (CarbE; EC 3.1.1.1). CarbE estão envolvidas na fase I da biotransformação de xenobióticos e atuam como captadoras (scavengers) de organofosfatos, incluindo os formados pela biotransformação dos organofosforados. As CarbE estudadas até hoje se ligam com maior velocidade aos organofosfatos do que as colinesterases. Por isto se admite que CarbE possam diminuir, por captação estequiométrica, a ligação tóxica de moléculas de organofosfatos às acetilcolinesterases das sinapses colinérgicas e das placas motoras dos músculos. Experimentos realizados em nosso laboratório mostraram que a atividade da CarbE está aproximadamente 50% menor no soro e no fígado de pacus submetidos à hipoxia. Por causa disso, em razão de uma possível diminuição da capacidade captadora da CarbE, decidimos verificar se o pacu em hipoxia seria mais sensível aos agrotóxicos organofosforados. Para este propósito foram colocados seis pacus divididos em dois tanques. No primeiro tanque, os animais foram submetidos a 24 horas de hipoxia seguidos por mais 4 horas de exposição ao organofosforado metilparation em duas concentrações diferentes (0,02 ou 0,01 mg / L). No segundo tanque os animais permaneceram em normoxia durante o mesmo período de 24 horas e depois foram expostos ao metilparation como no primeiro tanque. As atividades da AChE ensaiada com acetiltiocolina, a da butirilcolinesterase (BChE) ensaiada com butiriltiocolina e a da CarbE ensaiada com p-nitrofenilacetato foram avaliadas no soro, fígado, cérebro, músculo e coração dos pacus. Houve redução de aproximadamente 35% da atividade de CarbE no soro dos pacus submetidos a 24 horas de hipoxia. Uma queda de 85% na atividade de CarbE do soro foi observada nos animais que sofreram hipoxia e subsequente exposição a 0,02 mg de metilparation por litro. Com metilparation a 0,01 mg/L a diminuição observada foi de 48,2%. No músculo dos pacus expostos a 0,02 mg/L, as atividades de AChE e BChE cairam pela metade quando os mesmos foram submetidos à hipoxia quando comparados a animais que permaneceram em normoxia. Nos diversos tecidos dos pacus expostos a 0,01 mg/L de metilparation não observamos diferenças significativas nas atividades de AChE, BChE ou CarbE. Concluímos que a duplicação da concentração de metilparation de 0,01 para 0,02 mg/L levou à atividade residual de CarbE do soro de 51,8% para 15%. A ausência de mudanças nas atividades das esterases dos tecidos de animais expostos a 0,01 mg/L entre os grupos hipoxia e normoxia deve ter ocorrido porque a concentração de organofosforado não foi suficiente para superar a primeira barreira de proteção das esterases séricas e atingir os tecidos. Mas, no experimento com 0,02 mg/L de metilparation, as inibições de AChE e de BChE no músculo dos animais em hipoxia podem ser explicadas pela diminuição da atividade de CarbE do soro dos pacus.

Carboxilesterase como biomarcador de hipoxia em peixes

Quando as esterases acetilcolinesterase (AChE), butirilcolinesterase (BChE) e carboxilesterase (CarbE) hidrolisam ésteres de fosfato seus sítios ativos sofrem fosfatação inibitória. Por isto, tal fosfatação pode proteger seres vivos contra o espalhamento de xenobióticos organofosforados dentro de seus corpos, já que estas enzimas têm a capacidade de captar moléculas de pesticidas organofosforados estequiometricamente. Os organismos terrestres vivem em um ambiente com mais oxigênio do que os organismos aquáticos. Na água, quando o nível de oxigênio atinge aproximadamente 2,6 mg/L o ambiente está em hipoxia. Este fenômeno afeta ecossistemas aquáticos, uma vez que muitos organismos não conseguem se adaptar à baixa do oxigênio. Estudamos peixes em hipoxia e hiperoxia para entender melhor a bioquímica do funcionamento de suas enzimas captadoras de organofosforados quando eles estão expostos às variações físico-químicas de seus habitats. Dois grupos de no mínimo seis pacus (Piaractus mesopotamicus), seis peixes dourados (Carassius auratus auratus), seis tilápias (Oreochromis niloticus niloticus), seis piavussus (Leporinus macrocephalus), seis apaiaris (Astronotus ocellatus), ou seis carpas (Cyprinus carpio carpio) foram aclimatados à temperatura ambiente em dois aquários de 250 L. No primeiro aquário, pelo menos três animais ensaio de cada espécie sofreram hipoxia por diminuição da concentração de oxigênio até 0,5 mg/L através de borbulhamento de nitrogênio na água. Quando estes animais atingiram a hipoxia foram mantidos a 0,5 mg/L de oxigênio por 6, 8, 24 ou, no máximo, por 42 horas. Três peixes controle de cada espécie foram mantidos em normoxia (4,5 até 7,0 mg/L de oxigênio). Após estes tempos houve a retirada de cerca de 3,5 mL de sangue e dos fígados. Depois de coagular, o sangue foi centrifugado para retirada do soro sobrenadante, que foi usado como amostra para ensaios das esterases. Os fígados foram armazenados em freezer a -70 C e, no momento do ensaio, homogeneizados e centrifugados para obter as frações citosólica e microssomal. As atividades das esterases foram ensaiadas em espectrofotômetro com os substratos acetiltiocolina, butiriltiocolina ou p-nitrofenilacetato. As atividades sobre p-nitrofenilacetato (CarbE) do soro e do fígado sofreram queda em todos os exemplares das espécies submetidos à hipoxia. Tipicamente, esta atividade caiu cerca de 50% nos soros de pacus mantidos por 42 h sob concentrações de oxigênio abaixo de 1,0 mg/L. O tempo para que ocorresse a queda desta atividade enzimática variou de espécie para espécie.

Curso temporal dos efeitos da exposição à nicotina durante a lactação no sistema colinérgico cerebral de ratos

A Organização Mundial da Saúde estima que existam aproximadamente 250 milhões de mulheres tabagistas no mundo. Em países em desenvolvimento, a prevalência do tabagismo pode variar de 11 a 35% em mulheres grávidas, constituindo um problema de saúde pública. Nicotina, um agonista colinérgico considerado o mais importante componente ativo da fumaça do cigarro, é capaz de causar déficits em um cérebro em desenvolvimento, no entanto, muitos estudos investigam estes efeitos durante a gestação de roedores, que corresponde aos dois primeiros trimestres de gestação em humanos. O presente estudo, foi focado nos efeitos da nicotina sobre o sistema colinérgico cerebral durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos. Ratas lactantes foram expostas a nicotina (NIC, 6 mg/Kg/dia) ou a salina (SAL) via mini-bombas osmóticas (s.c.) a partir do 2 dia ate o 16 dia pós-natal (PN). Filhotes NIC e SAL foram sacrificados durante a exposição, em PN15, e após a retirada em três momentos diferentes, PN21, PN30 e em PN90. Quatro biomarcadores foram considerados. Para avaliação dos efeitos sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs), nós utilizamos [3H]citisina, que é um ligante seletivo para α4β2. Nos também medimos o marcador [3H]hemicholinium-3 (CH-3) de alta afinidade para o transportador pré-sináptico de colina, e a atividade das enzimas colina acetiltransferase (ChAT) e acetilcolinesterase (AChE) no córtex cerebral (CX), mesencéfalo (MB) e hipocampo (HP) na prole. O grupo NIC apresentou supra-regulação de nAChRs em todas as regiões durante a exposição, este efeito foi revertido pouco tempo após a retirada. Interessantemente, uma significante infra-regulação de nAChRs foi observada após um longo tempo da retirada somente em CX. A exposição à nicotina reduziu a marcação para HC-3 durante a exposição em todas as regiões e foi revertida em PN21. Já em PN30, o grupo NIC apresentou uma diminuição do HC-3. Em contraste, em PN90, foi observado um aumento de HC-3. Não foram observados efeitos para atividade da ChAT e da AChE em CX. No que diz respeito ao MB, o grupo NIC apresentou um aumento de atividade para ambas as enzimas, ChAT e AChE, em PN30. Para a mesma idade, nos observamos um decréscimo desta atividade somente em HP. E, após um longo tempo de retirada, somente HP apresentou um aumento na atividade da ChAT. Estes dados sugerem que a exposição à nicotina em ratos durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos promove alterações no sistema colinérgico dos filhotes. Somado a isto, nossos resultados indicam que os efeitos prejudiciais são observáveis mesmo muito tempo após a exposição ter sido interrompida.

Neurotoxicidade de pesticidas organofosforados durante o desenvolvimento: alterações bioquímicas e comportamentais

Pesticidas organofosforados são amplamente usados e seu uso constitui um grave problema de saúde pública. A ação clássica destes compostos é a inibição irreversível da acetilcolinesterase, promovendo acúmulo de acetilcolina nas sinapses e hiperestimulação colinérgica. No entanto, as consequências da exposição a baixas doses podem se estender a outros mecanismos de ação e sistemas neurotransmissores. Considerando que crianças constituem um grupo particularmente vulnerável aos efeitos de pesticidas, neste trabalho investigamos os efeitos da exposição aos organofosforados metamidofós (MET) e clorpirifós (CPF) durante o desenvolvimento sobre os sistemas colinérgico e serotoninérgico e sobre o comportamento de camundongos. Para isso, camundongos suíços foram expostos a injeções subcutâneas de MET, clorpirifós ou veículo do terceiro (PN3) ao nono (PN9) dias de vida pós-natal. As doses de exposição foram previamente escolhidas através da construção de uma curva dose-resposta que identificou como mais adequadas para este estudo as doses de 1mg/kg de MET e 3mg/kg de CPF, as quais promoveram em torno de 20% de inibição da acetilcolinesterase. Em PN10, parte dos animais foi sacrificada e foram avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico no tronco encefálico e córtex cerebral. De PN60 a PN63, os animais foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais. Em seguida, estes animais também foram sacrificados tendo sido avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico. Em PN10, MET e CPF causaram alterações que sugerem aumento da atividade colinérgica respectivamente no tronco e córtex em fêmeas. No sistema serotoninérgico, apenas CPF promoveu alterações, aumentando a ligação ao receptor 5HT1A e transportador 5HT em fêmeas e diminuindo na ligação ao 5HT2. Em PN63, a atividade da acetilcolinesterase foi reestabelecida em todos os grupos. Ainda assim, MET diminuiu a atividade da colina acetiltransferase no córtex e a ligação ao transportador colinérgico no tronco. Quanto aos efeitos do CPF, no tronco, houve redução da atividade da colina acetiltransferase em fêmeas e aumento em machos. Sobre o sistema serotoninérgico, MET e CPF promoveram diminuições no 5HT1A respectivamente no tronco e córtex das fêmeas e CPF aumentou a ligação no córtex de machos. A ligação ao 5HT2 foi aumentada após o tratamento com MET e ao transportador 5HT foi diminuída em fêmeas após o tratamento com clorpirifós. Sobre o comportamento, identificamos comportamento associado à depressão em animais expostos a MET e aumento dos níveis de ansiedade, além de prejuízo de aprendizado/memória após exposição à CPF. Desta forma, nossos resultados indicam que a exposição à metamidofós e clorpirifós durante o desenvolvimento é capaz de alterar, de diferentes formas, a atividade colinérgica e serotoninérgica, mesmo que as doses de exposição sejam toxicologicamente equivalentes. Foram verificados efeitos nas vias neuroquímicas logo após a exposição e após um longo período de interrupção do tratamento, indicando efeitos tardios em sistemas importantes que podem estar associados às alterações comportamentais. Finalmente, o presente estudo reforça a associação epidemiológica entre pesticidas e alterações psiquiátricas e a capacidade da programação de alterações a longo-prazo quando a exposição se dá durante o desenvolvimento.