A modulação da via do AMPc/PKA altera a morfologia da oligodendroglia e a distribuição das proteínas CNPase e MAG in vitro

A diferenciação da oligodendroglia depende de alterações coordenadas no citoesqueleto e na sua relação com a membrana plasmática, um componente importante para a formação da bainha de mielina. A 23 nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) está relacionada com a organização do citoesqueleto, sendo uma proteína ancoradoura de microtúbulos na membrana plasmática. In vitro, a CNPase compõe, com a F-actina e os microtúbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoproteína associada a mielina (MAG), também é importante para a formação dos véus de membrana e está associada a CNPase e a tubulina. Além disso, as três proteínas podem ser reguladas pela via de sinalização do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulação da diferenciação oligodendroglial, culturas de hemisférios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as células das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos véus de membrana quando comparadas às culturas controle. O tratamento com SQ também causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a redução no tamanho dos prolongamentos e nos véus de membrana. Com 24 h, as células tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, já as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram redução no véu de membrana. Observamos também alterações na distribuição da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentração próxima ao núcleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padrão puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentração próximo ao núcleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ também reduziu a distribuição da MAG nos véus de membrana. A mesma redução foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforçam a participação da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formação dos prolongamentos, suas ramificações e ainda a formação dos véus de membrana, com prováveis consequências na formação e manutenção da bainha de mielina.

Estudo de polimorfismos nos genes TP53 e p21(WAF1) e do perfil imunohistoquímico das proteínas p53, p21(WAF1), p16(INK4a) e ciclina D1 pela técnica de Tissue Microarray (TMA) e sua importância para o desenvolvimento e/ou severidade das neoplasias cervicais

O câncer de colo do útero é o terceiro tipo de câncer mais frequente em mulheres no mundo, e a infecção persistente pelo papilomavirus humano (HPV) oncogênico é condição necessária, mas não suficiente para seu desenvolvimento. As oncoproteínas virais E6 e E7 interferem direta ou indiretamente na ação de várias proteínas celulares. Entretanto, as variantes proteicas, resultantes de polimorfismos genéticos, podem apresentar comportamento distinto mediante a infecção pelo HPV. O objetivo deste estudo foi avaliar possíveis associações entre polimorfismos nos genes TP53 (p53 PIN3, p53 72C>G) e p21 (p21 31C>A) e o desenvolvimento de neoplasias cervicais, considerando os níveis de expressão das proteínas p53, p21, p16 e ciclina D1, e fatores de risco clássicos para o câncer cervical. Foram selecionadas 466 mulheres residentes no Rio de Janeiro, 281 com diagnóstico histopatológico de neoplasia cervical de baixo (LSIL) e alto grau (HSIL) e câncer (grupo de casos) e 185 sem história atual ou pregressa de alteração citológica do colo uterino (grupo controle). A técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), foi empregada na análise dos polimorfismos p53 72C>G e p21 31C>A, usando as enzimas de restrição BstUI e BsmaI, respectivamente. A avaliação do polimorfismo p53 PIN3 (duplicação de 16 pb) foi feita por meio da análise eletroforética direta dos produtos de PCR. A expressão das proteínas p53, p21, p16, ciclina D1 e Ki-67 e a pesquisa de anticorpos anti-HPV 16 e HPV pool foram avaliadas por imunohistoquímica (Tissue Microarray - TMA) em 196 biópsias do grupo de casos. O grupo controle se mostrou em equilíbrio de Hardy-Weinberg em relação aos três polimorfismos avaliados. As distribuições genotípicas e alélicas relativas a p53 PIN3 e p53 72C>G nos grupos controles e de casos não apresentaram diferenças significativas, embora o genótipo p53 72CC tenha aumentado o risco atribuído ao uso de contraceptivos das pacientes apresentarem lesões mais severas (OR=4,33; IC 95%=1,19-15,83). O genótipo p21 31CA(Ser/Arg) conferiu proteção ao desenvolvimento de HSIL ou câncer (OR=0,61, IC 95%=0,39-0,97), e modificou o efeito de fatores de risco associados à severidade das lesões. A interação multiplicativa de alelos mostrou que a combinação p53 PIN3A1, p53 72C(Pro) e p21 31C(Ser), representou risco (OR=1,67, IC95%=1,03-2,72) e a combinação p53 PIN3A1, p53 72C(Pro) e p21 31A(Arg) conferiu efeito protetor (OR=0,26, IC95%=0,08-0,78) para o desenvolvimento de HSIL e câncer cervical. Observou-se correlação positiva da expressão de p16 e p21 e negativa da ciclina D1 com o grau da lesão. A distribuição epitelial de p16, Ki-67, p21 e p53 se mostrou associada à severidade da lesão. Os polimorfismos analisados não apresentaram associação com a expressão dos biomarcadores ou positividade para HPV. Nossos resultados sugerem a importância do polimorfismo p21 31C>A para o desenvolvimento das neoplasias cervicais e ausência de correlação dos polimorfismos p53 PIN3 e p53 72C>G com a carcinogênese cervical, embora alguns genótipos tenham se comportado como modificadores de risco. Nossos resultados de TMA corroboram o potencial de uso de biomarcadores do ciclo celular para diferenciar as lesões precursoras do câncer cervical.

Efeitos tardios no tecido ovariano de ratas Wistar após tratamento com Docetaxel e Ciclofosfamida

O câncer de mama (CM) é o segundo tipo de câncer mais comum no mundo. Sabe-se que a maior incidência de CM ocorre nas mulheres pós-menopausa, entretanto é crescente o número de mulheres jovens acometidas por esta doença. O tratamento do CM pode incluir: quimioterapia, radioterapia e/ou hormonioterapia. A quimioterapia, por se ser um tratamento sistêmico, pode causar importantes efeitos colaterais, entre eles a falência ovariana induzida por quimioterapia (FOIQ). As principais consequências da FOIQ são a infertilidade, além de complicações tardias relacionadas à diminuição do estrogênio, como a osteoporose e doenças cardiovasculares. O regime quimioterápico TC, adota a associação do docetaxel com a ciclofosfamida, como uma opção por fármacos que resultem numa taxa de sobrevida livre do câncer, e menores efeitos colaterais. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos tardios no ovário causados pelo tratamento com a associação dos quimioterápicos docetaxel e ciclofosfamida (TC), em modelo animal com ratos Wistar. Para verificar o sinergismo desses quimioterápicos e assim analisar o efeito da administração conjunta, ratos Wistar fêmeas foram divididos em dois grupos: um grupo controle e um grupo que recebeu quimioterapia (TC). Os animais foram submetidos a eutanasia cinco meses após o fim do tratamento, e foram recolhidos o plasma e os ovários. Foram observadas alterações importantes. O nível de estradiol no plasma foi significativamente reduzido no grupo de TC em comparação com o grupo controle. Além disso, o número de núcleos apoptóticos foi maior no grupo TC. O papel da resposta inflamatória no desenvolvimento da lesão ovariana foi também investigado, e notou-se um aumento do número de mastócitos, e aumento da expressão de Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) no grupo TC. O envolvimento de fibrose nesse processo, foi também investigado. Os resultados mostraram que níveis de expressão de Fator de Crescimento Tumoral-β1 (TGF-β1), Colágeno Tipo I (Col-I) e Colágeno Tipo III (Col-III) estavam maiores no grupo TC em comparação com o grupo de controle. A análise ultraestrutural revelou a presença de feixes de colágeno no grupo tratado, e mostrou que a arquitetura do tecido do ovário estava mais desorganizada neste grupo comparado ao grupo controle. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a combinação de ciclofosfamida e docetaxel, um recente regime quimioterápico proposto para o tratamento do CM, pode levar a importantes alterações no ovário. O processo inflamatório, desencadeado pela administração dos quimioterápicos, estimula a apoptose e liberação de TGF-β no estroma ovariano, que induz a produção de matriz extracelular e subsequente, substituição do tecido sadio por tecido fibrótico. A principal consequência deste processo é a diminuição, ou perda, da função ovariana, levando à menopausa precoce e possível infertilidade. É importante compreender os mecanismos envolvidos na infertilidade provocada pelo regime TC, a fim de estudar novos métodos que evitem este efeito indesejável em mulheres submetidas a tratamento do CM.

Sinalização da MAPK/ERK na diferenciaçãao da oligodendroglia: efeitos de inibidores da MEK sobre a morfologia e distribuição de proteínas de oligodendrócitos/mielina in vitro

A via de sinalização da cinase regulada por fatores extracelulares, da família das proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK/ERK) é importante tanto para a sobrevivência como para a progressão da diferenciação de oligodendrócitos. Neste trabalho, a via da MAPK/ERK foi avaliada na oligodendroglia in vitro com a utilização de inibidores da MEK. A morfologia celular, assim como a distribuição de proteínas foram analisadas em diferentes estágios de maturação da oligodendroglia. Culturas primárias de oligodendrócitos foram tratadas com os inibidores da MEK PD98059 ou U0126, aos 5 ou 11dias in vitro (div), por 30min, 24 ou 48h. A oligodendroglia foi distinguida com marcadores estágio-específicos: A2B5, 23nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) e proteína básica de mielina (MBP), e classificada de acordo com sua morfologia em diferentes estágios de desenvolvimento. O tratamento aumentou significativamente o número de células com morfologia mais imatura e diminuiu o número de células maduras. Além disso, aumentou o número de células redondas e sem prolongamentos as quais não puderam ser classificadas em nenhum dos estágios de desenvolvimento da oligodendroglia. Os efeitos mais evidentes foram observados logo após o menor tempo de tratamento. Células redondas eram positivas para CNPase e MBP, porém não foram marcadas com A2B5 ou com NG2, indicando que seriam células maduras incapazes de estender ou manter seus prolongamentos. De fato, estas mudanças foram acompanhadas por alterações na distribuição de proteínas de oligodendrócitos como a MBP e a CNPase, assim como alterações em proteínas de citoesqueleto, como actina, tubulina e na cinase de adesão focal (FAK). A MBP foi observada nas células tratadas em um padrão de distribuição desorganizado e disperso, oposto ao padrão contínuo que é observado nas células das culturas controle. Além disso, o tratamento causou uma desorganização na distribuição da CNPase, actina e tubulina. Nas células das culturas controle, estas proteínas apresentam um padrão organizado compondo as estruturas de citoqueleto semelhantes a nervuras. Após um pequeno período de tratamento (30min), actina e tubulina apresentaram o mesmo padrão de marcação puntiforme que a CNPase apresentou. O tratamento também reduziu os pontos de adesão focal demonstrados pela FAK. Com o decorrer do tratamento, após 24 e 48h, actina e tubulina aparentavam estar se reorganizando em um padrão filamentar. Estes resultados indicam um efeito importante da via da MAPK/ERK na ramificação e alongamento dos prolongamentos dos oligodendrócitos, com possíveis consequências para a formação da bainha de mielina.

Análise do pênis de rato após administração crônica de esteróide anabólico androgênico

Esteróides Anabolizantes Androgênicos (EAA) têm sido usados por atletas com o objetivo de melhorar a massa muscular. O abuso de EAA está associado com distúrbios urogenitais, inclusive com disfunção erétil. Contudo as alterações morfológicas penianas decorrentes do uso de EAA não foram descritas. O objetivo é avaliar as alterações morfológicas do pênis de ratos púberes e adultos tratados cronicamente com doses supra-fisiológicas de EAA. No trabalho foram usados quarenta e oito ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos: ratos controle, com 105 dias (C105) e com 65 dias de idade (C65) submetidos a injeção de veículo e ratos tratados, com 105 dias (T105) e com 65 dias de idade (T65), submetidos à injeção de decanoato de nandrolona na dose de 10 mg/Kg, uma vez por semana, durante oito semanas. Os ratos foram mortos, seus pênis foram coletados, fixados e processados de maneira rotineira para histologia. Cortes de 5m de espessura foram corados com Tricrômico de Masson, Vermelho de Picrosirius e analisados em microscopia de luz. As densidades de superfície do espaço sinusoidal, músculo liso e tecido conjuntivo do corpo cavernoso foram calculadas pelo método de contagem de pontos. A área do pênis, do corpo cavernoso (com e sem túnica albugínea) e da túnica albugínea foram medidos em cortes transversais. As médias dos grupos foram comparadas pelo teste t de Student. Em todos os casos, a significância foi fixada em um valor de probabilidade de 0,05. Nos resultados entre outras diferenças, destaca-se uma diminuição do corpo cavernoso sem túnica albugínea de 12,5% no grupo T105 e de 10,9% no grupo T65, em comparação com os seus controles. A densidade de superfície de músculo liso cavernoso apresentou uma diminuição de 5,6% e 12,9% nos grupos T65 e T105, comparando-se com os seus controles. O espaço sinusoidal aumentou em 17% no grupo T105 e diminuiu em 9,6% no grupo T65. Concluimos que o uso de altas doses de EAA promoveu mudanças estruturais no pênis dos ratos adultos, e estas podem estar envolvidas na disfunção erétil.