Influência das alterações imunes em gestantes infectadas pelo HIV-1 no perfil funcional das células T de neonatos não infectados

O número de mulheres jovens infectadas pelo HIV-1 vem crescendo desde o início da epidemia da aids, principalmente nos países em desenvolvimento, onde a frequência de gravidez é elevada. O desenvolvimento de estratégias para evitar a transmissão vertical tem aumentado o número de recém-nascidos não infectados nascidos de gestantes portadora do vírus. O objetivo da presente tese foi avaliar, in vivo e in vitro, o perfil de citocinas de neonatos não infectados, porém nascidos de mulheres infectadas pelo HIV-1. Os resultados demonstraram elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias relacionadas ao fenótipo Th17, associadas à baixa produção de IL-10, tanto nos plasmas quanto nos sobrenadantes das culturas de células T ativadas obtidas do sangue do cordão umbilical de neonatos nascidos de gestantes infectadas pelo HIV-1 com cargas virais plasmáticas(PVL) detectáveis. De modo interessante, um perfil similar pró-inflamatório foi observado em amostras de sangue periférico de suas respectivas mães. Por outro lado, níveis elevados de IL-10, associados à reduzida produção de citocinas inflamatórias, foram dosados no sangue e nos sobrenadantes das culturas de células T ativadas de gestantes que controlavam a PVL, assim como de seus neonatos. Com relação à caracterização fenotípica das células T maternas produtoras de IL-10, a análise por citometria de fluxo demonstrou que essa citocina é majoritariamente produzida por células T CD4+Foxp3-. Curiosamente, a replicação viral in vitro do HIV-1 foi inferior nas culturas das gestantes infectadas pelo HIV-1 e foi relacionada aos efeitos inibitórios da IL-10 sobre a produção de TNF-α. Por fim, os neonatos não infectados expostosin utero à terapia antirretroviral (ART) apresentaram um menor peso ao nascer, e este achado foi inversamente correlacionado com os níveis periféricos maternos de TNF-α. Em conclusão, nossos achados sugerem que gestantes que conseguem controlar a PVL, e o incremento na produção de IL-10 materna possam favorecer a expansão das células Tr-1, as quais podem auxiliar em reduzir o risco de transmissão vertical do HIV-1 por reduzir a taxa de replicação viral. Por outro lado, outros resultados também apresentados aqui, apesar de preliminares, revelaram efeitos adversos da replicação viral e da ART em gestantes infectadas pelo HIV-1 no desenvolvimento funcional das células T de neonatos não infectados. Esses dados podem ajudar a explicar por que algumas dessas crianças apresentam elevado risco à morbidade e mortalidade devido a um estado basal de hipersensibilidade patológica.

Avaliação da resposta imune de neonatos não infectados pelo HIV-1 nascidos de gestantes soropositivas

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), é uma das mais destrutivas epidemias do mundo, e a infecção pelo HIV em mulheres jovens vem aumentando rapidamente nos dias atuais. Esse fato tem um impacto importante na transmissão vertical do vírus. Apesar da grande maioria dos casos de aids pediátrica em todo mundo resultar da transmissão vertical, aproximadamente dois terços das crianças expostas ao HIV durante a vida fetal não são infectadas pelo vírus. Muitos trabalhos sugerem que durante a gestação doenças infecciosas maternas podem ter consequências complexas para o desenvolvimento do feto, e poucos trabalhos têm explorado o impacto da exposição ao HIV sobre a responsividade imunológica de crianças não infectadas a diferentes estímulos, particularmente na era das drogas antirretrovirais. Portanto, esse trabalho teve como objetivo avaliar eventos imunes em neonatos não-infectados expostos ao HIV-1 nascidos de gestantes que controlam (G1) ou não (G2) a carga viral plasmática, usando neonatos não expostos como controle. Para tanto, sangue do cordão umbilical de cada neonato foi coletado, plasma e células mononucleares foram separados e a linfoproliferação e o perfil de citocinas foram avaliados. Os resultados demonstraram que a linfoproliferação in vitro induzido por ativadores policlonais foi maior nos neonatos do G2. Entretanto, nenhuma cultura de célula respondeu a um conjunto de peptídeos sintéticos do envelope do HIV-1. A dosagem de citocinas no plasma e nos sobrenadantes das culturas ativadas policlonalmente demonstrou que, enquanto a IL-4 e IL-10 foram as citocinas dominantes produzidas nos grupos G1 e controle, a secreção de IFN-γ, IL-1, Il-6, IL-17 e TNF-α foi significativamente superior nos neonatos G2. Níveis sistêmicos de IL-10 observados dentre os neonatos G1 foram maiores naqueles nascidos de mães tratadas com drogas inibidoras da transcriptase reversa do vírus. Por outro lado, níveis superiores de citocinas inflamatórias foram observados dentre estes nascidos de gestantes tratadas com terapia antirretroviral de alta eficácia. Em resumo, nossos resultados indicam uma responsividade imune alterada em neonatos expostos in utero ao HIV-1 e reforça o papel do tratamento materno anti-viral com drogas menos potentes em atenuar tais distúrbios.

Estudo do metabolismo mitocondrial e da resposta anti-apoptótica de células endoteliais humanas durante a evolução da infecção por taquizoítos de Toxoplasma gondii

A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. A toxoplasmose é amplamente investigada visto que se apresenta como uma doença grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), não tratados, indivíduos transplantados, paciente em tratamento quimioterápico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congênita frequentemente pode levar ao aborto espontâneo ou até mesmo resultar na formação de crianças com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou físicos, deste modo, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulação sanguinea são capazes de infectar as células endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associação a inúmeras outras doenças, assim, estudos sobre a evolução da infecção por T. gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Ao invadir a célula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocôndrias promovendo mudanças na organização mitocondrial ao longo da progressão da infecção, garantindo um ambiente favorável a sua multiplicação. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apoptótica da célula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial através da respirometria de alta-resolução e da resposta apoptótica através do western blotting das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizoítos de T. gondii. A respirometria de alta-resolução revelou que o parasito interfere no metabolismo energético da célula hospedeira. A análise do conteúdo de proteínas da família Bcl-2 por western blotting revelou maior estímulo apoptótico no tempo inicial de infecção, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos conteúdos de caspase 3, proteína efetora da apoptose, não demonstrou diferença nos tempos iniciais de infecção Entretanto, em tempos mais tardios, o conteúdo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado às HUVEC não infectadas. A dinâmica de replicação do parasito foi observada através do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das células infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozoário ao recrutar as mitocôndrias da célula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulação da apoptose para garantir um ambiente favorável a sua multiplicação.

Efeitos da terapia periodontal na função endotelial e na expressão de marcadores inflamatórios sistêmicos

A periodontite é uma doença infecciosa, crônica e altamente prevalente causando uma resposta inflamatória. A infecção e a inflamação são consideradas a base etiológica para o desenvolvimento da aterosclerose. Recentes estudos indicam que a periodontite severa pode influenciar o aumento de marcadores inflamatórios e de disfunção endotelial associados com o aumento de risco da doença coronariana e o acidente vascular cerebral. Embora alguns estudos tenham sugerido esta associação, os reais efeitos do tratamento da doença periodontal sobre a rede complexa de marcadores envolvidos na aterosclerose são pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da terapia periodontal nos biomarcadores inflamatórios (TNF-α, fibrinogênio, PCRus, INFγ, IL-1β, IL-6 e IL-10), perfil lipídico (CT, HDL, LDL, TG, oxLDL e anti-oxLDL) e função endotelial (IMT) das artérias carótidas. Um total de trinta e dois indivíduos saudáveis sistemicamente e afetados pela periodontite severa (16 mulheres, 16 homens; 51,87 anos de idade), incluindo 17 sujeitos para o grupo teste e 15 sujeitos para o grupo controle foram recrutados para o estudo. A ultrassonografia das artérias carótidas e os níveis séricos inflamatórios foram avaliados no início, 40 e 100 dias após o tratamento periodontal não-cirúrgico, comparando tempo e grupos. O tratamento periodontal resultou em significante redução dos parâmetros da doença periodontal. O grupo que recebeu tratamento mostrou decréscimos significativos de oxLDL (P<0.0001), anti-oxLDL (P<0,0001), TNF-α (P<0,0001), fibrinogênio (P=0,008), INFγ (P<0,0001), IL-1β (P<0,0001), IL-6 (P<0,0001), IMT (P=0,006) e significante aumento de IL-10 (P<0,0001) após 100 dias do tratamento periodontal comparando com grupo controle. Entretanto, os resultados não foram significativos para PCRu (P=0,109), colesterol total (P=0,438), HDL (P=0,119), LDL (P=0,425) e triglicerídeos (P=0,939). Com base nestes resultados, o tratamento da periodontite pode melhorar o perfil inflamatório e a função endotelial, sendo uma importante ferramenta adicional para a prevenção das doenças cardiovasculares.

Distribuição da caspase-3 clivada no cerebelo de ratos durante o desenvolvimento em um modelo de hipóxia-isquemia sistêmica pré-natal

A Hipóxia-isquemia (HI) perinatal é um problema de saúde pública, e ocorrem aproximadamente 1,5 casos de encefalopatias por HI por 1000 nascidos vivos. Dos que sobrevivem 25-60% sofrem de deficiências permanentes do desenvolvimento neurológico, incluindo paralisia cerebral, convulsões, retardo mental, e dificuldade de aprender. Neurônios e oligodendrócitos, especialmente os progenitores, são os mais afetados pela HI. Existem vários modelos de HI, no entanto, poucos levam em consideração as intercorrências maternas, a importância da atividade placentária, e as trocas entre mãe-filho, que são clinicamente observadas em humanos. Robinson estabeleceu um modelo de HI sistêmica pré-natal transitório, onde o fluxo das artérias uterinas da rata grávida era obstruído por 45 minutos no décimo oitavo dia (E18) de gestação. Neste modelo foram observadas alterações que são similares às observadas em cérebros humanos que passaram por hipóxia perinatal, dentre as quais foram relatados aumento no nível de apoptose. Caspase-3 é descrita como uma enzima que atua na apoptose, e é amplamente utilizada como marcador para células apoptóticas. Vários autores vêm mostrando, entretanto, que a enzima caspase-3 pode estar ativada para fins não apoptóticos. No modelo de HI sistêmica pré-natal, foram observados astrogliose na substância branca, morte de oligodendrócitos, lesão em axônios tanto na substância branca como no córtex cerebral, e danos motores. Pouco se sabe da influencia do insulto HI no desenvolvimento do cerebelo, considerando que o cerebelo junto com o córtex motor, contribui para o controle motor. O objetivo desse trabalho foi avaliar a distribuição da caspase-3 clivada durante o desenvolvimento do cerebelo em um modelo de HI pré-natal. Os resultados deste trabalho demonstram que as células caspase-3 clivadas apresentaram duas morfologias distintas em ambos os grupos. Uma onde a caspase-3 foi observada apenas no núcleo, oscilando entre células com imunorreatividade fraca a intensa, e de células com a presença da caspase-3 no corpo celular, nos prolongamentos condensados e presença de fragmentos ao redor do soma, morfologia típica de célula em apoptose. A HI pré-natal, assim como nos hemisférios cerebrais, levou ao aumento de células caspase-3 clivadas com morfologia de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo do grupo HI em P2, mas não em P9 e P23. Também foi demonstrado que a HI pré-natal não levou a uma ativação da apoptose em oligodendrócitos, neurônios e microglia (identificados por seus respectivos marcadores, CNPase, NeuN e ED1) apresentando marcação no núcleos de células GFAP+, na substância branca, camada granular e nas células da glia de Bergmann, em P9 e P23 no cerebelo. Podemos concluir que a HI pré-natal aumentou o número de células imunorreativas para a caspase-3 em um período crítico do desenvolvimento da oligodendroglia no cerebelo, e que a diminuição de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo decorrente do insulto pré-natal visto em trabalhos anteriores, pode estar relacionada a morte celular por apoptose, embora não se possa descartar a hipótese da participação dessas células que apresentam caspase-3 clivada em outros eventos não apoptóticos desencadeados pela hipóxia-isquemia.

Perfil de secreção de citocinas e de ativação de células endoteliais após interação com cepas selvagens e mutantes de Aspergillus fumigatus

Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial.

Avaliação morfofuncional do complexo hipocampal em ratos submetidos a um modelo de hipóxia-isquemia pré-natal

A diminuição do aporte de oxigênio e nutrientes na vida perinatal resulta em danos, como astrogliose, morte de neurônios e de células proliferativas. Déficits cognitivos podem estar relacionados a danos no hipocampo. Neste trabalho avaliamos a citoarquitetura do giro dentado (DG) durante o desenvolvimento e a memória de ratos submetidos à HI. Para tal, utilizamos a técnica de imunohistoquímica para marcador de proliferação celular (KI67), neurônio jovem (DCX), de astrócitos (GFAP) e de óxido nítrico sintase neuronal (NOSn). Para avaliar a memória de curta e de longa duração foi utilizado o teste de reconhecimento de objetos (RO). Ratas Wistar grávidas em E18 foram anestesiadas (tribromoetanol) e as quatro artérias uterinas foram ocluídas com grampos de aneurisma (Grupo HI). Após 45 minutos, os grampos foram removidos e foi feita a sutura por planos anatômicos. Os animais do grupo controle (SHAM) sofreram o mesmo procedimento, excetuando a oclusão das artérias. Os animais nasceram a termo. Animais com idades de 7 a 90 dias pós-natal (P7 a P90), foram anestesiados e perfundido-fixados com paraformaldeído a 4%, e os encéfalos submetidos ao processamento histológico. Cortes coronais do hipocampo (20m) foram submetidos à imunohistoquímica para KI67, DCX, GFAP e NOSn. Animais P90 foram submetidos ao RO. Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética (CEA/019/2010). Observamos menor imunomarcação para KI67 no giro dentado de animais HI em P7. Para a marcação de DCX nesta idade não foi observada diferença entre os grupos. Animais HI em P15, P20 e P45 tiveram menor imunomarcação para DCX e Ki67 na camada granular. Animais P90 de ambos os grupos não apresentaram marcação para KI67 e DCX. Vimos aumento da imunomarcação para GFAP nos animais HI em todas as idades. A imunomarcação para NOSn nos animais HI foi menor em todas as idades. O maior número de células NOSn positivas foi visto em animais P7 em ambos os grupos na camada polimórfica. Em P15, animais HI apresentam células NOSn+ em todo o DG. Em P30 animais HI apresentam células NOSn+ nas camadas polimórfica e sub-granular. Animais adultos (P90) de ambos os grupos apresentam células NOSn positivas apenas nas camadas granular e sub-granular. Embora animais HI P90 não apresentaram déficits de memória, estes apresentaram menor tempo de exploração do objeto. Comportamento correspondente a déficits de atenção em humanos. Nossos resultados sugerem que HI perinatal diminui a população de células proliferativas, de neurônios jovens, de neurônios NOSn+, além de causar astrogliose e possivelmente déficits de atenção. O modelo demonstrou ser útil para a compreensão dos mecanismos celulares das lesões hipóxico-isquêmicas e pode ser usado para testar estratégias terapêuticas.