Diversidade de respostas de Corynebacterium diphtheriae frente a agentes oxidantes: resistência, adaptação e envolvimento do determinante de resistência ao telurito (TeR) e do sistema OxyR na virulência bacteriana

Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo.

Estudo das características fenotípicas e genotípicas de amostras de Corynebacterium pseudotuberculosis

Uma vez que C. pseudotuberculosis é o agente etiológico de processos infecciosos em animais caprinos e ovinos e que também pode ser isolado de processos infecciosos em seres humanos as investigações direcionadas para a espécie em questão são necessárias, visto que a escassez de dados epidemiológicos e de conhecimento relativo ao comportamento do microrganismo em hospedeiros animais e humanos em nosso país dificulta o diagnóstico laboratorial da espécie, à semelhança do observado com outra espécie de transmissão zoonótica, o C. ulcerans. Uma preocupação adicional é o fato da espécie em questão também ser capaz de albergar bacteriófagos codificadores da toxina diftérica, representando uma ameaça à circulação dos bacteriófagos. Assim, o presente estudo tem como objetivo geral analisar as características fenotípicas e genotípicas de amostras de C. pseudotuberculosis. Neste sentido, foram propostos os seguintes objetivos: Avaliar as características bioquímicas das amostras através de testes bioquímicos convencionais; avaliar as características bioquímicas das amostras utilizando o sistema semi-automatizado API Coryne; diferenciar amostras de C. pseudotuberculosis de C. ulcerans utilizando a técnica de PCR multiplex; pesquisar a presença de gene tox. Os resultados demonstraram que amostras de C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis podem ser caracterizadas por métodos bioquímicos convencionais e por taxonomia numérica (API Coryne System). C. ulcerans e C. pseudotuberculosis, com potencial de circulação zoonótica, da mesma forma que C. diphtheriae são capazes de albergar o gene da toxina diftérica. A reação m-PCR foi capaz de discernir as amostras de C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis e ainda definir o potencial das amostras em produzir a toxina diftérica. Os dados enfatizam a necessidade da técnica multiplex PCR para o diagnostico e para o controle de espécies associadas a quadros de difteria em populações humana.

ExoU, uma proteína do sistema de secreção do tipo III de Pseudomonas aeruginosa, induz a secreção de eicosanóides por células epiteliais respiratórias. Papel dos corpúsculos lipídicos neste processo

Para pesquisar o papel de ExoU no desencadeamento de resposta inflamatória nas vias aéreas, células epiteliais respiratórias humanas (CERs) da linhagem BEAS-2B foram tratadas com AA radiomarcado e infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa, que secreta ExoU, e com os mutantes PA103exoU (com deleção do gene exoU), PA103ΔUT/exoU (com deleção de exoU e complementação com o gene funcional) e PA103UT/S142A (com deleção de exoU e complementação com gene com mutagênese sítio-específica no domínio catalítico da enzima). Após 1 hora, a liberação de AA pelas culturas infectadas com as cepas produtoras de ExoU foi significativamente superior à observada em culturas infectadas pelas cepas não-produtoras ou por células controle. O tratamento das bactérias com MAFP, um inibidor de PLA2, resultou em significativa redução na liberação de AA. Células infectadas pelas cepas PA103 e PA103ΔUT/exoU secretaram PGE2 e LTB4 em concentrações significativamente maiores que as secretadas por células infectadas pelas demais cepas ou não infectadas. O tratamento com o MAFP reduziu significativamente a secreção de PGE2. A análise, por citometria de fluxo, de células infectadas e não infectadas tratadas com anticorpo anti-COX-2 mostrou que o percentual de células infectadas por PA103 marcadas foi significativamente superior ao percentual encontrado em culturas controle. Nenhuma diferença foi observada quanto ao percentual de células marcadas em culturas infectadas por PA103ΔexoU. O tratamento das culturas com NS-398 (um inibidor seletivo de COX-2) resultou na diminuição significativa da concentração de PGE2, secretada por células infectadas com PA103, mas não por células infectadas com PA103ΔexoU ou por células controle. Corpúsculos lipídicos (CLs) são domínios citoplasmáticos ricos em COX-2 e outras enzimas responsáveis pelo metabolismo do AA, sede da produção de eicosanóides. Como células infectadas pelas cepas produtoras de ExoU liberam AA livre, formulamos a hipótese de que a maior produção de eicosanóides por estas células seria dependente da indução do aumento no número dos CLs. No entanto, a análise por citometria de fluxo de células tratadas com uma sonda lipofílica com afinidade com os CLs mostrou que o percentual de células marcadas em culturas infectadas pelas cepas produtoras de ExoU foi significativamente inferior ao percentual em culturas controle ou infectadas pelas outras 2 cepas bacterianas. O tratamento das células com MAFP inibiu significativamente a redução do percentual de células contendo CLs. A análise, por citometria de fluxo, de células controle ou infectadas tratadas simultaneamente com a sonda lipofílica e com o anticorpo anti-PGE2, mostrou, em células infectadas com PA103, a redução da mediana da intensidade de marcação com a sonda lipofílica e o aumento da mediana da intensidade de marcação com o anticorpo anti-PGE2. Nossa hipótese é que a presença de ExoU nas células infectadas com a cepa PA103 resulte no metabolismo de glicerofosfolipídios presente nos CLs levando à diminuição da afinidade dos CLs pela sonda lipofílica e à síntese local de PGE2.