Disfunção mitocondrial e cardíaca em camundongos induzida por dieta rica em ácidos graxos poliinsaturados

Indivíduos obesos apresentam maior risco de morbidade e mortalidade atribuída às doenças cardiovasculares. A composição da dieta é um fator que prediz o fenótipo cardíaco em resposta a obesidade e, o tipo de ácido graxo pode afetar de forma diferencial a estrutura e a função do miocárdio. Estudos têm mostrado que a disfunção mitocondrial exerce um papel chave na patogênese da insuficiência e hipertrofia cardíaca, e as alterações mitocondriais observadas em falhas cardíacas apontam para defeitos em sítios específicos da cadeia transportadora de elétrons. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a função contrátil ventricular em camundongos, alimentados com dieta hiperlipídica, rica em ácidos graxos poliinsaturados, buscando elucidações através da bioenergética mitocondrial. Após desmame, camundongos machos C57Bl/6 passaram a receber dieta manipulada contendo 7% (C) ou 19% (HF) de óleo de soja, até os 135 dias de idade. A ingestão alimentar e a massa corporal foram monitoradas e foi realizado teste de tolerância à glicose. No final do período experimental, os animais foram anestesiados e submetidos à avaliação da composição corporal por Absortimetria de Raios X de Dupla Energia (DXA), e em seguida, sacrificados por exsanguinação. No plasma foram determinados o perfil lipídico e a insulina. O coração, o tecido adiposo intra-abdominal e o subcutâneo foram coletados, pesados, processados para análise histomorfológica. Fibras cardíacas do ventrículo esquerdo foram utilizadas para análise da respiração mitocondrial através de oxígrafo. O coração também foi utilizado para a técnica de perfusão de coração isolado de Langendorff, e para análise da expressão de proteínas relacionadas à bioenergética de cardiomiócitos, através de Western Blotting. O índice de HOMA e de adiposidade foram calculados. O grupo HF apresentou maior adiposidade, sem alteração na ingestão alimentar. Foi observada intolerância a glicose, hiperinsulinemia e resistência à insulina, além de alterações desfavoráveis no perfil lipídico. Foi observado alteração na morfologia cardíaca e quadro de cardiomiopatia hipertrófica, refletindo em alteração hemodinâmica, determinando maior contratilidade, maior pressão ventricular e função diastólica prejudicada. Em relação à atividade mitocondrial dos cardiomiócitos foi observada menor oxidação de carboidratos (-47%) e de ácidos graxos (-60%). Porém, sem alteração na expressão de proteínas relacionadas à bioenergética de cardiomiócitos, CPT1, UCP2, GLUT1, GLUT4, AMPK e pAMPK. A partir desses resultados, concluímos que o tipo e a quantidade de ácidos graxos predizem o fenótipo cardíaco na obesidade, promovendo alteração na capacidade oxidativa mitocondrial, na morfologia e na hemodinâmica cardíaca

Avaliação da presença de mutações de resistência no gene da NS5B e do prognóstico da infecção pelo HCV através da IL-28B em pacientes monoinfectados com HCV no RJ

Estima-se que a prevalência global da população mundial com hepatite C é de 3%. Pouco se sabe sobre a resposta ao tratamento com respeito à resistência viral. Algumas mutações no fragmento de 109 aminoácidos da NS5B são associadas com resistência ao interferon (IFN) e ribavirina (RBV). Estudos moleculares e clínicos identificaram fatores associados com o hospedeiro e vírus relacionados associada com a resposta ao tratamento, tal como o gene que codifica a IL-28B. Este estudo foi dividido em duas fases, cujos objetivos foram caracterizar a frequência de mutações que conferem resistência ao HCV e avaliar a relevância das mutações em pacientes Respondedores (R) ou Não Respondedores (NR) ao tratamento e caracterizar geneticamente as populações sobre polimorfismos genéticos nos SNPs da IL-28B em relação ao prognóstico da resposta ao tratamento. As amostras dos pacientes foram submetidas a testes de genotipagem e carga viral. As sequências geradas foram comparadas no BLAST e no banco de dados Los Alamos HCV. Realizamos o alinhamento das sequências homólogas e as mutações identificadas. Com base no genótipo e carga viral determinamos a classificação dos pacientes de acordo com a resposta à terapia. O DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico para a realização da tipagem de SNPs de IL-28B. A metodologia utilizada foi de PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan SNP específico. A análise dos dados foi realizada utilizando GraphPad Prism com qui-quadrado, risco relativo (RR), Odds Ratio (OR) e intervalo de confiança de 95%, com um nível de significância de P <0,05. Foi encontrado na primeira fase deste estudo uma taxa significativa mutações associadas ao tratamento nas amostras estudadas. A prevalência de mutações associadas à resistência ao IFN e RBV bem como a novos medicamentos antivirais localizados no fragmento de 109 aminoácidos da NS5B foi examinado em 69 indivíduos infectados naïve no Rio de Janeiro, Brasil. Na segunda fase, as mutações foram clinicamente relevantes. Desde então, procuramos observar as diferenças entre melhor ou pior prognóstico de acordo com a imunogenética que mostrou diferenciação entre os grupos R e NR ao tratamento em relação ao prognóstico da resposta terapêutica. Quando as diferenças entre as sequências da NS5B e a resposta ao tratamento foram consideradas verificou-se que associada a mutação R254K, estava a C316N que poderia conduzir a uma não resposta à terapia no genótipo 1b. Os nossos dados também suportaram forte associação de IL-28B rs12979860, com elevada probabilidade de resposta à terapia de IFN + RBV. Nossos dados evidenciam a presença de pacientes virgens de tratamento que abrigam mutações de resistência previamente descritas na literatura. A análise dos fatores preditores de resposta virológica mostrou que a predição de boa resposta ou não ao tratamento e ainda da progressão da doença é dependente de uma importante interação entre a genética viral e a do hospedeiro. Fato este importante para que no momento de avaliação de diagnóstico e conduta terapêutica, o médico possa tomar medidas apropriadas para o tratamento de cada paciente individualmente independentemente do genótipo do HCV em questão.

Variantes no gene MBL2 codificador da Lectina Ligante de Manose (MBL): implicações na leishmaniose visceral humana

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários.

Estudo dos polimorfismos C1236T, G2677T e C3435T do gene MDR1 em pacientes portadores de doenças inflamatórias intestinais

Estudos recentes têm avaliado a presença de polimorfismos do gene multidroga resistente 1 (MDR1), que codifica o transportador de membrana de efluxo chamado de P-glicoproteína, seu potencial papel na suscetibilidade das doenças inflamatórias intestinais (DII) e suas possíveis correlações com aspectos clínicos das DII. Dados conflitantes podem resultar da análise genética de populações distintas. Investigamos se os polimorfismos do gene MDR1 estão associados com as DII em população do sudeste do Brasil e suas possíveis correlações com fenótipos, atividade de doença, resposta ao tratamento e efeitos colaterais. Como métodos, a presente pesquisa trabalhou com 146 pacientes com Doença de Crohn (DC) e 90 com Retocolite Ulcerativa Idiopática (RCUI), que foram recrutados através de critérios diagnósticos estabelecidos. Os polimorfismos do MDR1 mais comumente descritos na literatura, C1236T, G2677T e C3435T, foram avaliados por PCR. As frequências genotípicas de pacientes com RCUI e DC foram analisadas na população de estudo. Associações de genótipo-fenótipo com características clínicas foram estabelecidas e riscos estimados para as mutações foram calculados. Nenhuma diferença significativa foi observada nas freqüências genotípicas para os polimorfismos G2677T/A e C3435T do MDR1 na DC ou na RCUI. O polimorfismo C1236T foi significativamente mais comum na DC do que na RCUI (p = 0,036). Na RCUI foram encontrados mais homens nos polimorfismos C1236T e G2677T no grupo de heterozigotos. Foram encontradas associações significativas entre o polimorfismo C3435T do gene MDR1 em pacientes com fenótipo estenosante na DC (OR: 3,16, p = 0,036), em oposição ao comportamento penetrante (OR: 0,31, p = 0,076). Na DC, associações positivas também foram encontradas entre o polimorfismo C3435T, à atividade moderada/severa da doença (OR: 3,54, p = 0,046), e à resistência / refratariedade ao corticosteróide (OR: 3,29, p = 0,043) nos homozigotos polimórficos. Nenhuma associação significativa foi encontrada entre os polimorfismos do MDR1 e categorias fenotípicas, atividade de doença ou resposta ao tratamento da RCUI. Em conclusão, os resultados do presente estudo sugerem que os polimorfismos do gene MDR1 poderiam estar implicados na susceptibilidade a DC e no seu fenótipo estenosante, como também estarem associados com uma resposta inadequada ao tratamento em um grupo de pacientes com DC. A forte relação com a DC suporta a existência de papéis adicionais para o MDR1 em mecanismos específicos subjacentes na patogênese da DC, como o controle da microbiota intestinal, mediação e regulação da fibrose. Além disso, compreender os efeitos de vários fármacos associados a estas variantes do MDR1 pode contribuir para a prescrição personalizada de regimes terapêuticos.

Associação entre variantes do gene da adiponectina (ADIPOQ): -11391 G/A, -11377 C/G, 45T>G e I164T e os níveis circulantes de adiponectina de alto peso molecular e fatores de risco cardiometabólico

A adiponectina, um hormônio produzido pelo tecido adiposo, atua na regulação do metabolismo energético e interfere favoravelmente na sensibilidade à insulina através de suas ações no fígado e musculatura esquelética. Ao contrário da maioria das outras adipocitocinas, associa-se inversamente com a obesidade visceral, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e doença cardiovascular. Inúmeros estudos demonstraram nos últimos anos os efeitos de variantes genéticas no gene ADIPOQ sobre os níveis circulantes de adiponectina, resistência à insulina, diabetes e obesidade. Entretanto, além de resultados contraditórios, a maior parte desses estudos foi realizada em populações Caucasianas e Asiáticas. Avaliar, em uma população multiétnica adulta do município do Rio de Janeiro, as possíveis associações das variantes genéticas (-11391 G>A, -11377C>G, +45T>G e T517G) no gene ADIPOQ com o fenótipo obeso, níveis circulantes de adiponectina de alto peso molecular e fatores de risco cardiometabólico. Trata-se de um estudo transversal. Foram estudados 100 indivíduos eutróficos (IMC 18,5 24,9 kg/m2, idade: 32,5 + 9,8 anos) e 100 obesos (IMC 30 58,2 kg/m2, idade 37,5 + 14,1 anos), igualmente divididos entre homens e mulheres. Os indivíduos obesos apresentaram valores significativamente maiores de circunferência abdominal, pressão arterial sistólica, diastólica e média, glicemia de jejum, triglicerídeos, LDL-colesterol, leptina, insulina, HOMA-IR e proteína C reativa, quando comparados aos eutróficos. Contrariamente, exibiram menores valores de adiponectina e HDL-colesterol. Análises de correlação mostraram relação inversa e significativa entre a adiponectina, circunferência abdominal, insulina, HOMA-IR e pressão arterial. Com os níveis de HDL-colesterol, a correlação foi positiva. Por meio de análise de regressão múltipla foi possível identificar os determinantes dos níveis séricos de adiponecinta. Sexo masculino, circunferência abdominal, HOMA-IR e a variante genética -11391G>A, foram os principais responsáveis por essa variação, com um R2 de 30%. Quanto à análise genética, não encontramos nenhuma associação entre essas variantes e o fenótipo obeso. Entretanto, os indivíduos carreadores do alelo mutante -11391A apresentaram menores valores de glicemia, pressão arterial e relação cintura-quadril e maiores concentrações sanguíneas de adiponectina, quando comparados aos indivíduos ditos selvagens. Ademais, os carreadores do alelo mutante -11377G apresentaram menores valores de pressão arterial sistólica, diastólica e média. Os resultados do presente estudo demonstram que níveis de adiponectina diferem entre eutróficos e obesos e que concentrações mais baixas dessa adipocitocina estão associadas a um pior perfil cardiometabólico. Variantes no gene ADIPOQ podem interferir nessa relação e alguns polimorfismos parecem ter um perfil protetor no risco cardiovascular.

Polimorfismos do gene da tiopurina metiltransferase (TPMT) em pacientes com doenças inflamatórias intestinais: avaliação da prevalência e correlação com efeitos colaterais

A azatioprina e a 6 mercaptopurina (6-MCP) são drogas muito utilizada no tratamento das doenças inflamatórias intestinais (DII), porém estão associadas a vários efeitos colaterais. A determinação prévia do genótipo da tiopurina metiltransferase (TPMT) pode identificar pacientes de maior risco de toxicidade a droga. Os objetivos deste estudo foram avaliar a prevalência dos polimorfismos do gene da TPMT em pacientes com DII acompanhados no Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) da UERJ, comparando com a prevalência em outras populações e correlacionar a presença desses polimorfismos com a toxicidade às drogas. Foram avaliados 146 pacientes com doença de Crohn (DC) e 73 com retocolite ulcerativa idiopática (RCUI). A pesquisa dos principais genótipos da TPMT (*2, *3, *3C) foi realizada por técnicas de PCR (alelo específico e RFLP). Os achados clínicos foram correlacionados com a genotipagem e avaliados por análises multivariadas. Dentre os pacientes que estavam em uso de azatioprina, 14 apresentaram pancreatite ou elevação de enzimas pancreáticas, 6 apresentaram hepatoxicidade e 2 evoluíram com neutropenia. Os polimorfismos do gene da TPMT foram observados em 37 dos 219 pacientes (8 foram heterozigotos para o genótipo *2, 11 heterozigotos para *3A e 18 foram heterozigotos para o polimorfismo *3C). Não foi observado nenhum homozigoto polimórfico. Uma correlação positiva foi observada entre a elevação de enzimas pancreáticas e os genótipos *2 e *3C. A prevalência dos polimorfismos neste estudo (16,89%) foi maior que a descrita para população caucasiana e em outros estudos brasileiros. Apesar do predomínio do genótipo *3C, não houve ocorrência exclusiva de um polimorfismo, conforme observado em outras populações. A população brasileira devido à sua miscigenação têm características genotípicas próprias diferentes do outros países do mundo. Dois polimorfismos da TPMT (*2 e *3C) estiveram associados à toxicidade ao uso da azatioprina em pacientes com DII no sudeste do Brasil. O teste genético pode auxiliar na escolha da melhor droga e na dose ideal para os pacientes portadores de DII antes do início do tratamento.

Prevalência da mutação do gene HFE em pacientes com porfiria cutânea tardia do Hospital Universitário Pedro Ernesto- UERJ

A Porfiria Cutânea Tardia (PCT) é uma desordem dermatológica, caracterizada por fotossensibilidade induzida pela circulação de porfirinas que se depositam na pele. Tanto a forma familial como a esporádica são desordens dependentes do acúmulo de ferro. A presença da mutação do gene da Hemocromatose (HFE) é um importante fator de risco para o acúmulo de ferro e pouco se sabe sobre sua prevalência na população brasileira. Da mesma forma, existem poucos relatos a respeito da associação entre mutação do gene HFE e Porfiria Cutânea Tardia. No presente trabalho descrevemos as frequências dos principais alelos e genótipos do gene da Hemocromatose HFE1 em uma coorte de 25 pacientes brasileiros atendidos no HUPE, com Porfiria Cutânea Tardia, durante o período de janeiro 1990 à dezembro 2012, realizando uma correlação da presença desta mutação com a sobrecarga de ferro neste grupo de pacientes. Neste estudo foi utilizado um grupo controle da população fluminense pareado por idade, sexo e grupo étnico informado, para comparar com os dados avaliados dos pacientes com PCT. A pesquisa das mutações genéticas C282Y e H63D do gene da hemocromatose ocorreu através de técnicas de PCR tempo real e e os resultados ratificados por sequenciamento de Sanger. Dos resultados encontrados, não ocorreram diferenças estatísticas significativas nas frequências alélicas e genotípicas das mutações C282Y e H63D entre a coorte com PCT e a população controle. Entretanto, há um forte indício da participação da mutação H63D em um paciente homozigoto, para desenvolvimento da doença, conforme observado na literatura. Dos ensaios bioquímicos, os níveis de ferritina encontrados entre os pacientes portadores de PCT com a mutação H63D foram maiores que os indivíduos sem a mutação.

Polimorfismo Arg16Gly e Gln27Glu do Gene β2-ADR e a sensibilização fúngica associada ao controle e gravidade da asma

A asma brônquica é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas inferiores que resulta da interação entre fatores genéticos e ambientais.Teve como objetivo estudar o polimorfismo Arg16Gly e Gln27Glu do Gene β2-ADR e a sensibilização fúngica associada ao controle e gravidade da asma. Trata-se de um estudo observacional analítico caso controle em portadores de asma, assistidos no Programa de Assistência ao Paciente Asmático do Hospital Universitário Presidente Dutra (PAPA-HUPD). Foram incluídos no estudo 83 pacientes com asma brônquica e 46 não asmáticos como controles. Os participantes coletaram duas amostra de 5ml de sangue, para genotipagem do gene β2AR-16 e β2AR-27 por PCR-RFLP e teste de sensibilização Elisa específico para fungos. Os dados de controle foram obtidos através do Teste de Controle da Asma (ACT) e os dados clínicos dos prontuários. As análises de polimorfismo não apresentaram associação com o estado de controle da asma para o gene β2-ADR-16 e β2-ADR-27. Entre asmáticos e não asmáticos foi observado diferença estatisticamente significante (p<0,05) com maior expressão do alelo Glu (74%) entre os não asmáticos. O homozigoto Glu/Glu também foi mais frequentes entre os não asmáticos, sugerindo que o alelo Glu-27 pode estar associado ao risco diminuído para asma. Quanto à sensibilização fúngica, não houve associação significante com os genótipos estudados. O estudo mostrou que, asmáticos graves são mais sensibilizados que não asmáticos e asmáticos moderados. Não houve diferença estatisticamente significante entre controle da asma e sensibilização fúngica, no entanto houve associação significativa com a gravidade. Associações isoladas entre sensibilização fúngica e asma, assim como entre polimorfismo e asma ficou evidente neste estudo.

Hemodinâmica cardíaca e o metabolismo energético mitocondrial de camundongos adultos hiperalimentados na lactação

O desequilíbrio nutricional no início da vida leva ao desenvolvimento da obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares na idade adulta. Este estudo teve como objetivo analisar os efeitos a longo prazo da hiperalimentação na lactação por meio do modelo de redução da ninhada na hemodinâmica e bioenergética cardíaca. Vinte e quatro camundongos machos Swiss adultos foram divididos em dois grupos (controle e hiperalimentado) submetidos a duas condições (linha de base e isquemia/reperfusão) formando quatro grupos no total: grupo controle linha de base (GCLB), grupo controle isquemia/reperfusão (GCIR), grupo hiperalimentado linha de base (GHLB) e o grupo hiperalimentado isquemia/reperfusão (GHIR), todos com seis camundongos/grupo. As alterações cardíacas foram analisadas por meio da hemodinâmica cardíaca, da respiração mitocondrial e da biologia molecular. Os parâmetros hemodinâmicos analisados foram a velocidade de contração (Max dP/dt), a velocidade de relaxamento (Min dP/dt), o tempo de relaxamento cardíaco isovolumétrico (Tau) e os batimentos por minuto (BPM). A respiração mitocondrial foi avaliada por meio da razão do controle respiratório (RCR) na oxidação de carboidratos e ácidos gordos, e finalmente, a biologia molecular, através de proteínas-chave como a proteína quinase B (AKT), a proteína quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK), a carnitina palmitoil transferase 1 (CPT-1), a proteína desacopladora 2 (UCP2), o 4-hidroxinonenal (4-HNE) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Os camundongos do GH desenvolveram maior peso corporal (30,95%, P<0,001), gordura epididimal (68,64%, P<0,001), gordura retroperitoneal (109,38%, P<0,01) e glicemia de jejum (19,52%, P<0,05) comparados aos do GC. Os parâmetros Max dP/dt e BPM apresentaram diminuição no GHIR quando comparado ao GHLB (P<0,001 e P<0,05). O parâmetro Min dP/dt apresentou-se reduzido no GCIR e GHIR quando comparado aos grupos GCLB e GCLB (P<0,05; P<0,0001 respectivamente). Camundongos do GHIR apresentaram redução do Tau quando comparado aos grupos GCIR e GHLB (P<0,0001). Estes desequilíbrios na hemodinâmica cardíaca foram associados a função mitocondrial, uma vez que, o GHLB apresenta a RCR reduzida para oxidação de ácidos graxos e carboidratos (P<0,05 e P<0,01, respectivamente) e o GHIR apenas na oxidação dos ácidos graxos (P<0,01). Além disso, o GHIR apresentou diversas alterações nas proteínas-chave do metabolismo energético cardíaco, como diminuição do conteúdo de AKT (P<0,05) e aumento do conteúdo de CPT-1 (P<0,05), 4-HNE (P<0,05) e GAPDH (P<0,05) quando comparado ao CGIR. Finalmente, a expressão do mRNA para CPT1, GAPDH e UCP2 foi aumentada no GHIR quando comparado aos GCIR (P<0,05) e GHLB (P<0,05). A expressão de mRNA para UCP2 e CPT-1 foi reduzida no GCIR quando comparado ao GCLB (P<0,01 e P<0,05, respectivamente). O estudo apresenta resultados consistentes, demonstrando efeitos deletérios sobre o metabolismo cardíaco adulto resultante de alterações nutricionais durante a lactação.

Caracterização e diversidade molecular do transposon Tn1546, carreador do gene vanA, responsável pela expressão de resistência à vancomicina, em amostras clínicas de diferentes espécies de Enterococcus

Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são reconhecidos como importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais, configurando um grave problema de saúde pública, principalmente pela escassez de opção terapêutica eficaz. O fenótipo de resistência VanA é o mais frequente, sendo definido pela resistência a altos níveis de vancomicina e teicoplanina. VanA é caracterizado por um conjunto gênico (vanRSHAXYZ) localizado no elemento genético móvel denominado transposon Tn1546. A diversidade de Tn1546 resulta de alterações estruturais promovidas por deleções ou integração de sequências de inserção (IS) que, exercem papel chave na evolução do elemento VanA, modificando os aspectos relacionados à sua transferência e expressão do fenótipo. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar o polimorfismo de elementos Tn1546 presentes em amostras de diferentes espécies de Enterococcus isoladas em instituições hospitalares do Estado do Rio de Janeiro no período de 2000 a 2012. Foram incluídas neste estudo 70 amostras VRE que foram caracterizadas quanto ao gênero, espécies e genótipo de resistência aos glicopeptídeos por métodos convencionais e PCR multiplex. A susceptibilidade a 17 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em ágar, e concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina e teicoplanina foi determinada por microdiluição em caldo. O tranposon foi obtido após lise das células bacterianas e amplificação por PCR longo, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a região repetida e invertida que flanqueia este elemento genético. A diversidade dos elementos Tn1546 foi avaliada por um conjunto de métodos moleculares que incluiu a análise do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), utilizando-se a endonuclease ClaI, amplificação de segmentos internos por PCR de sobreposição de oligonucleotídeos (overlapping PCR) e detecção de sequências de inserção (ISs). A caracterização em espécies considerada para as demais análises foi obtida pela metodologia de PCR de acordo com a seguinte distribuição: E. avium (N=6), E. faecalis (N=12), E. faecium (N=46), E. gallinarum (N=4) e E. raffinosus (N=2). Todas as amostras apresentaram o genótipo vanA. Nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foi observado que todas as amostras foram multirresistentes, sendo resistente de 6 a 13 dentre os 17 antimicrobianos testados. A presença de elementos semelhantes ao arquétipo de Tn1546 foi observada em 61,5% das amostras; entretanto, 27 amostras apresentaram perfis variantes de Tn1546. Foram identificados nove perfis de RFLP, dentre 66 avaliadas, sendo o perfil I, prevalente e semelhante ao arquétipo de Tn1546. Não foi possível analisar quatro amostras por RFLP. Os produtos de amplificação de Tn1546 alterados, obtidos pela overlapping PCR e pelo rastreamento de IS, levaram à classificação de 15 tipos polimórficos, nomeados de A a O. A maioria dos Tn1546 polimórficos teve suas regiões de ORF1 e/ou ORF2 deletadas; e IS1542 juntamente com IS1216V foram as inserções mais frequentes, que em muitas situações compartilhavam a mesma região de inserção. IS19 foi detectada apenas na região vanS-vanH. Os dados apresentados neste estudo indicam que o polimorfismo de Tn1546 pode ser explorado no rastreamento de rotas de transmissão, acompanhamento da dispersão de elementos VanA e investigação da evolução de amostras VRE.

Estudo do efeito do transplante de células mononucleares de medula óssea na bioenergética mitocondrial de ratos com fibrose hepática

A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças, incluindo a colestase hepática, caracterizada pela ativação de células de Kupffer e células fibrogênicas, as quais produzem matriz extracelular excessiva. O acúmulo de sais biliares tóxicos no parênquima hepático leva à lesão crônica com dano mitocondrial, redução da síntese de ATP, aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose, resultando em comprometimento da função hepática. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o efeito positivo do transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMO) na resolução da fibrose hepática e recuperação da função hepática em ratos com colestase, induzida pela ligadura de ducto biliar (LDB). Assim, o presente estudo teve como objetivo analisar a bioenergética mitocondrial após o transplante de CMMO no fígado de ratos com fibrose induzida por ligadura de ducto bilar (LDB). Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: animais normais, animais com fibrose hepática após 14 e 21 dias de LDB (F14d e F21d, respectivamente), e animais que após 14 dias de LDB receberam 1x107 CMMO, e foram eutanasiados sete dias após. Nossos dados demonstraram aumento do conteúdo de colágeno tipo I no grupo F21d em relação ao grupo normal, indicativo de fibrose, e sua diminuição após o transplante de CMMO. A análise da fisiologia mitocondrial do fígado mostrou diminuição significativa da taxa respiratória máxima estimulada por ADP (estado 3) nos grupos F14d e F21d, indicando redução da capacidade de oxidação de carboidratos e ácidos graxos. Além disso, a razão do controle respiratório (RCR), indicativa de acoplamento da fosforilação oxidativa com a produção de ATP, apresentou-se significativamente diminuída nos grupos F14d e F21d, sugerindo desacoplamento mitocondrial. No entanto, o transplante de CMMO aumentou significativamente nestes grupos tanto a capacidade oxidativa quanto o acoplamento mitocondrial a níveis semelhantes aos do grupo normal. Estes resultados foram confirmados por análise de western blotting, que mostrou aumento significativo no conteúdo de UCP2 e diminuição do conteúdo de PGC-1α no grupo F21d, com consequente restauração após o transplante de CMMO. Além disso, os resultados mostraram um aumento significativo do conteúdo de 4-HNE no grupo F14d com redução após o transplante CMMO. Assim, podemos concluir que o transplante de CMMO tem um efeito positivo sobre a bioenergética mitocondrial de fígados de ratos com colestase, com aumento da capacidade oxidativa e redução do estresse oxidativo, o que, por sua vez, contribui para a recuperação da função hepática.

Estudo da cromatina nos sítios de fixação à matriz nuclear no domínio do gene TP53 e das modificações epigenéticas e no modelo de progressão tumoral mamária 21T

Dentre os diversos tipos de câncer agressivos, o câncer de mama é o mais comum em mulheres. Mutações hereditárias e adquiridas, assim como alterações epigenéticas atuam em sinergia na carcinogênese mamária e na progressão tumoral. A proteína P53 é uma supressora de tumor e possui uma atuação fundamental na integridade genômica. Apesar do vasto conhecimento sobre o controle da P53 a nível de proteína, ainda pouco se sabe sobre o controle transcricional do gene TP53. A série 21T, uma série de 4 linhagens celulares originadas da mama da mesma paciente, representando diferentes estágios de progressão tumoral mamária, é um eficiente modelo para investigação das alterações epigenéticas e suas influências na expressão gênica ao longo da progressão do câncer de mama. Nós analisamos a organização do domínio do gene TP53 através da técnica de arranjo de DNA, em diversas linhagens celulares de câncer de mama e linhagens controle, e realizamos uma tentativa de caracterizar estes elementos de DNA nas linhagens controle não-tumorais HB2 e MCF10A e nas tumorais MCF-7, MDA-MB-231, T47D, através dos marcadores epigenéticos de eucromatina, H4Ac, e heterocromatina, H3K9me3. Ainda analisamos a ligação de proteínas à região associada à matriz nuclear (MAR), denominada MAR 2, e a possível ligação da proteína ligante à matriz nuclear (MARBP), PARP-1, através de ensaios de gel shift (EMSA). Detectamos que na linhagem controle epitelial mamária, HB2, o gene TP53 está posicionado num domínio de DNA relativamente pequeno, aproximadamente 50 kb, delimitado por dois sítios de fixação à matriz nuclear. Interessantemente, esta estrutura de domínio se apresentou radicalmente diferente nas linhagens de câncer de mama estudadas, MCF7, T47D, MDA-MB-231 e BT474, nos quais o tamanho do domínio estudado estava aumentado e a transcrição do TP53 diminuída. Os enriquecimentos com os marcadores epigenéticos de cromatina H4Ac e H3K9me3 estão diferentemente distribuídos nas MARs nas linhagens celulares. Surpreendentemente, a MAR 2 apresentou uma ligação altamente específica, o que poderia representar a atuação de fatores transcricionais envolvidos na organização da cromatina. Através de programas de bioinformática, detectamos putativos sítios para interessantes fatores de transcrição, tais como o c/EBP-beta e c-myb, que poderiam atuar em cis regulando a expressão do gene TP53 e outros flanqueadores. Nós propusemos um modelo para a organização da cromatina na região de domínio do gene TP53 com os genes flanqueadores. Através da série 21T, detectamos uma hipometilação global genômica, nas células cancerosas 21NT e 21MT1. Uma importante diminuição da expressão global do marcador H4Ac nas células metastáticas 21MT1, foi detectada em relação às outras linhagens. Os níveis de RNAm das principais enzimas relacionadas as modificações epigenéticas são consistentes com as observadas hipometilação genômica e hipoacetilação. Através de microscopia confocal, verificamos que o marcador H4Ac está localizado, na maior parte na periferia e o marcador H3K9me3, pericêntrico nos núcleos tumorais. Por fim, verificamos que o promotor P1 do gene TP53 apresenta um estado de cromatina aberta, e a expressão do gene TP53 é similar em todas as células da série 21T.

Prevalência do polimorfismo -1031 T>C do gene TNFA em um grupo de diabéticos tipo I e sua relação com a periodontite severa

Diabetes mellitus e doenças periodontais são altamente prevalentes na população mundial. Doenças periodontais (DPs) compreendem um grupo de condições crônicas inflamatórias induzidas por microorganismos que levam à inflamação gengival, à destruição tecidual periodontal e à perda óssea alveolar. Diabetes mellitus (DM) é o termo utilizado para descrever um grupo de desordens metabólicas associadas à intolerância à glicose e ao metabolismo inadequado de carboidratos. Uma vez que DPs poderiam agir de forma similar a outros estados infecciosos sistêmicos, aumentando a severidade do diabetes, uma possível relação entre ambas tem sido considerada em todo o mundo. Polimorfismos genéticos de um único nucleotídeo (SNPs) têm sido estudados em diversas doenças. Nas periodontites, acredita-se que possam estar envolvidos na exacerbação da resposta inflamatória frente ao desafio bacteriano, modificando a susceptibilidade do hospedeiro. Neste estudo, a prevalência de periodontite foi avaliada em portadores de diabetes mellitus tipo I. Posteriormente, o SNP localizado na região promotora do gene TNFA (-1031T>C) foi analisado e sua importância para a doença periodontal destrutiva foi avaliada. O grupo teste foi constituído por diabéticos tipo I (DGT, n=113) enquanto o grupo controle por indivíduos não diabéticos (ND, n=73). Para as análises dos polimorfismos genéticos, um subgrupo foi retirado do grupo teste (DG, n=58) e comparado ao grupo ND. Os seguintes parâmetros clínicos e demográficos foram avaliados: percentual de sítios com profundidade de bolsa  6,0 mm (%PBS6,0 mm); índice gengival (IG); perda óssea radiográfica (POR); fumo; duração do diabetes ; idade; índice de massa corpórea (IMC), n de internações e n de dentes presentes. Amostras de sangue e/ou esfregaço bucal foram colhidas de 58 pacientes do grupo teste e de 73 controles. Após a extração do DNA genômico e amplificação da região genômica de interesse por PCR (Polymerase Chain Reaction), o polimorfismo TNFA 1031T>C foi analisado por BbsI RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). A análise dos produtos de digestão foi feita por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%. A análise estatística das freqüências alélica e genotípica juntamente com os dados clínicos e epidemiológicos entre os 2 grupos foi feita através do teste do Mann-Whitney e do Qui-quadrado. Os grupos de estudo obedecem ao princípio de Hardy-Weinberg. No grupo ND, as seguintes freqüências genotípicas foram encontradas: 78,1% (T/T); 20,5% (T/C) e 1,4% (C/C) enquanto no grupo D foram: 42,4%(T/T); 37,3% (T/C) e 20,3% (C/C). A frequência do alelo T no grupo diabético (D) foi de 0,610 ao passo que no grupo ND foi de 0,883. Não foi possível encontrar uma relação entre o polimorfismo -1031 T>C do gene TNFA e a presença de periodontite em diabéticos tipo I. Entretanto, o polimorfismo estudado se mostrou significativamente relacionado (p<0,0001 e OR= 4.85 95%IC 2,271-10,338) à presença do diabetes tipo I.

Adaptação digestiva com duodenal switch parcial em pacientes diabéticos e com IMC<35 Kg/m2. Análise da resposta clínica, laboratorial, enterohormonal e da expressão do gene p53 na mucosa intestinal

O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma doença de prevalência crescente na população mundial, sendo associado ao aumento de diversas comorbidades. A relação entre o trato digestivo e o DM2 tem sido fortalecida a partir dos resultados das diferentes cirurgias metabólicas frente à remissão do distúrbio endócrino. Alterações morfológicas hipertróficas no epitélio intestinal são percebidas nos estágios iniciais da doença e parece ter papel primordial na instalação da hiperglicemia crônica. O gene p53 participa ativamente dos processos de regulação do crescimento epitelial intestinal e pode sofrer alteração de sua expressão em estados diabéticos. Objetiva-se avaliar os resultados clínicos e laboratoriais de pacientes DM2 e com índice de Massa Corpórea (IMC) >25 e <35 Kg/m2 submetidos a cirurgia metabólica denominada adaptação digestiva com duodenal switch parcial (DSP) e avaliar o comportamento da expressão do gene p53 na mucosa intestinal no período pré e pós-operatório. Nove pacientes DM2, com IMC<35Kg/m2 foram operados pela técnica DSP. Biópsias de duodeno e íleo foram colhidas no estado diabético (pré e transoperatório respectivamente) e, 3 meses após a cirurgia, através de endoscopia digestiva alta. Foram comparados os dados de evolução antropométrica (IMC) e laboratorial no período pré e pós-operatório. Através do método enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) foram determinados os níveis dos entero-hormônios glucagon-like peptide-1 (GLP-1) e glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP), no pré e pós-operatório, em jejum e pós-prandial nos períodos 30',60',90' e 120'. A expressão do gene p53, foi avaliada por real time polymerase chain reaction (qrt-PCR) e western blot, nos dois diferentes momentos. As variáveis: glicemia de jejum e pós-prandial (2 horas), trigliceridemia de jejum, hemoglobina glicada (HbAc1) e peptídeo C foram analisadas. As médias dos parâmetros laboratoriais foram comparadas pela análise multivariada ANOVA e após teste-Tukey. A média de expressão relativa do gene p53 foi comparada nos dois períodos pelo teste t-student. Os resultados evidenciaram que entre maio e dezembro de 2010, nove pacientes (4 homens, 5 mulheres) DM2 e com IMC entre 26 e 34Kg/m2 foram submetidos a DSP. A média de IMC do grupo operado foi de 31,3. Houve queda do IMC média de 23% após um ano. Houve queda significativa (p<0,05) nos níveis de triglicerídeos, glicemia de jejum e pós-prandial (2 horas), HbA1c assim como aumento do peptídeo-C (p<0,05), quando comparados os períodos pré e pós-operatório. Os níveis séricos de GLP-1 foram significativamente maiores no pós-operatório (p<0,05), tanto em jejum como pós-prandial sendo que houve diminuição dos níveis de GIP, contudo sem significância estatística. O gene p53 sofreu aumento significativo de sua expressão relativa (qrt-PCR)(p<0,05) no período pós-operatório na mucosa duodenal e uma tendência de aumento no íleo, contudo sem significância estatística. A análise da expressão ao nível proteico foi bem sucedida somente no íleo, também mostrando tendência de aumento. Concluí-se que a DSP foi capaz de controlar satisfatoriamente o DM2 em pacientes com IMC<35 Kg/m2. Houve aumento da secreção de GLP-1 e tendência de diminuição do GIP. Houve aumento da expressão do p53 na mucosa intestinal, no período pós-operatório, após o controle do diabetes, quando comparada ao período pré-operatório.

Bioenergética mitocondrial do coração na obesidade induzida por dieta ocidental em camundongos Swiss

A obesidade, doença resultante do acúmulo excessivo de gordura corporal, é importante fator de risco para diabetes mellitus tipo 2, dislipidemias e doenças cardiovasculares, doenças de alta prevalência em todo o mundo. O processo de transição nutricional decorrente da globalização contribuiu para o crescente número de indivíduos com obesidade, principalmente pela modificação nos hábitos alimentares da população, com ampla inclusão de produtos industrializados ricos em gordura saturada, sal e açúcar, denominada dieta ocidental. Os mecanismos pelos quais a obesidade induzida por dieta leva ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares ainda não estão completamente esclarecidos na literatura, porém sabe-se que a obesidade leva ao comprometimento da função cardíaca e do metabolismo energético, aumentando a morbidade e mortalidade. Em grande parte dos estudos relacionados à obesidade, o metabolismo energético celular comprometido associa-se à disfunção mitocondrial. Neste contexto, torna-se importante avaliar a função mitocondrial na obesidade, visto que as mitocôndrias são organelas com funções-chave no metabolismo energético. No presente estudo, avaliamos inicialmente o efeito obesogênico da dieta ocidental em camundongos Swiss por 16 semanas a partir do desmame. Para tal, analisamos a ingestão alimentar, evolução da massa corporal, Índice de Lee, peso das gorduras epididimal e retroperitoneal, peso e morfologia do fígado, relação entre o peso do fígado/massa corporal, peso do ventrículo esquerdo (VE)/massa corporal, glicemia de jejum e teste intraperitoneal de tolerância à glicose. Avaliamos também o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução. Além disso, o conteúdo das proteínas envolvidas no metabolismo energético: Carnitina Palmitoil Transferase 1 (CPT1), proteína desacopladora 2 (UCP2), Transportadores de glicose 1 e 4 (GLUT1 e GLUT4), proteína quinase ativada por AMP (AMPK), proteína quinase ativada por AMP fosforilada (pAMPK), receptor de insulina β (IRβ) e substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1) foi determinado por western blotting. Nossos resultados confirmaram o caráter obesogênico da dieta ocidental, visto que os camundongos submetidos a esta dieta (GO), apresentaram-se hiperfágicos (P<0,001) e obesos (72,031,82, P<0,001), com aumento progressivo no ganho de massa corporal. Além do aumento significativo dos parâmetros: Índice de Lee (362,902,44, P<0,001), gorduras epididimal e retroperitonial (3,310,15 e 1,610,11, P<0,001), relação entre o peso do fígado/massa corporal (0,060,003, P<0,001) e peso de ventrículo esquerdo (VE)/massa corporal (0,080,002, P<0,01), hiperglicemia de jejum (192,1014,75, P<0,01), intolerância à glicose (P<0,05, P<0,01) e deposição ectópica de gordura no fígado. A respirometria de alta resolução evidenciou disfunção mitocondrial cardíaca no grupo GO, com reduzida capacidade de oxidação de carboidratos e ácidos graxos (P<0,001) e aumento do desacoplamento entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP (P<0,001). Os resultados de western blotting evidenciaram aumento nos conteúdos de CPT1 (1,160,08, P<0,05) e UCP2 (1,080,06, P<0,05) e redução no conteúdo de IRS-1 (0,600,08, P<0,05). Não houve diferença significativa nos conteúdos de GLUT1, GLUT4, AMPK, pAMPK, pAMPK/AMPK e IRβ. Em conclusão, o consumo da dieta ocidental resultou no desenvolvimento de obesidade com disfunção mitocondrial associada a alterações no metabolismo energético.