Function of C1A barley peptidases and their inhibitors (cystatins) in barley seed germination : Funcion de las peptidasas C1A de cebada y sus inhibidores (cistatinas) en la germinacion de la semilla

Plant proteolysis is a metabolic process where specific enzymes called peptidases degrade proteins. In plants, this complex process involves broad metabolic networks and different sub-cellular compartments. Several types of peptidases take part in the proteolytic process, mainly cysteine-, serine-, aspartyl- and metallo- peptidases. Among the cysteine-peptidases, the papain-like or C1A peptidases (family C1, clan CA) are extensively present in land plants and are classified into catepsins L-, B-, H- and Flike. The catalytic mechanism of these C1A peptidases is highly conserved and involves the three amino acids Cys, His and Asn in the catalytic triad, and a Gln residue which seems essential for maintaining an active enzyme conformation. These proteins are synthesized as inactive precursors, which comprise an N-terminal signal peptide, a propeptide, and the mature protein. In barley, we have identified 33 cysteine-peptidases from the papain-like family, classifying them into 8 different groups. Five of them corresponded to cathepsins L-like (5 subgroups), 1 cathepsin B-like group, 1 cathepsin F-like group and 1 cathepsin H-like group. Besides, C1A peptidases are the specific targets of the plant proteinaceous inhibitors known as phytocystatins (PhyCys). The cystatin inhibitory mechanism is produced by a tight and reversible interaction with their target enzymes. In barley, the cystatin gene family is comprised by 13 members. In this work we have tried to elucidate the role of the C1A cysteine-peptidases and their specific inhibitors (cystatins) in the germination process of the barley grain. Therefore, we selected a representative member of each group/subgroup of C1A peptidases (1 cathepsin B-like, 1 cathepsin F-like, 1 cathepsin H-like and 5 cathepsins L-like). The molecular characterization of the cysteine-peptidases was done and the peptidase-inhibitor interaction was analyzed in vitro and in vivo. A study in the structural basis for specificity of pro-peptide/enzyme interaction in barley C1A cysteine-peptidases has been also carried out by inhibitory assays and the modeling of the three-dimensional structures. The barley grain maturation produces the accumulation of storage proteins (prolamins) in the endosperm which are mobilized during germination to supply the required nutrients until the photosynthesis is fully established. In this work, we have demonstrated the participation of the cysteine-peptidases and their inhibitors in the degradation of the different storage protein fractions (hordeins, albumins and globulins) present in the barley grain. Besides, transgenic barley plants overexpressing or silencing cysteine-peptidases or cystatins were obtained by Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos to analyze their physiological function in vivo. Preliminary assays were carried out with the T1 grains of several transgenic lines. Comparing the knock-out and the overexpressing lines with the WT, alterations in the germination process were detected and were correlated with their grain hordein content. These data will be validated with the homozygous grains that are being produced through the double haploid technique by microspore culture. Resumen La proteólisis es un proceso metabólico por el cual se lleva a cabo la degradación de las proteínas de un organismo a través de enzimas específicas llamadas proteasas. En plantas, este complejo proceso comprende un entramado de rutas metabólicas que implican, además, diferentes compartimentos subcelulares. En la proteólisis participan numerosas proteasas, principalmente cisteín-, serín-, aspartil-, y metalo-proteasas. Dentro de las cisteín-proteasas, las proteasas tipo papaína o C1A (familia C1, clan CA) están extensamente representadas en plantas terrestres, y se clasifican en catepsinas tipo L, B, H y F. El mecanismo catalítico de estas proteasas está altamente conservado y la triada catalítica formada por los aminoácidos Cys, His y Asn, y a un aminoácido Gln, que parece esencial para el mantenimiento de la conformación activa de la proteína. Las proteasas C1A se sintetizan como precursores inactivos y comprenden un péptido señal en el extremo N-terminal, un pro-péptido y la proteína madura. En cebada hemos identificado 33 cisteín-proteasas de tipo papaína y las hemos clasificado filogenéticamente en 8 grupos diferentes. Cinco de ellos pertenecen a las catepsinas tipo L (5 subgrupos), un grupo a las catepsinas tipo-B, otro a las catepsinas tipo-F y un último a las catepsinas tipo-H. Las proteasas C1A son además las dianas específicas de los inhibidores protéicos de plantas denominados fitocistatinas. El mecanismo de inhibición de las cistatinas está basado en una fuerte interacción reversible. En cebada, se conoce la familia génica completa de las cistatinas, que está formada por 13 miembros. En el presente trabajo se ha investigado el papel de las cisteín-proteasas de cebada y sus inhibidores específicos en el proceso de la germinación de la semilla. Para ello, se seleccionó una proteasa representante de cada grupo/subgrupo (1 catepsina tipo- B, 1 tipo-F, 1 tipo-H, y 5 tipo-L, una por cada subgrupo). Se ha llevado a cabo su caracterización molecular y se ha analizado la interacción enzima-inhibidor tanto in vivo como in vitro. También se han realizado estudios sobre las bases estructurales que demuestran la especificidad en la interacción enzima/propéptido en las proteasas C1A de cebada, mediante ensayos de inhibición y la predicción de modelos estructurales de la interacción. Finalmente, y dado que durante la maduración de la semilla se almacenan proteínas de reserva (prolaminas) en el endospermo que son movilizadas durante la germinación para suministrar los nutrientes necesarios hasta que la nueva planta pueda realizar la fotosíntesis, en este trabajo se ha demostrado la participación de las cisteínproteasas y sus inhibidores en la degradación de las diferentes tipos de proteínas de reserva (hordeinas, albúmins y globulinas) presentes en el grano de cebada. Además, se han obtenido plantas transgénicas de cebada que sobre-expresan o silencian cistatinas y cisteín-proteasas con el fin de analizar la función fisiológica in vivo. Se han realizado análisis preliminares en las semillas T1 de varias líneas tránsgenicas de cebada y al comparar las líneas knock-out y las líneas de sobre-expresión con las silvestres, se han detectado alteraciones en la germinación que están además correlacionadas con el contenido de hordeinas de las semillas. Estos datos serán validados en las semillas homocigotas que se están generando mediante la técnica de dobles haploides a partir del cultivo de microesporas.

Algoritmos de distribución de cargas de proceso en computación con membranas

Con el surgir de los problemas irresolubles de forma eficiente en tiempo polinomial en base al dato de entrada, surge la Computación Natural como alternativa a la computación clásica. En esta disciplina se trata de o bien utilizar la naturaleza como base de cómputo o bien, simular su comportamiento para obtener mejores soluciones a los problemas que los encontrados por la computación clásica. Dentro de la computación natural, y como una representación a nivel celular, surge la Computación con Membranas. La primera abstracción de las membranas que se encuentran en las células, da como resultado los P sistemas de transición. Estos sistemas, que podrían ser implementados en medios biológicos o electrónicos, son la base de estudio de esta Tesis. En primer lugar, se estudian las implementaciones que se han realizado, con el fin de centrarse en las implementaciones distribuidas, que son las que pueden aprovechar las características intrínsecas de paralelismo y no determinismo. Tras un correcto estudio del estado actual de las distintas etapas que engloban a la evolución del sistema, se concluye con que las distribuciones que buscan un equilibrio entre las dos etapas (aplicación y comunicación), son las que mejores resultados presentan. Para definir estas distribuciones, es necesario definir completamente el sistema, y cada una de las partes que influyen en su transición. Además de los trabajos de otros investigadores, y junto a ellos, se realizan variaciones a los proxies y arquitecturas de distribución, para tener completamente definidos el comportamiento dinámico de los P sistemas. A partir del conocimiento estático –configuración inicial– del P sistema, se pueden realizar distribuciones de membranas en los procesadores de un clúster para obtener buenos tiempos de evolución, con el fin de que la computación del P sistema sea realizada en el menor tiempo posible. Para realizar estas distribuciones, hay que tener presente las arquitecturas –o forma de conexión– de los procesadores del clúster. La existencia de 4 arquitecturas, hace que el proceso de distribución sea dependiente de la arquitectura a utilizar, y por tanto, aunque con significativas semejanzas, los algoritmos de distribución deben ser realizados también 4 veces. Aunque los propulsores de las arquitecturas han estudiado el tiempo óptimo de cada arquitectura, la inexistencia de distribuciones para estas arquitecturas ha llevado a que en esta Tesis se probaran las 4, hasta que sea posible determinar que en la práctica, ocurre lo mismo que en los estudios teóricos. Para realizar la distribución, no existe ningún algoritmo determinista que consiga una distribución que satisfaga las necesidades de la arquitectura para cualquier P sistema. Por ello, debido a la complejidad de dicho problema, se propone el uso de metaheurísticas de Computación Natural. En primer lugar, se propone utilizar Algoritmos Genéticos, ya que es posible realizar alguna distribución, y basada en la premisa de que con la evolución, los individuos mejoran, con la evolución de dichos algoritmos, las distribuciones también mejorarán obteniéndose tiempos cercanos al óptimo teórico. Para las arquitecturas que preservan la topología arbórea del P sistema, han sido necesarias realizar nuevas representaciones, y nuevos algoritmos de cruzamiento y mutación. A partir de un estudio más detallado de las membranas y las comunicaciones entre procesadores, se ha comprobado que los tiempos totales que se han utilizado para la distribución pueden ser mejorados e individualizados para cada membrana. Así, se han probado los mismos algoritmos, obteniendo otras distribuciones que mejoran los tiempos. De igual forma, se han planteado el uso de Optimización por Enjambres de Partículas y Evolución Gramatical con reescritura de gramáticas (variante de Evolución Gramatical que se presenta en esta Tesis), para resolver el mismo cometido, obteniendo otro tipo de distribuciones, y pudiendo realizar una comparativa de las arquitecturas. Por último, el uso de estimadores para el tiempo de aplicación y comunicación, y las variaciones en la topología de árbol de membranas que pueden producirse de forma no determinista con la evolución del P sistema, hace que se deba de monitorizar el mismo, y en caso necesario, realizar redistribuciones de membranas en procesadores, para seguir obteniendo tiempos de evolución razonables. Se explica, cómo, cuándo y dónde se deben realizar estas modificaciones y redistribuciones; y cómo es posible realizar este recálculo. Abstract Natural Computing is becoming a useful alternative to classical computational models since it its able to solve, in an efficient way, hard problems in polynomial time. This discipline is based on biological behaviour of living organisms, using nature as a basis of computation or simulating nature behaviour to obtain better solutions to problems solved by the classical computational models. Membrane Computing is a sub discipline of Natural Computing in which only the cellular representation and behaviour of nature is taken into account. Transition P Systems are the first abstract representation of membranes belonging to cells. These systems, which can be implemented in biological organisms or in electronic devices, are the main topic studied in this thesis. Implementations developed in this field so far have been studied, just to focus on distributed implementations. Such distributions are really important since they can exploit the intrinsic parallelism and non-determinism behaviour of living cells, only membranes in this case study. After a detailed survey of the current state of the art of membranes evolution and proposed algorithms, this work concludes that best results are obtained using an equal assignment of communication and rules application inside the Transition P System architecture. In order to define such optimal distribution, it is necessary to fully define the system, and each one of the elements that influence in its transition. Some changes have been made in the work of other authors: load distribution architectures, proxies definition, etc., in order to completely define the dynamic behaviour of the Transition P System. Starting from the static representation –initial configuration– of the Transition P System, distributions of membranes in several physical processors of a cluster is algorithmically done in order to get a better performance of evolution so that the computational complexity of the Transition P System is done in less time as possible. To build these distributions, the cluster architecture –or connection links– must be considered. The existence of 4 architectures, makes that the process of distribution depends on the chosen architecture, and therefore, although with significant similarities, the distribution algorithms must be implemented 4 times. Authors who proposed such architectures have studied the optimal time of each one. The non existence of membrane distributions for these architectures has led us to implement a dynamic distribution for the 4. Simulations performed in this work fix with the theoretical studies. There is not any deterministic algorithm that gets a distribution that meets the needs of the architecture for any Transition P System. Therefore, due to the complexity of the problem, the use of meta-heuristics of Natural Computing is proposed. First, Genetic Algorithm heuristic is proposed since it is possible to make a distribution based on the premise that along with evolution the individuals improve, and with the improvement of these individuals, also distributions enhance, obtaining complexity times close to theoretical optimum time. For architectures that preserve the tree topology of the Transition P System, it has been necessary to make new representations of individuals and new algorithms of crossover and mutation operations. From a more detailed study of the membranes and the communications among processors, it has been proof that the total time used for the distribution can be improved and individualized for each membrane. Thus, the same algorithms have been tested, obtaining other distributions that improve the complexity time. In the same way, using Particle Swarm Optimization and Grammatical Evolution by rewriting grammars (Grammatical Evolution variant presented in this thesis), to solve the same distribution task. New types of distributions have been obtained, and a comparison of such genetic and particle architectures has been done. Finally, the use of estimators for the time of rules application and communication, and variations in tree topology of membranes that can occur in a non-deterministic way with evolution of the Transition P System, has been done to monitor the system, and if necessary, perform a membrane redistribution on processors to obtain reasonable evolution time. How, when and where to make these changes and redistributions, and how it can perform this recalculation, is explained.

Distribution of indole-3-acetic acid in Petunia hybrida shoot tip cuttings and relationship between auxin transport, carbohydrate metabolism and adventitious root formation.

To determine the contribution of polar auxin transport (PAT) to auxin accumulation and to adventitious root (AR) formation in the stem base of Petunia hybrida shoot tip cuttings, the level of indole-3-acetic acid (IAA) was monitored in non-treated cuttings and cuttings treated with the auxin transport blocker naphthylphthalamic acid (NPA) and was complemented with precise anatomical studies. The temporal course of carbohydrates, amino acids and activities of controlling enzymes was also investigated. Analysis of initial spatial IAA distribution in the cuttings revealed that approximately 40 and 10% of the total IAA pool was present in the leaves and the stem base as rooting zone, respectively. A negative correlation existed between leaf size and IAA concentration. After excision of cuttings, IAA showed an early increase in the stem base with two peaks at 2 and 24h post excision and, thereafter, a decline to low levels. This was mirrored by the expression pattern of the auxin-responsive GH3 gene. NPA treatment completely suppressed the 24-h peak of IAA and severely inhibited root formation. It also reduced activities of cell wall and vacuolar invertases in the early phase of AR formation and inhibited the rise of activities of glucose-6-phosphate dehydrogenase and phosphofructokinase during later stages. We propose a model in which spontaneous AR formation in Petunia cuttings is dependent on PAT and on the resulting 24-h peak of IAA in the rooting zone, where it induces early cellular events and also stimulates sink establishment. Subsequent root development stimulates glycolysis and the pentosephosphate pathway