Estudio selvícola-industrial de las principales especies arbóreas, de las familias de las leguminosas (Mimosáceas, Papilionáceas y Cesalpináceas) con miras a la aplicación de sus maderas

Para la redacción de esta memoria la consideraremos dividida en los siguientes apartados: 1º- Estudio botánico Será muy ligero tanto el de las- familias como el de los géneros y especie s, ya que por la razones expuestas en la Memoria común, no se puede hacer-un estudio más profundo. 2º-.Estudio selvícola en el que se expondrán las formaciones vegetales, en cuya composición intervienen especies de las familias de las leguminosas (Mímosaceas, PapiÍionaceas y SesalpinaceasX asi como la posible regeneración del bosque que el que es tan representado en dichas especies. 3º— Aplicaciones. Con una relación de las distintas propiedades de las maderas de las especies en estudia y como consecuencia sus posibles aplicaciones, así como las que hoy en día tienen. 4º-.Estudio económico En el hacemos una exposición de las explotaciones forestales de la Colonia, así como de los medios por ellas utilizados Dará el aprovechamiento de la riqueza forestal Por ultimo damos un Índice bibliográfico de indudable interés del cual se ha hecho uso para la redacción de: esta Memoria

Estudio selvícola-industrial de las principales especies arbóreas de las familias de las Burseráceas, Sapotáceas y Meliáceas desde el punto de vista de las aplicaciones de sus maderas

Pretendemos en el hacer un estudio lo más completo posible dentro de. los medios de que actualmente disponemos, de todas, las especies existentes' en la Colonia pertenecientes a las tres familias, cuyo estudio se nos ha encomendado, deteniéndonos especialmente en aquellas cuya, .importancia actual o posible por su calidad, o su .abundancia así lo aconsejen. Por este motivo dedicamos una .atención preferente al “okume” que hasta el día ha constituido la, base de la economía forestal de la Guinea -Continental.

Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Identificación y análisis funcional de genes implicados en la homeostasis de níquel en la bacteria endosimbiótica de leguminosas Rhizobium leguminosarum

La asociación Rhizobium-leguminosa constituye una interacción planta-microorganismo particularmente beneficiosa a nivel medioambiental debido a su capacidad promotora del crecimiento vegetal en condiciones de deficiencia de nitrógeno. Se ha demostrado que una excesiva concentración de metales pesados en el suelo afecta negativamente la competitividad bacteriana y al desarrollo de interacciones diazotróficas eficientes (Chaudri et al., 2000; Pereira et al., 2006). Por otro lado, el suministro de metales como Fe, Mo, Ni o Cu es fundamental para la biosíntesis de enzimas bacterianas relacionadas con el proceso de fijación de nitrógeno que ocurre en el interior de los nódulos de las leguminosas (Moreau et al., 1995). Con objeto de identificar sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel en bacterias endosimbióticas, se ha llevado a cabo una mutagénesis mediante inserción aleatoria de un minitransposón derivado de Tn5 en Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM1137, una cepa capaz de resistir elevadas concentraciones de níquel y cobalto. Como resultado de esta mutagénesis se han obtenido 14 mutantes incapaces de crecer en medios suplementados con NiCl2. La localización de la inserción en estos mutantes muestra que una elevada proporción de los genes afectados codifican proteínas de membrana o proteínas secretadas. En paralelo, se ha obtenido la secuencia del genoma de la cepa UPM1137, lo que permite realizar estudios in silico comparando los genomas disponibles de varias cepas de R. leguminosarum bv. viciae, que presentan una menor sensibilidad a metales. El análisis bioinformático de los genomas secuenciados y la caracterización fenotípica de los mutantes obtenidos permitirá identificar potenciales sistemas de resistencia y su contribución a la homeostasis de metales.

Nuevos mecanismos moleculares de tolerancia a sequía y otros tipos de estrés abiótico en especies arbóreas de interés económico

Las masas forestales tienen una importancia colosal para nuestra sociedad y el conjunto de la biosfera. Estudios recientes a escala mundial indican que la sequía es el factor abiótico que más afecta a su crecimiento y supervivencia, seguida por las temperaturas extremas y la salinidad. Aunque comprender los mecanismos con que las especies arbóreas toleran estas formas de estrés tiene un interés aplicado evidente, dichos mecanismos se han estudiado mucho más en especies herbáceas modelo o de interés agronómico. Existen sin embargo diferencias notables entre ellas, como se demuestra en esta tesis y en otros trabajos recientes. Nuestro estudio se centra concretamente en la respuesta molecular del chopo –el sistema modelo forestal más desarrollado– al estrés abiótico, con particular énfasis en la sequía. Utilizando una estrategia proteómica y tratamientos controlados, hemos identificado componentes mayoritarios de dicha respuesta. Su participación en la misma se ha validado mediante análisis transcripcionales detallados utilizando tecnología qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real). Hemos identificado proteínas cuyo nexo funcional con mecanismos de tolerancia ya era conocido, como chaperonas moleculares sHSP o enzimas que atenúan el estrés oxidativo, pero también proteínas cuya relación funcional con el estrés es menos clara o incluso novedosa, como polifenol oxidasas (PPO), deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR), o bicupinas (BIC), entre otras. El cuerpo central de la tesis consiste en la caracterización detallada de una PPO inusual, cuya inducción por estrés hídrico se describe por vez primera. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en plantas, si bien su número es muy variable de unas especies a otras. Algunas, como nogal, tienen un único gen, mientras que Arabidopsis no tiene ninguno. En la última versión del genoma de chopo hemos identificado un total de 12 miembros bona fide, corrigiendo trabajos previos, y hemos caracterizado su expresión individual ante diferentes situaciones de estrés controlado y tratamientos hormonales. La isoforma antedicha es el único miembro de la familia que responde claramente a la deshidratación. También responde a salinidad y a la mayor parte de tratamientos hormonales ensayados, pero no a daño mecánico o tratamientos con metil jasmonato. Esto la diferencia de enzimas homólogas presentes en otras especies de plantas, que se han relacionado experimentalmente con estrés biótico. Los patrones de acumulación de transcritos en árboles adultos son compatibles con un papel protector frente a la sequía. La integración de nuestros estudios funcionales y filogenéticos sugiere que la familia ha sufrido un proceso reciente de diversificación y neofuncionalización, siendo la protección frente a deshidratación su papel primigenio. Aunque se conoce la actividad bioquímica in vitro de este tipo de enzimas, sus sustratos naturales son esencialmente una incógnita. Mediante expresión heteróloga en Escherichia coli BL21(DE3) hemos detectado que la enzima de chopo es capaz de oxidar L-DOPA a dopaquinona, siendo menos activa frente a otros sustratos. Por otra parte, hemos demostrado su localización cloroplástica mediante transformación transitoria de protoplastos con fusiones a la proteína fluorescente YFP. Mediante la obtención de plantas transgénicas de A. thaliana hemos demostrado que la enzima de chopo aumenta considerablemente la tolerancia in vivo frente a la deshidratación y al estrés salino. El análisis fenotípico detallado de las líneas transgénicas, combinando múltiples metodologías, nos ha permitido sustanciar que la tolerancia tiene una base compleja. Esta incluye una mayor protección del sistema fotosintético, una capacidad antioxidante muy incrementada y la acumulación de solutos osmoprotectores como la prolina. Los análisis metabolómicos nos han permitido asociar la expresión de la proteína a la síntesis de un flavano no descrito previamente en A. thaliana, vinculando la enzima de chopo con la síntesis de fenilpropanoides. También hemos observado alteraciones en los niveles hormonales que podrían subyacer a efectos pleiotrópicos con interés aplicado, como un aumento consistente del tamaño de la planta o el acortamiento del ciclo de crecimiento. Además de aportar datos novedosos sobre la funcionalidad in vivo de esta familia de oxidasas, los resultados de esta tesis demuestran que los árboles son sistemas de estudio interesantes para caracterizar nuevas estrategias de tolerancia al estrés abiótico con potencial aplicado. ABSTRACT Forests masses have an extraordinary importance for our society and the biosphere. Recent worldwide studies indicate that drought is the abiotic factor that affects more their growing and survival, followed by extreme temperatures and salinity. The understanding of how the arboreal species tolerate the stress has an evident practical interest, but their mechanisms have been studied much more in herbaceous species or with agronomic interest. However, considerable differences exist between them, as this thesis and recent studies show. Our study is focused on the molecular response of the poplar –the more developed forestry model system- to abiotic stress, specifically focused in the drought. Using a proteomic strategy and controlled treatments, we have identified main components in such response. Its participation has been validated through transcriptional analysis using qRT-PCR technology. We have identified proteins whose functional connection with tolerance mechanisms were already known, as molecular chaperones sHSP or enzymes that attenuate the oxidative stress, but also some proteins whose functional relationship with the stress is less clear or even novel, as polifenol oxidases (PPO), short chain deshidrogenases/reductases (SDR), or bicupines (BIC), among others. The central body of the thesis consists of the detailed characterization of an unsual PPO, whose induction due to drought stress is first described. These enzymes are thoroughly distributed in plants, but their number of members is very variable among species. Some of them, as the walnut tree, have a single gene, while Arabidopsis has none. We have identified a total of 12 members in the last version of the poplar genome, correcting previous works, and have characterized their individual expression against different situations of controlled stress and hormone treatments. The aforementioned isoform is the only member of the family that responds clearly to the drought. It also reacts to salinity and the majority of hormonal treatments tested, but it does not respond to mechanical damage or treatments with methyl jasmonate. This is the difference with homologue enzymes present in other plant species, which have been related experimentally with abiotic stress. The accumulation patterns of transcripts in adult trees are compatible with a protector role against drought. The integration of our functional and phylogenetic studies suggests that the family has suffered a recent process of diversification and neofunctionalization, being the protection against drought their original role. Although the in vitro biochemistry activity of this kind of enzymes is already known, their natural substracts are essentially a mystery. By means of heterologous expression of Escherichia coli BL21(DE3) we have detected that the enzyme of poplar is able to oxidize L-DOPA to dopaquinone, being less active against other substrates. Additionally, we have proven its chloroplastic location with transitory transformation of protoplasts with YFP protein fusion. By means of getting transgenic plants of A. thaliana, we have demonstrated that the poplar enzyme increases notably the in vivo tolerance against the drought and salinity stresses. The phenotypic analysis of the transgenic lines, and the use of multiple methodologies, allowed us to test the complexity of the tolerance. This includes a major protection of the photosynthetic system, a very increased antioxidant capacity and the accumulation of osmoprotectant solutes as the proline. The metabolic analysis has allowed to associate the protein expression with the synthesis of a Flavan non described previously in A. thalaiana, linking the enzyme of poplar with the synthesis of phenylpropanoids. We have observed alterations in the hormonal levels that could underlie pleiotropic effects with applied interest, as a consistent increase of the size of the plant and the reduction of the growth cycle. The results of this thesis, in addition to provide novel data about the in vivo functionality of the oxidase family, demonstrate that the trees are interesting systems of study to characterize new strategies of tolerance against abiotic stress with applied potential.

Diversidad y producción del estrato herbáceo bajo las copas de encima en una dehesa del centro peninsular.

La dehesa es el sistema agroforestal español más conocido y estudiado; hoy en día está protegido por la Directiva Hábitats 43/92/CEE (6310-Dehesas perennifolias de Quercus ssp.) e incluida en la red Natura 2000. El objetivo de este trabajo es analizar la contribución del arbolado a la producción y diversidad de los pastos herbáceos en la dehesa del centro peninsular. El trabajo se ha desarrollado en la finca “El Dehesón del Encinar” (Término Municipal de Oropesa, provincia de Toledo), en una parcela de 5 ha representativa de la dehesa tipo en la zona. Se muestrearon marcos de 50 x 50 cm de lado considerando dos posiciones bajo copa según la proximidad del tronco (1/2 radio y en el borde) en cuatro orientaciones: Norte, Sur, Este y Oeste, en 12 encinas en distintas localizaciones dentro de la parcela. Para cada marco de muestreo se estudió la composición florística completa de los pastos herbáceos y la contribución de cada especie a la producción en materia seca. Se utilizó un modelo GLM para ver la relación entre la riqueza específica y otras variables (producción, calidad de estación y situación bajo copa). La diversidad beta fue medida mediante el índice de Whittaker, comparando las comunidades herbáceas en las distintas situaciones presentes. En la zona de estudio encontramos que la calidad de los pastos herbáceos está íntimamente relacionada con la riqueza específica a través de la abundancia de leguminosas. Los valores superiores de riqueza se encontraron en los bordes de las copas del arbolado así como en encinas situadas en las zonas más ricas en leguminosas de la parcela general. Con respecto a la diversidad beta, no existen diferencias notables entre las comunidades de pastos herbáceos bajo las distintas encinas estudiadas; las localizaciones de la parcela con mayor riqueza específica y producción de leguminosas también muestran mayores diferencias (índices de Whittaker superiores) en la comparación de comunidades a distintas distancias del fuste (>50% de especies distintas). Constatamos y cuantificamos la importancia del estrato arbóreo en la producción y diversidad de los pastos herbáceos de la dehesa

Año Internacional de los Bosques: Tópicos y realidades

Declarado “Año internacional de los bosques”, 2011 tenía como objetivo incrementar los esfuerzos para conservar las masas arbóreas del planeta y recordar los beneficios que nos proporcionan. Es el momento de despejar algunas cuestiones: ¿A qué llamamos bosques? ¿Qué evolución han tenido en nuestro país? ¿Cuál es la realidad sin tópicos ni eufemismos?

Estudio de la implantación de una parcela demostrativa de cultivo agroforestal en el Parque Nacional de La Visite en el Departamento del sudeste Haití.

En el estudio se elabora un diagnóstico de las prácticas agrícolas de los habitantes del Parque Nacional de La Visite y de sus necesidades para hacer un diseño demostrativo de parcela agroforestal. Con la introducción de árboles en las parcelas se puede ayudar a mitigar la erosión y la baja fertilidad de sus tierras, a parte de poder controlar la deforestación, debido a la introducción de especies arbóreas de crecimiento rápido, y obtención de beneficios por la producción de los árboles frutales. Para poder diseñar la parcela de ensayo, se realizaron entrevistas a las familias de la zona, para conocer su forma de vida, evaluar sus prácticas agrícolas e involucrarles en el proyecto. . En la parcela de estudio se realizaron análisis de suelos y caracterización del clima para poder hacer la selección de las especies arbóreas teniendo en cuenta esos criterios, y “levantamiento topográfico” con GPS para conocer la topografía del terreno. Posteriormente se elabora un diseño de sistema agroforestal, teniendo en cuenta la combinación con los cultivos tradicionales. Este estudio es una parcela demostrativa, que constituye un punto de partida a futuras actuaciones.

Ecología, tipología, valoración y alternativas silvopascícolas de los Quejigares (Quercus faginea Lamk) de Guadalajara

El quejigo (Quercus faginea Lamk.) es una de las especies arbóreas más características y abundantes en España. El valor ecológico de sus masas es muy alto, pero su actual producción económica es muy baja. En el presente trabajo se estudian las características ecológicas, silvícolas y pascícolas de los quejigares de Guadalajara para tratar de determinar su forma más adecuada de utilización. En el capítulo 1 se recopila, analiza y resume toda la información existente anteriormente sobre el quejigo en España. En el capítulo 2 se estudia la ecología del quejigo en la provincia de Guadalajara, incluyendo los siguientes temas: - Estudio ecológico de los quejigares: clima, suelo, posición topográfica, fauna, acción antrópica, vegetación, etc. - Establecimiento de una tipología forestal para las masas de quejigos. - Cuantificación del desfronde, la biomasa, el efecto fertilizador y la producción del quejigar experimental de Barriopedro. - Estudio de los sistemas de regeneración natural y artificial en el quejigo- - Análisis de la composición específica de un pastizal de quejigar y de las variaciones provocadas en él por claras de distinta intensidad en el estrato arbóreo. II En el capítulo 3 se valora la calidad del arbolado y del pastizal en los quejigares de Guadalajara. En el capítulo 4, y como resultado de los estudios realizados, se concluye analizando las posibilidades de utilización de los quejigares de la provincia: roturación y cultivo agrícola, repoblación forestal, implantación de pastizales, conversión en monte alto, adehesamiento, y mantenimiento del tallar.

Historia holocena de los pinares montanos de los sistemas Central y Cantábrico: Un objetivo con dos enfoques, biogeográfico y dendroecológico

Los estudios paleoecológicos holocenos basados en macro- y megafósiles encierran un gran valor debido a que su información tiene generalmente carácter local, su origen es conocido, pueden ser datados directamente mediante el método radiocarbónico, y pueden identificarse a un nivel taxonómicamente preciso. Sin embargo son pocas las áreas del Sur de Europa en las que sea conocida una alta densidad de yacimientos con restos leñosos de gran tamaño. En esta tesis, se presentan datos de 53 yacimientos de la sierra de Gredos y de la cordillera Cantábrica (Península Ibérica). Los restos fueron hallados en ambientes variados, como zonas higroturbosas, turberas erosionadas o lagos, y fueron identificadas mediante el estudio de la anatomía de la madera o mediante rasgos morfológicos. En la sierra de Gredos, la evidencia paleobotánica indica la existencia de un panorama relativamente estable a lo largo del Holoceno medio y principio del Holoceno final y sugiere la persistencia, a lo largo de milenios, de un piso de pinares ampliamente distribuído en cotas altas de la sierra. La información obtenida de piñas y frutos mejoran la información taxonómica disponible y revelan la existencia tanto de Pinus sylvestris como de Pinus nigra en estas sierras durante el Holoceno. La datación radiocarbónica, medición de anillos de crecimiento y sincronización preliminar de 26 secciones de troncos de subfósiles demuestran el potencial de este material de las montañas de Iberia central en la obtención de cronologías holocenas de pino. En la cordillera Cantábrica, los datos aportan información espacialmente precisa de distribuciones de ciertas especies arbóreas durante el Holoceno. En las zonas centrales de la cordillera, han sido hallados fundamentalmente restos de pino, mientras que en las zonas más occidentales los pinos estás ausentes y los restos encontrados corresponden a otras especies de caducifolios (Betula, Salix, Quercus) y arbustos (Erica, Fabaceae) Esta información paleobiogeográfica constrasta con la distribución natural actual de Pinus sylvestris y Pinus nigra en el área de estudio. En la sierra de Gredos, la naturalidad de las escasos rodales de pinos que aún persisten ha sido discutida, mientras que en la cordillera Cantábrica, la única especie del grupo que persiste es P. sylvestris y está localizada en unos pocos relictos. El clima pudo haber jugado un papel importante en una primera fase de declive de los pinares durante el Holoceno inicial, mostrado en numerosos registros polínicos de manera casi sincrónica y asociada a una expansión de frondosas. Sin embargo la información histórica disponible y la comparación entre las áreas de distribución de los pinares en el presente, modelizada y en momentos anteriores a la la generalización de la presión antrópica sugiere que durante los últimos dos milenios, la actividad humana ha sido responsable de la desaparición de estas especies como árboles naturales en áreas extensas. ABSTRACTMacro- and megafossil studies provide information of great value in palaeoecology because such evidence is spatially precise, directly radiocarbon dated and usually taxon-specific. However, few areas of southern Europe have a high density of sites with Holocene woody remains. Here, local data from 53 sites in the Gredos Mountains and the Cantabrian Range (Iberian Peninsula) is presented. Woody remains were recovered from mires, eroded peat bogs and lakes and were identified by their wood anatomy or morphological traits. In the Gredos Mountains, palaeobotanical evidence portrays a relatively stable picture of tree distribution over the mid- and beggining of the late-Holocene, and suggests the persistence of a widespread belt of pinewoods. Cones and fruits enlarge the taxonomic information available and reveal that both Pinus sylvestris and Pinus nigra were present locally during the Holocene. Radiocarbon dating, tree ring measurement and preliminary cross-dating of 26 pine sub-fossil logs demonstrate the potential of obtaining a long pine chronology from subfossil wood from the mountains of Central Iberia. In the Cantabrian Range the data provide spatially precise evidence of tree distribution in the region during the Holocene. Pines were mostly identified in the central areas, whereas at the western edge no pine evidence was detected and deciduous trees (Betula, Salix, Quercus) and shrubs (Erica, Fabaceae) were identified. This palaeoecological information contrasts with the current natural distribution ranges of P. sylvestris and P. nigra in the study area. In the Gredos Mountains, the naturality of the few pine stands currently growing has been heavily debated. In the Cantabrian Range P. sylvestris is the only pine species that is today present, and its natural presence is now limited to a few enclaves. Climate may have played a key role in the early-Holocene, as pollen archives document a pine demise that is synchronous with the spread of broadleaved taxa. However, available historical data and the comparison of the reconstructed distribution of pinewoods before extensive human forest disturbance with both present and modelled distributions suggests that during the last two millennia, anthropogenic activity may have removed these species as native trees from a large territory.

Análisis filogenético de bacterias endosimbióticas de Genista numidica

Los rizobios son bacterias del suelo capaces de formar unas estructuras especializadas en raíces de leguminosas donde reducen dinitrógeno. Algunas de estas leguminosas, como Genista numidica Spach, juegan un importante papel ecológico y económico por la fertilización y la remediación de suelos áridos, lo que ha impulsado el estudio y la caracterización de los rizobios específicos. En la presente investigación se analizan 53 cepas de rizobios aisladas de nódulos de raíces de G. numidica de la costa de Argelia. La diversidad genética de los aislados se llevó a cabo mediante la secuenciación del gen 16S rRNA y del espacio intergénico (ITS), región situada entre los genes 16S y 23S rRNA. Los endosimbiontes de G. numidica muestran una gran diversidad filogenética. Las secuencias de los aislados mostraron proximidad a ?-proteobacterias (Bradyrhizobium sp, Sphingobium sp) y ?-proteobacterias.

Presencia de sistemas de secreción de patógenos en bacterias endosimbióticas aisladas de Lupinus de la península Ibérica

Los rizobios son bacterias endosimbióticas capaces de fijar nitrógeno en estructuras especializadas de leguminosas. Esta simbiosis es altamente específica y depende, entre otros factores, de la capacidad de los rizobios de secretar proteínas efectoras a las células vegetales. Se han descrito diferentes sistemas de secreción en patógenos animales y vegetales y posteriormente también se han encontrado en algunos rizobios. En este trabajo se presenta el estudio de varios sistemas de secreción identificados en dos cepas LmjC e ISLU101 aisladas de Lupinus marie-josephae y Lupinus angustifolius respectivamente. LmjC posee un sistema de secreción tipo III formado por agrupación de 33 genes cuya expresión dependería del activador transcripcional TtsI mediado a su vez por flavonoides secretados por la planta huésped. La cepa ISLU101 tiene dos sistemas de tipo VI de 19 y 16 genes cada uno. La importancia en la simbiosis de estos sistemas se está estudiando en estos momentos.

Caracterización de bacterias endosimbióticas de Cytisus triflorus, una leguminosa útil para la restauración de suelos en el norte de África

La restauración de suelos degradados y pobres del norte de África puede producirse gracias al crecimiento espontáneo de leguminosas arbustivas como Cytisus triflorus L¿Herit. Parte del éxito de esta planta se debe a que es capaz de formar nódulos en sus raíces ocupados por bacterias denominadas rizobios que aportan dinitrógeno atmosférico fijado a la planta a cambio de fotosintatos. En este trabajo se presenta la caracterización de 37 rizobios aislados de C. triflorus en el norte de Argelia. Se indica morfología y color de las colonias, tiempo de generación, capacidad de nodulación con distintas plantas hospedadoras y tipos de nódulos que forman.

Análisis genómico y funcional de los sistemas de Quorum Sensing en Rhizobium leguminosarum

Rhizobium leguminosarum (Rl) es una alfa-proteobacteria capaz de establecer una simbiosis diazotrófica con distintas leguminosas. A pesar de la importancia de esta simbiosis en el balance global del ciclo del nitrógeno, muy pocos genomas de rhizobios han sido secuenciados, que aporten nuevos conocimientos relacionados con las características genéticas que contribuyen a importantes procesos simbióticos. Únicamente tres secuencias completas de Rl han sido publicadas: Rl bv. viciae 3841 y dos genomas de Rl bv. trifolii (WSM1325 y WSM2304), ambos simbiontes de trébol. La secuencia genómica de Rlv UPM791 se ha determinado por medio de secuenciación 454. Este genoma tiene un tamaño aproximado de 7.8 Mb, organizado en un cromosoma y 5 replicones extracromosómicos, que incluyen un plásmido simbiótico de 405 kb. Este nuevo genoma se ha analizado en relación a las funciones simbióticas y adaptativas en comparación con los genomas completos de Rlv 3841 y Rl bv. trifolii WSM1325 y WSM2304. Mientras que los plásmidos pUPM791a y b se encuentran conservados, el plásmido simbiótico pUPM791c exhibe un grado de conservación muy bajo comparado con aquellos descritos en las otras cepas de Rl. Uno de los factores implicados en el establecimiento de la simbiosis es el sistema de comunicación intercelular conocido como Quorum Sensing (QS). El análisis del genoma de Rlv UPM791 ha permitido la identificación de dos sistemas tipo LuxRI mediados por señales de tipo N-acyl-homoserina lactonas (AHLs). El análisis mediante HPLC-MS ha permitido asociar las señales C6-HSL, C7-HSL y C8-HSL al sistema rhiRI, codificado en el plásmido simbiótico; mientras que el sistema cinRI, localizado en el cromosoma, produce 3OH-C14:1-HSL. Se ha identificado una tercera sintasa (TraI) codificada en el plásmido simbiótico, pero su regulador correspondiente se encuentra truncado debido a un salto de fase. Adicionalmente, se han encontrado tres reguladores de tipo LuxR-orphan que no presentan una sintasa LuxI asociada. El efecto potencial de las señales tipo AHL se ha estudiado mediante una estrategia de quorum quenching, la cual interfiere con los sistemas de QS de la bacteria. Esta estrategia está basada en la introducción del gen aiiA de Bacillus subtilis, que expresa constitutivamente una enzima lactonasa degradadora de AHLs. Para llevar a cabo el análisis en condiciones simbióticas, se ha desarrollado un sistema de doble marcaje que permite la identificación basado en los marcadores gusA y celB, que codifican para una enzima β–glucuronidasa y una β–galactosidasa termoestable, respectivamente. Los resultados obtenidos indican que Rlv UPM791 predomina sobre la cepa Rlv 3841 para la formación de nódulos en plantas de guisante. La baja estabilidad del plásmido que codifica para aiiA, no ha permitido obtener una conclusión definitiva sobre el efecto de la lactonasa AiiA en competitividad. Con el fin de analizar el significado y la regulación de la producción de moléculas señal tipo AHL, se han generado mutantes defectivos en cada uno de los dos sistemas de QS. Se ha llevado a cabo un análisis detallado sobre la producción de AHLs, formación de biofilm y simbiosis con plantas de guisante, veza y lenteja. El efecto de las deleciones de los genes rhiI y rhiR en Rlv UPM791 es más drástico en ausencia del plásmido pUPM791d. Mutaciones en cinI o cinRIS muestran tanto ausencia de señales, como producción exclusivamente de las de bajo peso molecular, respectivamente, producidas por el sistema rhiRI. Estas mutaciones mostraron un efecto importante en simbiosis. El sistema rhiRI se necesita para un comportamiento simbiótico normal. Además, mutantes cinRIS generaron nódulos blancos e ineficientes, mientras que el mutante cinI fue incapaz de producir nódulos en ninguna de las leguminosas utilizadas. Dicha mutación resultó en la inestabilización del plasmido simbiótico por un mecanismo dependiente de cinI que no ha sido aclarado. En general, los resultados obtenidos indican la existencia de un modelo de regulación dependiente de QS significativamente distinto a los que se han descrito previamente en otras cepas de R. leguminosarum, en las cuales no se había observado ningún fenotipo relevante en simbiosis. La regulación de la producción de AHLs Rlv UPM791 es un proceso complejo que implica genes situados en los plásmidos UPM791c y UPM791d, además de la señal 3-OH-C14:1-HSL. Finalmente, se ha identificado un transportador de tipo RND, homologo a mexAB-oprM de P. aeruginosa e implicado en la extrusión de AHLs de cadena larga. La mutación he dicho transportador no tuvo efectos apreciables sobre la simbiosis. ABSTRACT Rhizobium leguminosarum (Rl) is a soil alpha-proteobacterium that establishes a diazotrophic symbiosis with different legumes. Despite the importance of this symbiosis to the global nitrogen cycling balance, very few rhizobial genomes have been sequenced so far which provide new insights into the genetic features contributing to symbiotically relevant processes. Only three complete sequences of Rl strains have been published: Rl bv. viciae 3841, harboring six plasmids (7.75 Mb) and two Rl bv. trifolii (WSM1325 and WSM2304), both clover symbionts, harboring 5 and 4 plasmids, respectively (7.41 and 6.87 Mb). The genomic sequence of Rlv UPM791 was undertaken by means of 454 sequencing. Illumina and Sanger reads were used to improve the assembly, leading to 17 final contigs. This genome has an estimated size of 7.8 Mb organized in one chromosome and five extrachromosomal replicons, including a 405 kb symbiotic plasmid. Four of these plasmids are already closed, whereas there are still gaps in the smallest one (pUPM791d) due to the presence of insertion elements and repeated sequences, which difficult the assembly. The annotation has been carried out thanks to the Manatee pipeline. This new genome has been analyzed as regarding symbiotic and adaptive functions in comparison to the Rlv 3841 complete genome, and to those from Rl bv. trifolii strains WSM1325 and WSM2304. While plasmids pUPM791a and b are conserved, the symbiotic plasmid pUPM791c exhibited the lowest degree of conservation as compared to those from the other Rl strains. One of the factors involved in the symbiotic process is the intercellular communication system known as Quorum Sensing (QS). This mechanism allows bacteria to carry out diverse biological processes in a coordinate way through the production and detection of extracellular signals that regulate the transcription of different target genes. Analysis of the Rlv UPM791 genome allowed the identification of two LuxRI-like systems mediated by N-acyl-homoserine lactones (AHLs). HPLC-MS analysis allowed the adscription of C6-HSL, C7-HSL and C8-HSL signals to the rhiRI system, encoded in the symbiotic plasmid, whereas the cinRI system, located in the chromosome, produces 3OH-C14:1-HSL, previously described as “bacteriocin small”. A third synthase (TraI) is encoded also in the symbiotic plasmid, but its cognate regulator TraR is not functional due to a fameshift mutation. Three additional LuxR orphans were also found which no associated LuxI-type synthase. The potential effect of AHLs has been studied by means of a quorum quenching approach to interfere with the QS systems of the bacteria. This approach is based upon the introduction into the strains Rl UPM791 and Rl 3841 of the Bacillus subtilis gene aiiA expressing constitutively an AHL-degrading lactonase enzyme which led to virtual absence of AHL even when AiiA-expressing cells were a fraction of the total population. No significant effect of AiiA-mediated AHL removal on competitiveness for growth in solid surface was observed. For analysis under symbiotic conditions we have set up a two-label system to identify nodules produced by two different strains in pea roots, based on the markers gusA and celB, encoding a β–glucuronidase and a thermostable β–galactosidase enzymes, respectively. The results obtained show that Rlv UPM791 outcompetes Rlv 3841 for nodule formation in pea plants, and that the presence of the AiiA plasmid does not significantly affect the relative competitiveness of the two Rlv strains. However, the low stability of the pME6863 plasmid, encoding aiiA, did not lead to a clear conclusion about the AiiA lactonase effect on competitiveness. In order to further analyze the significance and regulation of the production of AHL signal molecules, mutants deficient in each of the two QS systems were constructed. A detailed analysis of the effect of these mutations on AHL production, biofilm formation and symbiosis with pea, vetch and lentil plants has been carried out. The effect of deletions on Rlv UPM791 rhiI and rhiR genes is more pronounced in the absence of plasmid pUPM791d, as no signal is detected in UPM791.1, lacking this plasmid. Mutations in cinI or cinRIS show either no signals, or only the small ones produced by the rhiRI system, suggesting that cinR might be regulating the rhiRI system. These mutations had a strong effect on symbiosis. Analysis of rhi mutants revealed that rhiRI system is required for normal symbiotic performance, as a drastic reduction of symbiotic fitness is observed when rhiI is deleted, and rhiR is essential for nitrogen fixation in the absence of plasmid pUPM791d. Furthermore, cinRIS mutants resulted in white and inefficient nodules, whereas cinI mutant was unable to form nodules on any legume tested. The latter mutation is associated to the instabilization of the symbiotic plasmid through a mechanism still uncovered. Overall, the results obtained indicate the existence of a model of QS-dependent regulation significantly different to that previously described in other R. leguminosarum strains, where no relevant symbiotic phenotype had been observed. The regulation of AHL production in Rlv UPM791 is a complex process involving the symbiotic plasmid (pUPM791c) and the smallest plasmid (pUPM791d), with a key role for the 3-OH-C14:1-HSL signal. Finally, we made a search for potential AHL transporters in Rlv UPM791 genome. These signals diffuse freely across membranes, but in the case of the long-chain AHLs an active efflux system might be required, as it has been described for C12-HSL in the case of Pseudomonas aeruginosa. We have identified a putative AHL transporter of the RND family homologous to P. aeruginosa mexAB-oprM. A mutant strain deficient in this transporter has been generated, and TLC analysis shows absence of 3OH-C14:1-HSL in its supernatant. This deficiency was complemented by the reintroduction of an intact copy of the genes via plasmid transfer. The mutation in mexAB genes had no significant effects on the symbiotic performance of R. leguminosarum bv. viciae.

El papel de las micorrizas en la agricultura.

Las micorrizas son hongos simbióticos que colonizan las raíces de más de un 80% de las especies vegetales. Su presencia, entre otros factores, favorece un aumento de la absorción de nitrógeno y fósforo, reduce el estrés salino y el hídrico y aumenta la resistencia a determinados patógenos de sus plantas huésped. Son capaces también de incrementar el establecimiento, nodulación y capacidad de fijación de nitrógeno de las leguminosas. Es decir, pueden aumentar los rendimientos de los cultivos en los que se hallan. Su efecto sobre los gases de efecto invernadero es variable debido a los múltiples procesos en los que intervienen. Por lo tanto, el estudio de su ecología y funcionamiento en los ecosistemas agrarios es esencial para la mejora del crecimiento y productividad de los cultivos.