Function of C1A barley peptidases and their inhibitors (cystatins) in barley seed germination : Funcion de las peptidasas C1A de cebada y sus inhibidores (cistatinas) en la germinacion de la semilla

Plant proteolysis is a metabolic process where specific enzymes called peptidases degrade proteins. In plants, this complex process involves broad metabolic networks and different sub-cellular compartments. Several types of peptidases take part in the proteolytic process, mainly cysteine-, serine-, aspartyl- and metallo- peptidases. Among the cysteine-peptidases, the papain-like or C1A peptidases (family C1, clan CA) are extensively present in land plants and are classified into catepsins L-, B-, H- and Flike. The catalytic mechanism of these C1A peptidases is highly conserved and involves the three amino acids Cys, His and Asn in the catalytic triad, and a Gln residue which seems essential for maintaining an active enzyme conformation. These proteins are synthesized as inactive precursors, which comprise an N-terminal signal peptide, a propeptide, and the mature protein. In barley, we have identified 33 cysteine-peptidases from the papain-like family, classifying them into 8 different groups. Five of them corresponded to cathepsins L-like (5 subgroups), 1 cathepsin B-like group, 1 cathepsin F-like group and 1 cathepsin H-like group. Besides, C1A peptidases are the specific targets of the plant proteinaceous inhibitors known as phytocystatins (PhyCys). The cystatin inhibitory mechanism is produced by a tight and reversible interaction with their target enzymes. In barley, the cystatin gene family is comprised by 13 members. In this work we have tried to elucidate the role of the C1A cysteine-peptidases and their specific inhibitors (cystatins) in the germination process of the barley grain. Therefore, we selected a representative member of each group/subgroup of C1A peptidases (1 cathepsin B-like, 1 cathepsin F-like, 1 cathepsin H-like and 5 cathepsins L-like). The molecular characterization of the cysteine-peptidases was done and the peptidase-inhibitor interaction was analyzed in vitro and in vivo. A study in the structural basis for specificity of pro-peptide/enzyme interaction in barley C1A cysteine-peptidases has been also carried out by inhibitory assays and the modeling of the three-dimensional structures. The barley grain maturation produces the accumulation of storage proteins (prolamins) in the endosperm which are mobilized during germination to supply the required nutrients until the photosynthesis is fully established. In this work, we have demonstrated the participation of the cysteine-peptidases and their inhibitors in the degradation of the different storage protein fractions (hordeins, albumins and globulins) present in the barley grain. Besides, transgenic barley plants overexpressing or silencing cysteine-peptidases or cystatins were obtained by Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos to analyze their physiological function in vivo. Preliminary assays were carried out with the T1 grains of several transgenic lines. Comparing the knock-out and the overexpressing lines with the WT, alterations in the germination process were detected and were correlated with their grain hordein content. These data will be validated with the homozygous grains that are being produced through the double haploid technique by microspore culture. Resumen La proteólisis es un proceso metabólico por el cual se lleva a cabo la degradación de las proteínas de un organismo a través de enzimas específicas llamadas proteasas. En plantas, este complejo proceso comprende un entramado de rutas metabólicas que implican, además, diferentes compartimentos subcelulares. En la proteólisis participan numerosas proteasas, principalmente cisteín-, serín-, aspartil-, y metalo-proteasas. Dentro de las cisteín-proteasas, las proteasas tipo papaína o C1A (familia C1, clan CA) están extensamente representadas en plantas terrestres, y se clasifican en catepsinas tipo L, B, H y F. El mecanismo catalítico de estas proteasas está altamente conservado y la triada catalítica formada por los aminoácidos Cys, His y Asn, y a un aminoácido Gln, que parece esencial para el mantenimiento de la conformación activa de la proteína. Las proteasas C1A se sintetizan como precursores inactivos y comprenden un péptido señal en el extremo N-terminal, un pro-péptido y la proteína madura. En cebada hemos identificado 33 cisteín-proteasas de tipo papaína y las hemos clasificado filogenéticamente en 8 grupos diferentes. Cinco de ellos pertenecen a las catepsinas tipo L (5 subgrupos), un grupo a las catepsinas tipo-B, otro a las catepsinas tipo-F y un último a las catepsinas tipo-H. Las proteasas C1A son además las dianas específicas de los inhibidores protéicos de plantas denominados fitocistatinas. El mecanismo de inhibición de las cistatinas está basado en una fuerte interacción reversible. En cebada, se conoce la familia génica completa de las cistatinas, que está formada por 13 miembros. En el presente trabajo se ha investigado el papel de las cisteín-proteasas de cebada y sus inhibidores específicos en el proceso de la germinación de la semilla. Para ello, se seleccionó una proteasa representante de cada grupo/subgrupo (1 catepsina tipo- B, 1 tipo-F, 1 tipo-H, y 5 tipo-L, una por cada subgrupo). Se ha llevado a cabo su caracterización molecular y se ha analizado la interacción enzima-inhibidor tanto in vivo como in vitro. También se han realizado estudios sobre las bases estructurales que demuestran la especificidad en la interacción enzima/propéptido en las proteasas C1A de cebada, mediante ensayos de inhibición y la predicción de modelos estructurales de la interacción. Finalmente, y dado que durante la maduración de la semilla se almacenan proteínas de reserva (prolaminas) en el endospermo que son movilizadas durante la germinación para suministrar los nutrientes necesarios hasta que la nueva planta pueda realizar la fotosíntesis, en este trabajo se ha demostrado la participación de las cisteínproteasas y sus inhibidores en la degradación de las diferentes tipos de proteínas de reserva (hordeinas, albúmins y globulinas) presentes en el grano de cebada. Además, se han obtenido plantas transgénicas de cebada que sobre-expresan o silencian cistatinas y cisteín-proteasas con el fin de analizar la función fisiológica in vivo. Se han realizado análisis preliminares en las semillas T1 de varias líneas tránsgenicas de cebada y al comparar las líneas knock-out y las líneas de sobre-expresión con las silvestres, se han detectado alteraciones en la germinación que están además correlacionadas con el contenido de hordeinas de las semillas. Estos datos serán validados en las semillas homocigotas que se están generando mediante la técnica de dobles haploides a partir del cultivo de microesporas.

Podredumbre parda del melocotonero (Monilinia spp.) : detección, identificación de especies y contribución a la epidemiología de la enfermedad

Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena y M. fructicola) causa marchitez en brotes y flores, chancros en ramas y podredumbre de la fruta de hueso provocando pérdidas económicas importantes en años con climatología favorable para el desarrollo de la enfermedad, particularmente en variedades tardías de melocotonero y nectarino. En estos huéspedes en España, hasta el momento, la especie predominante es M. laxa y, en menor proporción, M. fructigena. La reciente introducción en Europa de la especie de cuarentena M. fructicola hace necesaria una detección e identificación rápida de cada una de las especies. Además, hay diversos aspectos de la etiología y epidemiología de la enfermedad que no se conocen en las condiciones de cultivo españolas. En un primer objetivo de esta Tesis se ha abordado la detección e identificación de las especies de Monilinia spp. causantes de podredumbre parda. El estudio de las bases epidemiológicas para el control de la enfermedad constituye el fin del segundo objetivo. Para la detección del género Monilinia en material vegetal por PCR, diferenciándolo de otros hongos presentes en la superficie del melocotonero, se diseñaron una pareja de cebadores siguiendo un análisis del ADN ribosomal. La discriminación entre especies de Monilinia se consiguió utilizando marcadores SCAR (región amplificada de secuencia caracterizada), obtenidos después de un estudio de marcadores polimórficos de ADN amplificados al azar (RAPDs). También fue diseñado un control interno de amplificación (CI) basado en la utilización de un plásmido con secuencias de los cebadores diferenciadores del género, para ser utilizado en el protocolo de diagnóstico de la podredumbre parda con el fin de reconocer falsos negativos debidos a la inhibición de PCR por componentes celulares del material vegetal. Se disponía de un kit comercial que permitía distinguir Monilinia de otros géneros y M. fructicola del resto de especies mediante anticuerpos monoclonales utilizando la técnica DAS-ELISA. En esta Tesis se probaron diferentes fuentes de material como micelio ó conidias procedentes de cultivos en APD, o el micelio de la superficie de frutas o de momias frescas, como formas de antígeno. Los resultados obtenidos con ELISA se compararon con la identificación por métodos morfológico-culturales y por PCR con los cebadores desarrollados en esta Tesis. Los resultados demostraron la posibilidad de una detección temprana en frutas frescas por este método, realzando las posibilidades de una diagnosis temprana para una prevención más eficaz de M. fructicola en fruta de hueso. El estudio epidemiológico de la enfermedad comenzó con la determinación de las principales fuentes de inóculo primario y su importancia relativa en melocotoneros y nectarinos del valle del Ebro. Para ello se muestrearon 9 huertos durante los años 2003 a 2005 recogiendo todas las momias, frutos abortados, gomas, chancros, y brotes necróticos en los árboles. También se recogieron brotes aparentemente sanos y muestras de material vegetal situados en el suelo. En estas muestras se determinó la presencia de Monilinia spp. Los resultados mostraron que la fuente principal de inóculo son las momias que se quedan en los árboles en las que la supervivencia del hongo tras el invierno es muy alta. También son fuentes de inóculo las momias del suelo y los brotes necróticos. De aquí se deriva que una recomendación importante para los agricultores es que deben eliminar este material de los huertos. Un aspecto no estudiado en melocotonero o nectarino en España es la posible relación que puede darse entre la incidencia de infecciones latentes en los frutos inmaduros a lo largo del cultivo y la incidencia de podredumbre en los frutos en el momento de la recolección y en postcosecha. Esta relación se había observado previamente en otros frutales de hueso infectados con M. fructicola en diversos países del mundo. Para estudiar esta relación se realizaron ensayos en cinco huertos comerciales de melocotonero y nectarino situados en el Valle del Ebro en cuatro estados fenológicos durante los años 2000-2002. No se observaron infecciones latentes en botón rosa, dándose la máxima incidencia en precosecha, aunque en algunos huertos se daba otro pico en el endurecimiento del embrión. La especie prevaleciente fue M. laxa. Se obtuvo una correlación positiva significativa entre la incidencia de infecciones latentes y la incidencia de podredumbre en postcosecha. Se desarrolló también un modelo de predicción de las infecciones latentes en función de la temperatura (T) y el periodo de humectación (W). Este modelo indicaba que T y W explicaban el 83% de la variación en la incidencia de infecciones latentes causadas por Monilinia spp. Por debajo de 8ºC no se predecían latentes, necesitándose más de 22h de W para predecir la ocurrencia de latentes con T = 8ºC, mientras que solo se necesitaban 5h de W a 25ºC. Se hicieron también ensayos en condiciones controladas para determinar la relación entre la incidencia de las infecciones latentes, las condiciones ambientales (T y W), la concentración de inóculo del patógeno (I) y el estado de desarrollo del huésped (S) y para validar el modelo de predicción desarrollado con los experimentos de campo. Estos ensayos se llevaron cabo con flores y frutos de nectarino procedentes de un huerto comercial en seis estados fenológicos en los años 2004 y 2005, demostrándose que la incidencia de podredumbre en postcosecha y de infecciones latentes estaba afectada por T, W, I y S. En los frutos se producían infecciones latentes cuando la T no era adecuada para el desarrollo de podredumbre. Una vez desarrollado el embrión eran necesarias más de 4-5h de W al día y un inóculo superior a 104 conidias ml-1 para que se desarrollase o podredumbre o infección latente. La ecuación del modelo obtenido con los datos de campo era capaz de predecir los datos observados en estos experimentos. Para evaluar el efecto del inóculo de Monilinia spp. en la incidencia de infecciones latentes y de podredumbre de frutos en postcosecha se hicieron 11 experimentos en huertos comerciales de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro durante 2002 a 2005. Se observó una correlación positiva entre los números de conidias de Monilinia spp. en la superficie de los frutos y la incidencia de infecciones latentes De los estudios anteriores se deducen otras dos recomendaciones importantes para los agricultores: las estrategias de control deben tener en cuenta las infecciones latentes y estimar el riesgo potencial de las mismas basándose en la T y W. Deben tener también en cuenta la concentración de esporas de Monilinia spp. en la superficie de los frutos para disminuir el riesgo de podredumbre parda. El conocimiento de la estructura poblacional de los patógenos sienta las bases para establecer métodos más eficaces de manejo de las enfermedades. Por ello en esta Tesis se ha estudiado el grado de diversidad genética entre distintas poblaciones de M. laxa en diferentes localidades españolas utilizando 144 marcadores RAPDs (59 polimórficos y 85 monomórficos) y 21 aislados. El análisis de la estructura de la población reveló que la diversidad genética dentro de las subpoblaciones (huertos) (HS) representaba el 97% de la diversidad genética (HT), mientras que la diversidad genética entre subpoblaciones (DST) sólo representaba un 3% del total de esta diversidad. La magnitud relativa de la diferenciación génica entre subpoblaciones (GST) alcanzaba 0,032 y el número estimado de migrantes por generación (Nm) fue de 15,1. Los resultados obtenidos en los dendrogramas estaban de acuerdo con el análisis de diversidad génica. Las agrupaciones obtenidas eran independientes del huerto de procedencia, año o huésped. En la Tesis se discute la importancia relativa de las diferentes fuentes evolutivas en las poblaciones de M. laxa. Finalmente se realizó un muestreo en distintos huertos de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro para determinar la existencia o no de aislados resistentes a los fungicidas del grupo de los benzimidazoles y las dicarboximidas, fungicidas utilizados habitualmente para el control de la podredumbre parda y con alto riesgo de desarrollar resistencia en las poblaciones patógenas. El análisis de 114 aislados de M. laxa con los fungicidas Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), e Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), mostró que ninguno era resistente en las dosis ensayadas. Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena and M. fructicola) cause bud and flower wilt, canker in branches and stone fruit rot giving rise important economic losses in years with appropriate environmental conditions, it is particularly important in late varieties of peach and nectarine. Right now, M. laxa is the major species for peach and nectarine in Spain followed by M. fructigena, in a smaller proportion. The recent introduction of the quarantine organism M. fructicola in Europe makes detection and identification of each one of the species necessary. In addition, there are different aspects of disease etiology and epidemiology that are not well known in Spain conditions. The first goal of this Thesis was the detection and identification of Monilinia spp. causing brown rot. Study of the epidemiology basis for disease control was the second objective. A pair of primers for PCR detection was designed based on the ribosomal DNA sequence in order to detect Monilinia spp. in plant material and to discriminate it from other fungi colonizing peach tree surface. Discrimination among Monilinia spp. was successful by SCAR markers (Sequence Characterized Amplified Region), obtained after a random amplified polymorphic DNA markers (RAPDs) study. An internal control for the PCR (CI) based on the use of a mimic plasmid designed on the primers specific for Monilinia was constructed to be used in diagnosis protocol for brown rot in order to avoid false negatives due to the inhibition of PCR as consequence of remained plant material. A commercial kit based on DAS-ELISA and monoclonals antibodies was successfully tested to distinguish Monilinia from other fungus genera and M. fructicola from other Monilinia species. Different materials such as micelium or conidias from APD cultures, or micelium from fresh fruit surfaces or mummies were tested in this Thesis, as antigens. Results obtained by ELISA were compared to classical identification by morphologic methods and PCR with the primers developed in this Thesis. Results demonstrated the possibility of an early detection in fresh fruits by this method for a more effective prevention of M. fructicola in stone fruit. The epidemiology study of the disease started with the determination of the main sources of primary inoculum and its relative importance in peach trees and nectarines in the Ebro valley. Nine orchards were evaluated during years 2003 to 2005 collecting all mummies, aborted fruits, rubbers, cankers, and necrotic buds from the trees. Apparently healthy buds and plant material located in the ground were also collected. In these samples presence of Monilinia spp. was determined. Results showed that the main inoculum sources are mummies that stay in the trees and where fungus survival after the winter is very high. Mummies on the ground and the necrotics buds are also sources of inoculum. As consequence of this an important recommendation for the growers is the removal of this material of the orchards. An important issue not well studied in peach or nectarine in Spain is the possible relationship between the incidence of latent infections in the immature fruits and the incidence of fruit rot at harvesting and postharvesting. This relationship had been previously shown in other stone fruit trees infected with M. fructicola in different countries over the world. In order to study this relationship experiments were run in five commercial peach and nectarine orchards located in the Ebro Valley in four phenologic states from 2000 to 2002. Latent infections were not observed in pink button, the maxima incidence arise in preharvest, although in some orchards another increase occurred in the embryo hardening. The most prevalence species was M. laxa. A significant positive correlation between the incidence of latent infections and the incidence of rot in postharvest was obtained. A prediction model of the latent infections based on the temperature (T) and the wetness duration (W) was also developed. This model showed that T and W explained 83% of the variation in latent infection incidence caused by Monilinia spp. Below 8ºC latent infection was not predicted, more than 22h of W with T = 8ºC were needed to predict latent infection occurrence of, whereas at 25ºC just 5h of W were enough. Tests under controlled conditions were also made to determine the relationship among latent infections incidence, environmental conditions (T and W), inoculum concentration of the pathogen (I) and development state of the host (S) to validate the prediction model developed on the field experiments. These tests were made with flowers and fruits of nectarine coming from a commercial orchard, in six phenologic states in 2004 and 2005, showing that incidence of rot in postharvest and latent infections were affected by T, W, I and S. In fruits latent infections took place when the T was not suitable for rot development. Once developed the embryo, more than 4-5h of W per day and higher inoculums (104 conidia ml-1) were necessary for rot or latent infection development. The equation of the model obtained with the field data was able to predict the data observed in these experiments. In order to evaluate the effect of inoculum of Monilinia spp. in the incidence of latent infections and of rot of fruits in postharvest, 11 experiments in commercial orchards of peach and nectarine of the Ebro Valley were performed from 2002 to 2005. A positive correlation between the conidial numbers of Monilinia spp. in the surface of the fruits and the incidence of latent infections was observed. Based on those studies other two important recommendations for the agriculturists are deduced: control strategies must consider the latent infections and potential risk based on the T and W. Spores concentration of Monilinia spp. in the surface of fruits must be also taken in concern to reduce the brown rot risk. The knowledge of the population structure of the pathogens determines the bases to establish more effective methods of diseases handling. For that reason in this Thesis the degree of genetic diversity among different M. laxa populations has been studied in different Spanish locations using 144 RAPDs markers (59 polymorphic and 85 monomorphics) on 21 fungal isolates. The analysis of the structure of the population revealed that the genetic diversity within the subpopulations (orchards) (HS) represented 97% of the genetic diversity (HT), whereas the genetic diversity between subpopulations (DST) only represented a 3% of the total of this diversity. The relative magnitude of the genic differentiation between subpopulations (GST) reached 0.032 and the considered number of migrantes by generation (Nm) was of 15.1. The results obtained in dendrograms were in agreement with the analysis of genic diversity. The obtained groupings were independent of the orchard of origin, year or host. In the Thesis the relative importance of the different evolutionary sources in the populations from M. laxa is discussed. Finally a sampling of resistant isolates in different orchards from peach and nectarine of Ebro Valley was made to determine the existence of fungicide resistance of the group of benzimidazoles and the dicarboximidas, fungicides used habitually for the control of rot brown and with high risk of resistance developing in the pathogenic populations. The analysis of 114 isolated ones of M. laxa with the fungicides Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), and Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), showed no resistant in the doses evaluated.

Caracterización molecular del mutante riso 1508 de cebada : modificaciones transcripcionales y posttranscripcionales en el desarrollo de la semilla

La semilla es el principal órgano reproductivo de las plantas espermatofitas, permitiendo la dispersión de las poblaciones y asegurando su supervivencia gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad para germinar bajo condiciones ambientales óptimas. El rendimiento y valor económico de los cereales, que constituyen la primera cosecha mundial, depende, en buena medida, de la eficacia con que se acumulan en la semilla sustancias de reserva: proteínas, carbohidratos y lípidos. El principal carbohidrato acumulado en la semilla de cebada es el almidón y la fracción mayoritaria de proteínas es la de las prolaminas (solubles en etanol al 70%); estas proteínas tienen muy bajo contenido en lisina, un aminoácido esencial en la dieta de animales monogástricos. Con el fin de mejorar el valor nutricional de la semilla de cebada, se han obtenido diferentes mutantes con un mayor contenido en este aminoácido. Riso 1508 es un mutante de cebada rico en lisina cuya mutación lys3a, de efectos pleiotrópicos, segrega como un único gen mendeliano. Entre otros, presenta una reducción drástica de la expresión de algunos genes que codifican proteínas de reserva de tipo prolamina, en concreto, presenta reducida la expresión de los genes que codifican B-, C- y ϒ-Hordeínas y del inhibidor de tripsina CMe, pero no tiene alterada la expresión del gen que codifica las D-Hordeínas. Este último gen carece en su promotor del motivo GLM (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), que es reconocido por factores transcripcionales bZIP. En este trabajo, el mutante de cebada Riso 1508 se ha utilizado como herramienta para profundizar en el conocimiento de la regulación génica en semillas durante las fases de la maduración y la germinación. Para ello, en una primera aproximación, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparando el genotipo mutante con el silvestre durante la maduración de la semilla. Además de confirmar variaciones en los genes que codifican proteínas de reserva, este análisis indicó que también estaban afectados los genes relacionados con metabolismo de carbohidratos. Por ello se decidió caracterizar la familia multigénica de sacarosas sintasa (SUSy) en cebada. Se anotaron dos nuevos genes, HvSs3 y HvSs4, cuya expresión se comparó con la de los genes HvSs1 y HvSs2, previamente descritos en el laboratorio. La expresión de los cuatro genes en tejidos diferentes y su respuesta a estreses abióticos se analizó mediante RT-qPCR. HvSs1 y HvSs2 se expresaron preferencialmente durante el desarrollo del endospermo, y HvSs1 también fue un tránscrito abundante durante la germinación. HvSs1 se indujo en hojas en condiciones de anoxia y HvSs3 por estrés hídrico, y ambos genes se indujeron por tratamientos de frío. La localización subcelular de las cuatro isoformas no fue sólo citoplásmica, sino que también se localizaron en zonas próximas a retículo endoplásmico y en la cara interna de la membrana plasmática; además, se observó una co-localización de HvSS1 con el marcador de mitocondrias. Estos datos sugieren un papel distinto aunque parcialmente solapante de las cuatro Sacarosa Sintasas de cebada, descritas hasta la fecha. Las cinéticas de expresión de los genes que codifican los TFs más importantes implicados en la regulación génica durante el desarrollo del endospermo de cebada, se analizaron por RT-qPCR en ambos genotipos, demostrando que los TFs de la clase DOF aparecieron desregulados durante todo el proceso en Riso 1508 comparado con el cv. Bomi, aunque también se observaron diferencias significativas en algunos de los que codifican bZIPs. Estudios previos indicaban que el ortólogo de BLZ2 en maíz, O2, se regula post-traduccionalmente mediante un mecanismo de fosforilación/defosforilación reversible, y que la forma defosforilada es la fisiológicamente activa. En este trabajo se demostró que BLZ2 está sujeto a este tipo de regulación y que la proteín-fosfatasa HvPP2C2 está implicada en el proceso. La interacción de HvPP2C2 y BLZ2 tiene lugar en el núcleo celular únicamente en presencia de 100 μM ABA. En el mutante Riso 1508, BLZ2 se encuentra en un estado hiperfosforilado tanto durante la maduración como durante la germinación de la semilla, lo que dificultaría la unión de BLZ2 a las secuencias GLM en los promotores de los genes que codifican B-, C-,y ϒ- Hordeínas y CMe. Summary The seed is the main reproductive organ of spermatophyte plants allowing the spread of populations and ensuring their survival through its desiccation tolerance and because of their ability to germinate under optimum environmental conditions. Yield and economic value of cereal crops, that constitute the first world crop, depend largely on the efficiency with which they accumulate in the seed reserve substances: proteins, carbohydrates and lipids. The main carbohydrate accumulated in the barley seed is starch and the major protein fraction is that of prolamins (soluble in 70% ethanol); these proteins have a very low lysine content, an essential amino-acid for the diet of monogastric animals. In order to improve the nutritional value of the barley seed, different mutants have been obtained with a higher content of this amino-acid. Riso 1508 is one lysine-rich mutant whose mutation (lys3a) segregates as a single Mendelian gene with pleiotropic effects, such as a drastic reduction of genes encoding the trypsin inhibitor CMe and the B-, C-and ϒ-hordeins, but has not altered the expression of the gene encoding the D-hordeins. This latter gene lacks in its promotor the GLM motif (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), that is recognised by bZIP transcription factors In this work we have used the barley mutant Riso 1508 as a tool for better understanding gene regulation in seeds during the maturation and germination phases. To this aim, a transcriptomic analysis was performed comparing wild and mutant genotypes during seed maturation. Besides confirming variations in the expression of genes encoding reserve proteins, this analysis indicated that some genes related with carbohydrate metabolism were also affected. It was therefore decided to characterize the multigene family of sucrose synthases (SUSy) in barley. Two new genes were annotated, HvSs3 and HvSs4, and its expression was compared with that of genes HvSs1 and HvSs2, previously described in our laboratory. The expression of the four genes in different tissues and in response to abiotic stresses was analyzed by RTqPCR. HvSs1 and HvSs2 were preferentially expressed during the development of the endosperm, and the HvSs1 transcript was also abundant upon germination. HvSs1 was induced in leaves by anoxic conditions, HvSs3 by water stress, and both genes were induced by cold treatments. The subcellular localization of all four isoforms was not only cytoplasmic, but they could be found along the endoplasmic reticulum and at the inner side of the cell membrane; HvSS1, was also associated with the mitochondrial marker. These data suggest a distinct but partially overlapping roles for the barley sucrose synthases, described so far. The expression kinetics of the genes encoding the most important TFs involved in gene regulation during barley endosperm development was analyzed by RT-qPCR in both genotypes. These data show that the genes encoding DOF TFs were mis-regulated throughout the process in Riso 1508, although significant differences were also found among some of those encoding bZIPs. Previous studies indicated that the BLZ2 orthologue in maize, O2, was post-translationally regulated by reversible phosphorylation/dephosphorylation and that the dephosphorylated protein is the physiologically active form. In this work we demostrate that BLZ2 is under a similar regulation and that the proteinphosphatase HvPP2C2 is implicated in the process. The interaction between HvPP2C2 and BLZ2 takes place in the cell nucleus only in the presence of 100 μM ABA. In the Riso 1508 mutant, BLZ2 is found in a hyperphosphorylated state in the maturation phase and upon seed germination; because of this, the BLZ2 binding to the GLM promoter sequences of genes encoding B-, C- y ϒ- Hordeins and CMe would be decreased in the mutant.

Genomic analyses of flowering transition and inflorescence development in grapevine = Análisis genómicos de la transición floral y del desarrollo de la inflorescencia en la vid

The general objective of this work is to analyze the regulatory processes underlying flowering transition and inflorescence and flower development in grapevine. Most of these crucial developmental events take place within buds growing during two seasons in two consecutive years. During the first season, the shoot apical meristem within the bud differentiates all the basic elements of the shoot including flowering transition in lateral primordia and development of inflorescence primordia. These events practically end with bud dormancy. The second season, buds resume shoot growth associated to flower formation and development. In grapevine, the lateral meristems can give rise either to tendril or inflorescence primordia that are homologous organs. With this purpose, we performed global transcriptome analyses along the bud annual cycle and during inflorescence and tendril development. In addition, we approach the genomic analysis of the MIKC type MADS-box gene family in grapevine to identify all its members and assign them putative biological functions. Regarding buds developmental cycle, the results indicate that the main factors explaining the global gene expression differences were the processes of bud dormancy and active growth as well as stress responses. Non dormant buds exhibited up-regulation in functional categories typical of actively proliferating and growing cells (photosynthesis, cell cycle regulation, chromatin assembly) whereas in dormant ones the main functional categories up-regulated were associated to stress response pathways together with transcripts related to starch catabolism. Major transcriptional changes during the dormancy period were associated to the para/endodormancy, endo/ecodormancy and ecodormancy/bud break transitions. Global transcriptional analyses along tendril and inflorescence development suggested that these two homologous organs share a common transcriptional program related to cell proliferation functions. Both structures showed a progressive decrease in the expression of categories such as cell-cycle, auxin metabolism/signaling, DNA metabolism, chromatin assembly and a cluster of five transcripts belonging to the GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) transcription factor family, that are known to control cell proliferation in other species and determine the size of lateral organs. However, they also showed organ specific transcriptional programs that can be related to their differential organ structure and function. Tendrils showed higher transcription of genes related to photosynthesis, hormone signaling and secondary metabolism than inflorescences, while inflorescences have higher transcriptional activity for genes encoding transcription factors (especially those belonging to the MADS-box gene family). Further analysis along inflorescence development evidenced the relevance of additional functions likely related to processes of flower development such as fatty acid and lipid metabolism, jasmonate signaling and oxylipin biosynthesis. The transcriptional analyses performed highlighted the relevance of several groups of transcriptional regulators in the developmental processes studied. The expression profiles along bud development revealed significant differences for some MADS-box subfamilies in relation to other plant species, like the members of the FLC and SVP subfamilies suggesting new roles for these groups in grapevine. In this way, it was found that VvFLC2 and VvAGL15.1 could participate, together with some members of the SPL-L family, in dormancy regulation, as was shown for some of them in other woody plants. Similarly, the expression patterns of the VvFLC1, VvFUL, VvSOC1.1 (together with VvFT, VvMFT1 and VFL) genes could indicate that they play a role in flowering transition in grapevine, in parallel to their roles in other plant systems. The expression levels of VFL, the grapevine LEAFY homolog, could be crucial to specify the development of inflorescence and flower meristems instead of tendril meristems. MADS-box genes VvAP3.1 and 2, VvPI, VvAG1 and 3, VvSEP1-4, as well as VvBS1 and 2 are likely associated with the events of flower meristems and flower organs differentiation, while VvAP1 and VvFUL-L (together with VvSOC1.1, VvAGL6.2) could be involved on tendril development given their expression patterns. In addition, the biological function ofVvAP1 and VvTFL1A was analyzed using a gene silencing approach in transgenic grapevine plants. Our preliminary results suggested a possible role for both genes in the initiation and differentiation of tendrils. Finally, the genomic analysis of the MADS-box gene family in grapevine revealed differential features regarding number and expression pattern of genes putatively involved in the flowering transition process as compared to those involved in the specification of flower and fruit organ identity. Altogether, the results obtained allow identifying putative candidate genes and pathways regulating grapevine reproductive developmental processes paving the way to future experiments demonstrating specific gene biological functions. RESUMEN El objetivo general de este trabajo es analizar los procesos regulatorios subyacentes a la inducción floral así como al desarrollo de la inflorescencia y la flor en la vid. La mayor parte de estos eventos cruciales tienen lugar en las yemas a lo largo de dos estaciones de crecimiento consecutivas. Durante la primera estación, el meristemo apical contenido en la yema diferencia los elementos básicos del pámpano, lo cual incluye la inducción de la floración en los meristemos laterales y el subsiguiente desarrollo de primordios de inflorescencia. Estos procesos prácticamente cesan con la entrada en dormición de la yema. En la segunda estación, se reanuda el crecimiento del pámpano acompañado por la formación y desarrollo de las flores. En la vid, los meristemos laterales pueden dar lugar a primordios de inflorescencia o de zarcillo que son considerados órganos homólogos. Con este objetivo llevamos a cabo un estudio a nivel del transcriptoma de la yema a lo largo de su ciclo anual, así como a lo largo del desarrollo de la inflorescencia y del zarcillo. Además realizamos un análisis genómico de la familia MADS de factores transcripcionales (concretamente aquellos del tipo MIKC) para identificar todos sus miembros y tratar de asignarles posibles funciones biológicas. En cuanto al ciclo de desarrollo de la yema, los resultados indican que los principales factores que explican las diferencias globales en la expresión génica fueron los procesos de dormición de la yema y el crecimiento activo junto con las respuestas a diversos tipos de estrés. Las yemas no durmientes mostraron un incremento en la expresión de genes contenidos en categorías funcionales típicas de células en proliferación y crecimiento activo (como fotosíntesis, regulación del ciclo celular, ensamblaje de cromatina), mientras que en las yemas durmientes, las principales categorías funcionales activadas estaban asociadas a respuestas a estrés, así como con el catabolismo de almidón. Los mayores cambios observados a nivel de transcriptoma en la yema coincidieron con las transiciones de para/endodormición, endo/ecodormición y ecodormición/brotación. Los análisis transcripcionales globales a lo largo del desarrollo del zarcillo y de la inflorescencia sugirieron que estos dos órganos homólogos comparten un programa transcripcional común, relacionado con funciones de proliferación celular. Ambas estructuras mostraron un descenso progresivo en la expresión de genes pertenecientes a categorías funcionales como regulación del ciclo celular, metabolismo/señalización por auxinas, metabolismo de ADN, ensamblaje de cromatina y un grupo de cinco tránscritos pertenecientes a la familia de factores transcripcionales GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF), que han sido asociados con el control de la proliferación celular y en determinar el tamaño de los órganos laterales en otras especies. Sin embargo, también pusieron de manifiesto programas transcripcionales que podrían estar relacionados con la diferente estructura y función de dichos órganos. Los zarcillos mostraron mayor actividad transcripcional de genes relacionados con fotosíntesis, señalización hormonal y metabolismo secundario que las inflorescencias, mientras que éstas presentaron mayor actividad transcripcional de genes codificantes de factores de transcripción (especialmente los pertenecientes a la familia MADS-box). Análisis adicionales a lo largo del desarrollo de la inflorescencia evidenciaron la relevancia de otras funciones posiblemente relacionadas con el desarrollo floral, como el metabolismo de lípidos y ácidos grasos, la señalización mediada por jasmonato y la biosíntesis de oxilipinas. Los análisis transcripcionales llevados a cabo pusieron de manifiesto la relevancia de varios grupos de factores transcripcionales en los procesos estudiados. Los perfiles de expresión estudiados a lo largo del desarrollo de la yema mostraron diferencias significativas en algunas de las subfamilias de genes MADS con respecto a otras especies vegetales, como las observadas en los miembros de las subfamilias FLC y SVP, lo cual sugiere que podrían desempeñar nuevas funciones en la vid. En este sentido, se encontró que los genes VvFLC2 y VvAGL15.1 podrían participar, junto con algunos miembros de la familia SPL-L, en la regulación de la dormición. De un modo similar, los patrones de expresión de los genes VvFLC1, VvFUL, VvSOC1.1 (junto con VvFT, VvMFT1 y VFL) podría indicar que desempeñan un papel en la regulación de la inducción de la floración en la vid, como se ha observado en otros sistemas vegetales. Los niveles de expresión de VFL, el homólogo en vid del gen LEAFY de A. thaliana podrían ser cruciales para la especificación del desarrollo de meristemos de inflorescencia y flor en lugar de meristemos de zarcillo. Los genes VvAP3.1 y 2, VvPI, VvAG1 y 3, VvSEP1-4, así como VvBS1 y 2 parecen estar asociados con los eventos de diferenciación de meristemos y órganos florales, mientras que VvAP1 y VvFUL-L (junto con VvSOC1.1 y VvAGL6.2) podrían estar implicados en el desarrollo del zarcillo dados sus patrones de expresión. Adicionalmente, se analizó la función biológica de los genes VvAP1 y VvTFL1A por medio de una estrategia de silenciamiento génico. Los datos preliminares sugieren un posible papel para ambos genes en la iniciación y diferenciación de los zarcillos. Finalmente, el análisis genómico de la familia MADS en vid evidenció diferencias con respecto a otras especies vegetales en cuanto a número de miembros y patrón de expresión en genes supuestamente implicados en la inducción de la floración, en comparación con aquellos relacionados con la especificación de identidad de órganos florales y desarrollo del fruto. En conjunto, los resultados obtenidos han permitido identificar posibles rutas y genes candidatos a participar en la regulación de los procesos de desarrollo reproductivo de la vid, sentando las bases de futuros experimentos encaminados a conocer la funciones biológicas de genes específicos.

Retos y oportunidades de la investigación transdisciplinar. Reflexión sobre el papel de la mecánica de materiales en biomedicina : discurso del académico electo Excmo. Sr. D. Manuel Doblaré Castellano y contestación del académico Excmo. Sr. D. Enrique Alarcón Álvarez

En este discurso de ingreso se destacó la importancia de la Mecánica de Materiales y el Modelado Matemático en Biomedicina y, en particular, se mostraron algunas aportaciones relacionadas con el comportamiento funcional de tejidos biológicos. Más en concreto se discutió la importancia de la transdisciplinariedad en la investigación actual y el papel que en esa búsqueda de un lenguaje común entre disciplinas tienen el modelado matemático y la simulación computacional.En particular, en la nueva Biomedicina basada en la evidencia, la interacción transdisciplinar es esencial, como lo demuestran resultados tan evidentes como los dispositivos e implantes inteligentes, las nuevas técnicas de imagen médica, la aparición de órganos artificiales o las crecientemente importantes técnicas de Ingeniería Tisular y Terapias Génica y Celular. Uno de los aspectos de creciente estudio en los últimos años es la epigenética, es decir, el estudio de la influencia del entorno específico de cada individuo en su respuesta biológica. Uno de estos estímulos externos, que se está constatando como fundamental, corresponde a las deformaciones, y ello en todas las escalas: molecular, celular, tisular y orgánica, dando lugar a una nueva subdisciplina: la Mecanobiología de creciente interés. En ella se acoplan los fenómenos mecánicos (movimiento, deformaciones, tensiones,..) con los biológicos (respuesta celular, expresión génica, adaptación tisular, regeneración y morfogénesis orgánica, etc.) y, en general, con otros campos físicos como la bioquímica o la electricidad también acoplados en los procesos de señalización y expresión celular. De nuevo el modelado multiescala y multifísico de estos problemas es esencial en su comprensión última y en el diseño de nuevas estrategias quirúrgicas, terapéuticas o de diagnostico. En este discurso se mostraron los problemas y posibilidades de estas metodologías y su aplicación en problemas tales como el diseño de implantes, la remodelación reparación y morfogénesis óseas, así como en la planificación preoperatoria y cirugía virtual.

The TRANSPLANTA collection of Arabidopsis lines: a resource for functional analysis of transcription factors based on their conditional overexpression.

Los factores de transcripción (FTs) son reguladores clave de la expresión génica en todos los organismos. En eucariotas los FTs con frecuencia están representados por miembros funcionalmente redundantes de familias génicas de gran tamaño. La sobreexpresión de FTs puede representar una herramienta para revelar las funciones biológicas de FTs redundantes en plantas; sin embargo, la sobreexpresión constitutiva de FTs con frecuencia conlleva diversos defectos en el desarrollo, impidiendo su caracterización funcional. Sin embargo, aproximaciones de sobreexpresión condicional podrían ayudar a solventar este problema. En el consorcio TRANSPLANTA, en el que participan varios laboratorios del CBGP, hemos generado una colección de líneas transgénicas de Arabidopsis, cada una de las cuales expresa un FT bajo el control de un promotor inducible por ?estradiol. Hasta el momento se han generado 1636 líneas homocigotas independientes que corresponden a 634 FTs diferentes, lo que representa una media de 2,6 líneas por cada FT. Como confirmación de la utilidad de esta herramienta, el tratamiento con ?estradiol de líneas que expresaban condicionalmente FTs provoca alteraciones fenotípicas tales como proliferación de pelos radiculares, senescencia inducida por oscuridad, acumulación de antocianinas y enanismo, y que corroboran fenotipos previamente descritos debidos a la sobreexpresión de dichos FTs. Rastreos realizados posteriormente con otras líneas TRANSPLANTA han permitido la identificación de FTs implicados en diferentes procesos biológicos de plantas, confirmando que la colección es una herramienta valiosa para la caracterización funcional de FTs. Las semillas de las líneas TRANSPLANTA han sido depositadas en el Nottingham Arabidopsis Stock Centre para su distribución posterior.

Efecto de la incorporación de γ-tocoferol en dietas para salmón Atlántico (Salmo Salar L.) sobre la composición y metabolismo lipídico

El aceite de pescado ha sido la principal fuente de grasa incluida en la dieta de salmón Atlántico ya que su uso optimiza el crecimiento y aporta grandes cantidades de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) omega 3, principalmente los ácidos eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA). En los años 90 se utilizaba un 24% de aceite de pescado en los piensos para salmón, sin embargo la escasez del recurso y la presión comercial sobre su demanda por parte de distintos sectores ha dado lugar a una progresiva reducción de su inclusión teniendo la industria como objetivo llegar a utilizar en 2020 tan sólo un 8%. Al reducir los niveles de aceite de pescado disminuye el contenido de EPA y DHA aportado, por lo que se hace necesario diseñar estrategias que permitan maximizar la retención de EPA y DHA en los tejidos del animal. De esta forma, la optimización del uso de antioxidantes para prevenir la peroxidación lipídica de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA), puede ser una estrategia a seguir. Entre los antioxidantes empleados en acuicultura destaca la vitamina E. Aunque el α-tocoferol es el isómero principal de la vitamina E, estudios recientes sugieren que el γ-tocoferol presenta igualmente una potente actividad antioxidante. Sin embargo, hasta la fecha no hay muchos estudios con salmón Atlántico empleando γ-tocoferol como principal isómero añadido en la dieta. Además de su función como antioxidante, en investigaciones recientes la vitamina E ha mostrado capacidad para inducir de manera directa o indirecta la expresión de genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo de los ácidos grasos. Con esta perspectiva el presente trabajo tiene como principal objetivo determinar si la incorporación de 300 ppm de γ-tocoferol a la dieta del salmón da lugar a una mayor capacidad antioxidante en los tejidos del animal, disminuyendo la oxidación lipídica in vivo y afectando tanto a la composición como al metabolismo lipídico. Un total de 180 esguines de salmón Atlántico (Salmo Salar) con un peso inicial de 137,4 ± 1g fueron distribuidos al azar y uniformemente en 6 tanques y fueron alimentados con una de las tres dietas experimentales. Se aportó agua salada a los tanques y la temperatura se mantuvo a 12°C. Las dietas experimentales se formularon para tener: bajo contenido en EPA y DHA (CB); alto en EPA y DHA (CA); y con bajos niveles de EPA y DHA pero con un suplemento de 300 ppm de γ-tocoferol como antioxidante (CB+γtoc). Las dietas fueron suministradas en tanques duplicados durante 14 semanas. Al final del experimento, se sacrificaron 4 peces de cada tanque y se tomaron muestras de hígado y filete izquierdo para realizar el análisis de ácidos grasos y de expresión génica. A pesar de que los peces alimentados con la dieta CB+γtoc presentaron 3 veces más concentración de γ-tocoferol en los tejidos, la administración de esta dieta no tuvo un efecto significativo (P>0.05) sobre la composición de EPA, DHA y ácido araquidónico (ARA) en los tejidos del salmón. Los resultados del análisis de expresión de genes mostraron que la incorporación de 300 ppm de γ-tocoferol dio lugar a una cierta inhibición del metabolismo lipídico tanto de genes relacionados con la β-oxidación como de aquellos relacionados con la síntesis de LC-PUFA. En cuanto al sistema de defensa antioxidante GPx4, los resultados indicaron que no hubo efecto estimulatorio del γ-tocoferol sobre el mismo. Sin embargo, se observó un aumento de omega 3 totales (P<0.05) en el músculo del animal. La incorporación de 300 ppm de γ-tocoferol tuvo un efecto limitado sobre la composición lipídica y un efecto inhibitorio del metabolismo lipídico a nivel de expresión.

Factores transcripcionales de la clase DOF en Brachypodium distachyon: caracterización molecular de BdDOF24 durante la germinación de las semillas

La semilla es el órgano que garantiza la propagación y continuidad evolutiva de las plantas espermatofitas y constituye un elemento indispensable en la alimentación humana y animal. La semilla de cereales acumula en el endospermo durante la maduración, mayoritariamente, almidón y proteínas de reserva. Estas reservas son hidrolizadas en la germinación por hidrolasas sintetizadas en la aleurona en respuesta a giberelinas (GA), siendo la principal fuente de energía hasta que la plántula emergente es fotosintéticamente activa. Ambas fases del desarrollo de la semilla, están reguladas por una red de factores de transcripción (TF) que unen motivos conservados en cis- en los promotores de sus genes diana. Los TFs son proteínas que han desempeñado un papel central en la evolución y en el proceso de domesticación, siendo uno de los principales mecanismos de regulación génica; en torno al 7% de los genes de plantas codifican TFs. Atendiendo al motivo de unión a DNA, éstos, se han clasificado en familias. La familia DOF (DNA binding with One Finger) participa en procesos vitales exclusivos de plantas superiores y sus ancestros cercanos (algas, musgos y helechos). En las semillas de las Triticeae (subfamilia Pooideae), se han identificado varias proteínas DOF que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. Brachypodium distachyon es la primera especie de la subfamilia Pooideae cuyo genoma (272 Mbp) ha sido secuenciado. Su pequeño tamaño, ciclo de vida corto, y la posibilidad de ser transformado por Agrobacterium tumefaciens (plásmido Ti), hacen que sea el sistema modelo para el estudio de cereales de la tribu Triticeae con gran importancia agronómica mundial, como son el trigo y la cebada. En este trabajo, se han identificado 27 genes Dof en el genoma de B. distachyon y se han establecido las relaciones evolutivas entre estos genes Dof y los de cebada (subfamilia Pooideae) y de arroz (subfamilia Oryzoideae), construyendo un árbol filogenético en base al alineamiento múltiple del dominio DOF. La cebada contiene 26 genes Dof y en arroz se han anotado 30. El análisis filogenético establece cuatro grupos de genes ortólogos (MCOGs: Major Clusters of Orthologous Genes), que están validados por motivos conservados adicionales, además del dominio DOF, entre las secuencias de las proteínas de un mismo MCOG. El estudio global de expresión en diferentes órganos establece un grupo de nueve genes BdDof expresados abundantemente y/o preferencialmente en semillas. El estudio detallado de expresión de estos genes durante la maduración y germinación muestra que BdDof24, ortólogo putativo a BPBF-HvDOF24 de cebada, es el gen más abundante en las semillas en germinación de B. distachyon. La regulación transcripcional de los genes que codifican hidrolasas en la aleurona de las semillas de cereales durante la post‐germinación ha puesto de manifiesto la existencia en sus promotores de un motivo tripartito en cis- conservado GARC (GA-Responsive Complex), que unen TFs de la clase MYB-R2R3, DOF y MYBR1-SHAQKYF. En esta tesis, se ha caracterizado el gen BdCathB de Brachypodium que codifica una proteasa tipo catepsina B y es ortólogo a los genes Al21 de trigo y HvCathB de cebada, así como los TFs responsables de su regulación transcripcional BdDOF24 y BdGAMYB (ortólogo a HvGAMYB). El análisis in silico del promotor BdCathB ha identificado un motivo GARC conservado, en posición y secuencia, con sus ortólogos en trigo y cebada. La expresión de BdCathB se induce durante la germinación, así como la de los genes BdDof24 y BdGamyb. Además, los TFs BdDOF24 y BdGAMYB interaccionan en el sistema de dos híbridos de levadura e in planta en experimentos de complementación bimolecular fluorescente. En capas de aleurona de cebada, BdGAMYB activa el promotor BdCathB, mientras que BdDOF24 lo reprime; este resultado es similar al obtenido con los TFs ortólogos de cebada BPBF-HvDOF24 y HvGAMYB. Sin embargo, cuando las células de aleurona se transforman simultáneamente con los dos TFs, BdDOF24 tiene un efecto aditivo sobre la trans-activación mediada por BdGAMYB, mientras que su ortólogo BPBF-HvDOF24 produce el efecto contrario, revirtiendo el efecto de HvGAMYB sobre el promotor BdCathB. Las diferencias entre las secuencias deducidas de las proteínas BdDOF24 y BPBF-HvDOF24 podrían explicar las funciones opuestas que desempeñan en su interacción con GAMYB. Resultados preliminares con líneas de inserción de T-DNA y de sobre-expresión estable de BdGamyb, apoyan los resultados obtenidos en expresión transitoria. Además las líneas homocigotas knock-out para el gen BdGamyb presentan alteraciones en anteras y polen y no producen semillas viables. ABSTRACT The seed is the plant organ of the spermatophytes responsible for the dispersion and survival in the course of evolution. In addition, it constitutes one of the most importan elements of human food and animal feed. The main reserves accumulated in the endosperm of cereal seeds through the maturation phase of development are starch and proteins. Its degradation by hydrolases synthetized in aleurone cells in response to GA upon germination provides energy, carbon and nitrogen to the emerging seedling before it acquires complete photosynthetic capacity. Both phases of seed development are controlled by a network of transcription factors (TFs) that interact with specific cis- elements in the promoters of their target genes. TFs are proteins that have played a central role during evolution and domestication, being one of the most important regulatory mechanisms of gene expression. Around 7% of genes in plant genomes encode TFs. Based on the DNA binding motif, TFs are classified into families. The DOF (DNA binding with One Finger) family is involved in specific processes of plants and its ancestors (algae, mosses and ferns). Several DOF proteins have been described to play important roles in the regulation of genes in seeds of the Triticeae tribe (Pooideae subfamily). Brachypodium distachyon is the first member of the Pooideae subfamily to be sequenced. Its small size and compact structured genome (272 Mbp), the short life cycle, small plant size and the possibility of being transformed with Agrobacterium tumefaciens (Ti-plasmid) make Brachypodium the model system for comparative studies within cereals of the Triticeae tribe that have big economic value such as wheat and barley. In this study, 27 Dof genes have been identified in the genome of B. distachyon and the evolutionary relationships among these Dof genes and those frome barley (Pooideae subfamily) and those from rice (Oryzoideae subfamily) have been established by building a phylogenetic tree based on the multiple alignment of the DOF DNA binding domains. The barley genome (Hordeum vulgare) contains 26 Dof genes and in rice (Oryza sativa) 30 genes have been annotated. The phylogenetic analysis establishes four Major Clusters of Orthologous Genes (MCOGs) that are supported by additional conserved motives out of the DOF domain, between proteins of the same MCOG. The global expression study of BdDof genes in different organs and tissues classifies BdDof genes into two groups; nine of the 27 BdDof genes are abundantly or preferentially expressed in seeds. A more detailed expression analysis of these genes during seed maturation and germination shows that BdDof24, orholog to barley BPBF-HvDof24, is the most abundantly expressed gene in germinating seeds. Transcriptional regulation studies of genes that encode hydrolases in aleurone cells during post-germination of cereal seeds, have identified in their promoters a tripartite conserved cis- motif GARC (GA-Responsive Complex) that binds TFs of the MYB-R2R3, DOF and MYBR1-SHAQKYF families. In this thesis, the characterization of the BdCathB gene, encoding a Cathepsin B-like protease and that is ortholog to the wheat Al21 and the barley HvCathB genes, has been done and its transcriptional regulation by the TFs BdDOF24 and BdGAMYB (ortholog to HvGAMYB) studied. The in silico analysis of the BdCathB promoter sequence has identified a GARC motif. BdCathB expression is induced upon germination, as well as, those of BdDof24 and BdGamyb genes. Moreover, BdDOF24 and BdGAMYB interact in yeast (Yeast 2 Hybrid System, Y2HS) and in planta (Bimolecular Fluorecence Complementation, BiFC). In transient assays in aleurone cells, BdGAMYB activates the BdCathB promoter, whereas BdDOF24 is a transcriptional repressor, this result is similar to that obtained with the barley orthologous genes BPBF-HvDOF24 and HvGAMYB. However, when aleurone cells are simultaneously transformed with both TFs, BdDOF24 has an additive effect to the trans-activation mediated by BdGAMYB, while its ortholog BPBF-HvDOF24 produces an opposite effect by reducing the HvGAMYB activation of the BdCathB promoter. The differences among the deduced protein sequences between BdDOF24 and BPBF-HvDOF24 could explain their opposite functions in the interaction with GAMYB protein. Preliminary results of T-DNA insertion (K.O.) and stable over-expression lines of BdGamyb support the data obtained in transient expression assays. In addition, the BdGamyb homozygous T-DNA insertion (K.O.) lines have anther and pollen alterations and they do not produce viable seeds.

Caracterización de la necrosis sistémica inducida por la interacción sinérgica entre el Virus X de la patata y potyvirus en Nicotiana benthamiana

Los virus de plantas pueden causar enfermedades severas que conllevan serias pérdidas económicas a nivel mundial. Además, en la naturaleza son comunes las infecciones simultáneas con distintos virus que conducen a la exacerbación de los síntomas de enfermedad, fenómeno al que se conoce como sinergismo viral. Una de las sintomatologías más severas causadas por los virus en plantas susceptibles es la necrosis sistémica (NS), que incluso puede conducir a la muerte del huésped. Este fenotipo ha sido comparado en ocasiones con la respuesta de resistencia de tipo HR, permitiendo establecer una serie de paralelismos entre ambos tipos de respuesta que sugieren que la NS producida en interacciones compatibles sería el resultado de una respuesta hipersensible sistémica (SHR). Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de la NS, su relación con procesos de defensa antiviral o su relevancia biológica aún no son bien entendidos, al igual que tampoco han sido estudiados los cambios producidos en la planta a escala genómica en infecciones múltiples que muestran sinergismo en patología. En esta tesis doctoral se han empleado distintas aproximaciones de análisis de expresión génica, junto con otras técnicas genéticas y bioquímicas, en el sistema modelo de Nicotiana benthamiana para estudiar la NS producida por la infección sinérgica entre el Virus X de la patata (PVX) y diversos potyvirus. Se han comparado los cambios producidos en el huésped a nivel genómico y fisiológico entre la infección doble con PVX y el Virus Y de la patata (PVY), y las infecciones simples con PVX o PVY. Además, los cambios transcriptómicos y hormonales asociados a la infección con la quimera viral PVX/HC‐Pro, que reproduce los síntomas del sinergismo entre PVX‐potyvirus, se han comparado con aquellos producidos por otros dos tipos de muerte celular, la PCD ligada a una interacción incompatible y la PCD producida por la disfunción del proteasoma. Por último, técnicas de genética reversa han permitido conocer la implicación de factores del huésped, como las oxilipinas, en el desarrollo de la NS asociada al sinergismo entre PVXpotyvirus. Los resultados revelan que, respecto a las infecciones con solo uno de los virus, la infección doble con PVX‐PVY produce en el huésped diferencias cualitativas además de cuantitativas en el perfil transcriptómico relacionado con el metabolismo primario. Otros cambios en la expresión génica, que reflejan la activación de mecanismos de defensa, correlacionan con un fuerte estrés oxidativo en las plantas doblemente infectadas que no se detecta en las infecciones simples. Además, medidas en la acumulación de determinados miRNAs implicados en diversos procesos celulares muestran como la infección doble altera de manera diferencial tanto la acumulación de estos miRNAs como su funcionalidad, lo cual podría estar relacionado con los cambios en el transcriptoma, así como con la sintomatología de la infección. La comparación a nivel transcriptómico y hormonal entre la NS producida por PVX/HC‐Pro y la interacción incompatible del Virus del mosaico del tabaco en plantas que expresan el gen N de resistencia (SHR), muestra que la respuesta en la interacción compatible es similar a la que se produce durante la SHR, si bien se presenta de manera retardada en el tiempo. Sin embargo, los perfiles de expresión de genes de defensa y de respuesta a hormonas, así como la acumulación relativa de ácido salicílico (SA), ácido jasmonico (JA) y ácido abscísico, en la interacción compatible son más semejantes a la respuesta PCD producida por la disfunción del proteasoma que a la interacción incompatible. Estos datos sugieren una contribución de la interferencia sobre la funcionalidad del proteasoma en el incremento de la patogenicidad, observado en el sinergismo PVX‐potyvirus. Por último, los resultados obtenidos al disminuir la expresión de 9‐LOX, α‐DOX1 y COI1, relacionados con la síntesis o con la señalización de oxilipinas, y mediante la aplicación exógena de JA y SA, muestran la implicación del metabolismo de las oxilipinas en el desarrollo de la NS producida por la infección sinérgica entre PVXpotyvirus en N. benthamiana. Además, estos resultados indican que la PCD asociada a esta infección, al igual que ocurre en interacciones incompatibles, no contiene necesariamente la acumulación viral, lo cual indica que necrosis e inhibición de la multiplicación viral son procesos independientes. ABSTRACT Plant viruses cause severe diseases that lead to serious economic losses worldwide. Moreover, simultaneous infections with several viruses are common in nature leading to exacerbation of the disease symptoms. This phenomenon is known as viral synergism. Systemic necrosis (SN) is one of the most severe symptoms caused by plant viruses in susceptible plants, even leading to death of the host. This phenotype has been compared with the hypersensitive response (HR) displayed by resistant plants, and some parallelisms have been found between both responses, which suggest that SN induced by compatible interactions could be the result of a systemic hypersensitive response (SHR). However, the molecular mechanisms involved in the development of SN, its relationship with antiviral defence processes and its biological relevance are still unknown. Furthermore, the changes produced in plants by mixed infections that cause synergistic pathological effects have not been studied in a genome‐wide scale. In this doctoral thesis different approaches have been used to analyse gene expression, together with other genetic and biochemical techniques, in the model plant Nicotiana benthamiana, in order to study the SN produced by the synergistic infection of Potato virus X (PVX) with several potyviruses. Genomic and physiological changes produced in the host by double infection with PVX and Potato virus Y (PVY), and by single infection with PVX or PVY have been compared. In addition, transcriptional and hormonal changes associated with infection by the chimeric virus PVX/HC‐Pro, which produces synergistic symptoms similar to those caused by PVX‐potyvirus, have been compared with those produced by other types of cell death. These types of cell death are: PCD associated with an incompatible interaction, and PCD produced by proteasome disruption. Finally, reverse genetic techniques have revealed the involvement of host factors, such as oxylipins, in the development of SN associated with PVX‐potyvirus synergism. The results revealed that compared with single infections, double infection with PVX‐PVY produced qualitative and quantitative differences in the transcriptome profile, mainly related to primary metabolism. Other changes in gene expression, which reflected the activation of defence mechanisms, correlated with a severe oxidative stress in doubly infected plants that was undetected in single infections. Additionally, accumulation levels of several miRNAs involved in different cellular processes were measured, and the results showed that double infection not only produced the greatest variations in miRNA accumulation levels but also in miRNA functionality. These variations could be related with transcriptomic changes and the symptomatology of the infection. Transcriptome and hormone level comparisons between SN induced by PVX/HCPro and the incompatible interaction produced by Tobacco mosaic virus in plants expressing the N resistance gene (SHR), showed some similarities between both responses, even though the compatible interaction appeared retarded in time. Nevertheless, the expression profiles of both defence‐related genes and hormoneresponsive genes, as well as the relative accumulation of salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) and abscisic acid in the compatible interaction are more similar to the PCD response produced by proteasome disruption. These data suggest that interference with proteasome functionality contributes to the increase in pathogenicity associated with PVX‐potyvirus synergism. Finally, the results obtained by reducing the expression of 9‐LOX, α‐DOX1 and COI1, related with synthesis or signalling of oxylipins, and by applying exogenously JA and SA, revealed that oxylipin metabolism is involved in the development of SN induced by PVX‐potyvirus synergistic infections in N. benthamiana. Moreover, these results also indicated that PVX‐potyvirus associated PCD does not necessarily restrict viral accumulation, as is also the case in incompatible interactions. This indicates that both necrosis and inhibition of viral multiplication are independent processes.

Expresión de la resistencia en plantas de tomate a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica)

La resistencia genética mediada por los genes R es uno de los sistemas de defensa de las plantas frente a patógenos y se activa una vez que los patógenos han superado la defensa basal que otorgan la cutícula y pared celular. Los mecanismos de resistencia genética se inician a su vez, por el reconocimiento de productos derivados de genes de avirulencia de los patógenos (avr) por parte de las proteínas R. Tanto la respuesta de defensa basal como la respuesta de defensa por genes R están influenciadas por patrones de regulación hormonal, que incluye a las principales hormonas vegetales ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET). En tomate (Solanum lycopersicum) uno de los genes R es el gen MiG1, que confiere resistencia a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica, M. incognita y M. arenaria). Uno de los eventos más importantes que caracterizan a la respuesta de resistencia es la reacción hipersensible (HR), que está mediada por la activación temprana de una serie de sistemas enzimáticos, entre los que destaca el de las peroxidasas (PRXs) Clase III. Su función es importante tanto para limitar el establecimiento y expansión del nematodo, al generar ambientes altamente tóxicos por su contribución en la producción masiva de ROS, como por su implicación en la síntesis y depósito de lignina generando barreras estructurales en el sitio de infección. Además de estos mecanismos de defensa asociados a la resistencia constitutiva, las plantas pueden desarrollar resistencia sistémica adquirida (SAR) que en la naturaleza ocurre, en ocasiones, en una fase posterior a que la planta haya sufrido el ataque de un patógeno. Así mismo hay diferentes productos de origen químico como el benzotiadiazol o BTH (ácido S-metil benzol-(1,2,3)-tiadiozole-7-carbónico ester) que pueden generar esta misma respuesta SAR. Como resultado, la planta adquiere resistencia sistémica frente a nuevos ataques de patógenos. En este contexto, el presente trabajo aborda en primer lugar el análisis comparativo, mediante microarrays de oligonucleótidos, de los transcriptomas de los sistemas radicales de plantas de tomate de 8 semanas de edad de dos variedades, una portadora del gen de resistencia MiG1 (Motelle) y otra carente del mismo y, por tanto, susceptible (Moneymaker), antes y después de la infección por M. javanica. Previo a la infección se observó que la expresión de un gran número de transcritos era más acusada en la variedad resistente que en la susceptible, entre ellos el propio gen MiG1 o los genes PrG1 (o P4), LEJA1 y ER24, lo que indica que, en ausencia de infección, las rutas hormonales del SA, JA y ET están más activas en la raíz de la variedad resistente. Por el contrario, un número mucho menor de transcritos presentaban su expresión más reducida en Motelle que en Moneymaker, destacando un gen de señalización para sintetizar la hormona giberelina (GA). La infección por M. javanica causa importantes cambios transcripcionales en todo el sistema radical que modifican sustancialmente las diferencias basales entre plantas Motelle y Moneymaker, incluida la sobreexpresión en la variedad resistente de los transcritos de MiG1, que se reduce parcialmente, mientras que las rutas hormonales del SA y el JA continuan más activas que en la susceptible (evidente por los genes PrG1 y LEJA1). Además, los cambios asociados a la infección del nematodo se evidencian por las grandes diferencias entre los dos tiempos post-infección considerados, de tal forma que en la fase temprana (2 dpi) de la interacción compatible predomina la sobreexpresión de genes de pared celular y en la tardía (12 dpi) los relacionados con el ARN. En el análisis de la interacción incompatible, aunque también hay muchas diferencias entre ambas fases, hay que destacar la expresión diferencial común de los genes loxA y mcpi (sobrexpresados) y del gen loxD (reprimido) por su implicación en defensa en otras interacciones planta-patógeno. Cabe destacar que entre las interacciones compatible e incompatible hubo muy pocos genes en común. En la etapa temprana de la interacción compatible destacó la activación de genes de pared celular y la represión de la señalización; en cambio, en la interacción incompatible hubo proteínas principalmente implicadas en defensa. A los 12 días, en la interacción compatible los genes relacionados con el ARN y la pared celular se sobreexpresaban principalmente, y se reprimían los de proteínas y transporte, mientras que en la incompatible se sobreexpresaron los relacionados con el estrés, el metabolismo secundario y el de hormonas y se reprimieron los de ARN, señalización, metabolismo de hormonas y proteínas. Por otra parte, la técnica de silenciamiento génico VIGS reveló que el gen TGA 1a está implicado en la resistencia mediada por el gen MiG1a M. javanica. Así mismo se evaluó el transcriptoma de todo el sistema radical de la variedad susceptible tras la aplicación del inductor BTH, y se comparó con el transcriptoma de la resistente. Los resultados obtenidos revelan que el tratamiento con BTH en hojas de Moneymaker ejerce notables cambios transcripcionales en la raíz; entre otros, la activación de factores de transcripción Myb (THM16 y THM 27) y del gen ACC oxidasa. Las respuestas inducidas por el BTH parecen ser de corta duración ya que no hubo transcritos diferenciales comunes a las dos fases temporales de la infección comparadas (2 y 12 dpi). El transcriptoma de Moneymaker tratada con BTH resultó ser muy diferente al de la variedad resistente Motelle, ambas sin infectar, destacando la mayor expresión en el primero del gen LeEXP2, una expansina relacionada con defensa frente a nematodos. Las respuestas inducidas por los nematodos en Moneymaker-BTH también fueron muy distintas a las observadas previamente en la interacción incompatible mediada por MiG1, pues sólo se detectaron 2 genes sobreexpresados comunes a ambos eventos. Finalmente, se abordó el estudio de la expresión diferencial de genes que codifican PRXs y su relación con la resistencia en la interacción tomate/M. javanica. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio del análisis del transcriptoma de tomate de la interacción compatible, obtenido en un estudio previo a partir de tejido radical infectado en distintos tiempos de infección. Se han identificado 16 unigenes de PRXs con expresión diferencial de los cuales 15 se relacionan por primera vez con la respuesta a la infección de nematodos. La mayoría de los genes de PRXs identificados, 11, aparecen fuertemente reprimidos en el sitio de alimentación, en las células gigantes (CG). Dada la implicación directa de las PRXs en la activación del mecanismo de producción de ROS, la supresión de la expresión génica local de genes de PRXs en el sitio de establecimiento y alimentación pone de manifiesto la capacidad del nematodo para modular y superar la respuesta de defensa de la planta de tomate en la interacción compatible. Posteriormente, de estos genes identificados se han elegido 4: SGN-U143455, SGN-U143841 y SGN-U144042 reprimidos en el sitio de infección y SGN-U144671 inducido, cuyos cambios de expresión se han determinado mediante análisis por qRT-PCR y de hibridación in situ en dos tiempos de infección (2 dpi y 4 dpi) y en distintos tejidos radicales de tomate resistente y susceptible. Los patrones de expresión obtenidos demuestran que en la interacción incompatible la transcripción global de los 4 genes estudiados se dispara en la etapa más temprana en el sitio de infección, detectándose la localización in situ de transcritos en el citoplasma de las células corticales de la zona meristemática afectadas por el nematodo. A 4 dpi se observó que los niveles de expresión en el sitio de infección cambian de tendencia y los genes SGN-U144671 y SGN-U144042 se reprimen significativamente. Los diferentes perfiles de expresión de los genes PRXs en los dos tiempos de infección sugieren que su inducción en las primeras 48 horas es crucial para la respuesta de defensa relacionada con la resistencia frente a la invasión del nematodo. Por último, al analizar el tejido radical sistémico, se detectó una inducción significativa de la expresión en la fase más tardía de la infección del gen SGN-U144042 en el genotipo susceptible y del SGN-U143841 en ambos genotipos. En este estudio se describe por primera vez la inducción de la expresión sistémica de genes de PRXs en tomate durante la interacción compatible e incompatible con M. javanica lo que sugiere su posible implicación funcional en la respuesta de defensa SAR activada por la infección previa del nematodo. ABSTRACT Plants defend themselves from pathogens by constitutive and/or induced defenses. A common type of induced defense involves plant resistance genes (R), which are normally activated in response to attack by specific pathogen species. Typically, a specific plant R protein recognizes a specific pathogen avirulence (avr) compound. This initiates a complex biochemical cascade inside the plant that results in synthesis of antipathogen compounds. This response can involve chemical signaling, transcription, translation, enzymes and metabolism, and numerous plant hormones such as salicylic acid (SA), jasmonates (JA) and ethylene (ET). Induced plant defense can also activate Class III peroxidases (PRXs), which produce reactive oxygen species (ROS), regulate extracellular H2O2, and play additional roles in plant defense. R-gene activation and the resulting induced defense often remain localized in the specific tissues invaded by the plant pathogen. In other cases, the plant responds by signaling the entire plant to produce defense compounds (systemic induction). Plant defense can also be induced by the exogenous application of natural or synthetic elicitors, such as benzol-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothionic acid. There is much current scientific interest in R-genes and elicitors, because they might be manipulated to increase agricultural yield. Scientists also are interested in systemic induction, because this allows the entire plant to be defended. In this context, one of the aims of this investigation was the transcriptoma analysis of the root systems of two varieties of tomato, the resistant variety (Motelle) that carrier MiG1 and the susceptible (Moneymaker) without MiG1, before and after infection with M. javanica. The overexpression was more pronounced in the transcriptoma of the resistant variety compared with susceptible, before infection, including the MiG1 gene, PrG1 (or P4) genes, LEJA1 and ER24, indicating that hormone SA, JA and ET are active in the resistant variety. Moreover, GA hormone presents an opposite behavior. M. javanica infection causes significant transcriptional changes in both compatible (Moneymaker-M. javanica) and incompatible (Motelle-M. javanica) interaction. In the incompatible transcriptome root system, was notably reduced the expression of the MiG1 gene, and a continuity in the expression of the hormonal pathways of SA and JA. In other hand, transcriptional profile changes during compatible interaction were associated with nematode infection. The large differences between the two times point infection considered (2 dpi and 12 dpi) indicates an overexpression of cell wall related genes in the first phase, and conversely an overexpression of RNA genes in the late phase. Transcriptoma analysis of incompatible interaction, although there were differences between the two phases, should be highlighted the common differential gene expression: loxA and mcpi (overexpressed) and loxD gene (suppressed), as they are involved in defenses in other plant-pathogen interactions. The VIGS tool has provided evidence that TGA 1a is involved in MiG1 mediated resistance to M. javanica. Likewise, the systemic application of BTH was assessed and compared with susceptible and resistant variety. Root system transcriptoma of BTH treatment on leaves showed the activation of Myb transcription factors (THM16 and THM27), the ACC oxidase gene. and the LeEXP2 gene, encoding for an expansin enzyme, related with defense against nematodes. The activation appears to be reduced by subsequent infection and establishment of nematodes. To assist in elucidate the role of tomato PRXs in plant defence against M. javanica, the transcriptome obtained previously from isolated giant cells (GC) and galls at 3 and 7 dpi from the compatible interaction was analysed. A total of 18 different probes corresponding to 16 PRX encoding genes were differentially expressed in infection site compared to the control uninfected root tissues. Most part of them (11) was down-regulated. These results yielded a first insight on 15 of the PRX genes responding to tomato–Meloidogyne interaction and confirm that repression of PRX genes might be crucial for feeding site formation at the initial stages of infection. To study the involvement of PRX genes in resistance response, four genes have been selected: SGN-U143455, SGN-U143841 and SGN-U144042 consistently down-regulated and SGN-U144671 consistently up-regulated at infection site in compatible interaction. The expression changes were determined by qRT-PCR and in situ location at 2 dpi and 4 dpi, and in different root tissues of resistant and susceptible plants. Early upon infection (2 dpi), the transcripts levels of the four genes were strongly increased in infected tissue of resistant genotype. In situ hybridization showed transcript accumulation of them in meristem cortical cells, where the nematode made injury. The results obtained provide strong evidence that early induction of PRX genes is important for defence response of the resistance against nematode invasion. Moreover, the induction patterns of SGN-U144042 gene observed at 4 dpi in distal noninfected root tissue into the susceptible genotype and of SGN-U143841 gene in both genotypes suggest a potential involvement of PRX in the systemic defence response.

Respuesta transcripcional de Populus a bifenilos policlorados: Aspectos aplicados a la fitorremediación

La degradación del suelo ha adquirido una magnitud preocupante. Los métodos tradicionales de descontaminación, son costosos e insuficientes. La fitorremediación representa una alternativa eficaz, de bajo coste, respetuosa con el medio ambiente, que además mejora las propiedades del suelo, si bien ha habido desarrollos relevantes en la última década. Desde el punto de vida científico, el reto principal es descifrar las rutas metabólicas implicadas en respuesta a contaminantes y comprender su regulación. Esta información es imprescindible si aspiramos a mejorar las capacidades naturales de algunas especies vegetales para remediar los suelos contaminados. Los estudios de esta Tesis se han centrado en Populus, el mejor modelo forestal disponible a raíz de la secuenciación de su genoma completo. Por otra parte, Populus tiene una gran capacidad natural para la degradación de contaminantes orgánicos, lo que explica su predominio en los programas forestales de fitorremediación que se desarrollan actualmente. Hemos elegido en concreto al híbrido Populus tremula x P. alba, por la facilidad con que se cultiva y su particular interés biotecnológico. La presente Tesis plantea un estudio comprehensivo de la respuesta molecular a bifenilos policlorados (PCBs), una familia de contaminantes orgánicos persistentes de particular relevancia a escala mundial. Se ha utilizado para ello una aproximación transcriptómica, basada en tecnología RNA-seq, para identificar los genes implicados en el metabolismo de los compuestos in planta y cuantificar sus niveles de activación en distintas situaciones controladas. La tesis pretende asimismo definir el control transcripcional subyacente a la respuesta bioquímica frente a este tipo de contaminantes. Resulta sorprendente que dicha respuesta sea prácticamente desconocida a nivel molecular, a pesar de su gran potencial aplicado en el contexto de la tecnología fitorremediadora. Para desarrollar este proyecto aplicamos a nuestros cultivos de chopo híbridos concentraciones diferentes de Aroclor 1221, una mezcla de PCBs muy utilizada a nivel comercial durante décadas, su uso está prohibido hoy internacionalmente. Y tomamos muestras de RNA a dos concentraciones y dos momentos distintos de exposición al contaminante, generando así una matriz de cuatro elementos con sus controles correspondientes. Con el fin de incrementar la especificidad de nuestro análisis, consideramos sobre todo los genes diferencialmente expresados más significativos según cuatro algoritmos estadísticos distintos. Por otra parte, realizamos análisis funcionales con herramientas bioinformáticas basadas en comparaciones de secuencias y en redes de co-expresión génica. La respuesta de los genes de particular interés fue validada mediante tecnología qRT-PCR (reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa en tiempo real). Se trata del primer estudio comprehensivo de la respuesta de un organismo vegetal ante la presencia de PCBs. Este estudio nos ha permitido identificar una cantidad considerable de genes estructurales y reguladores, definiendo nuevos factores de transcripción cuya expresión es proporcional a la concentración de contaminante en el medio o al tiempo de exposición al mismo. Los análisis de correlación nos permiten afirmar en que la respuesta metabólica a PCBs, incluyendo posibles rutas degradadoras, participan en al menos quince factores de transcripción y unas cuarenta proteínas o enzimas que resultan particularmente inducidas. Entre las familias implicadas destacan los citocromos P450, la glutatión transferasas, las deshidrogenasas reductasas (short-chain dehydrogenase reductase) y las proteínas MDR (multi-drug resistance). Mientras que los factores de transcripción encontrados pertenecen a la familia de ZF-TF, MYBs, WRKYs entre otros. También identificamos proteínas de función desconocida que no se habían vinculado previamente a este tipo de respuestas en plantas, como la CSP (cold-shock domain proteins). Para estudiar su posible relación con la presencia de PCBs, se caracterizó un gen de esta familia detectado mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) a partir de mapas IEF x SDS-PAGE (isoelectro focusing x sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) de alta resolución. Mediante qRT-PCR pudimos confirmar la inducción del gen correspondiente, ortólogo a PtCSP4 de P. trichocarpa (Potri.004g172600), en respuesta a Aroclor 1221. El análisis fenotípico de las líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobre-expresaba la proteína CSP de chopo híbrido confirmó un papel para la misma tolerancia a PCBs, posiblemente a través de mecanismos reguladores que activan proteínas MDR. Este trabajo, además de aportar datos novedosos sobre los mecanismos moleculares desencadenados por la presencia de un PCB en Populus, utilizado aquí como sistema modelo. Con ello se demuestra el potencial de las especies arbóreas no solo como agentes descontaminantes, ya explotado comercialmente, sino también como fuente potencial de genes interesantes. Entre los genes identificados en esta Tesis hay candidatos evidentes a participar en mecanismos de tolerancia al estrés inducido por la contaminación y también rutas metabólicas degradadores de PCBs. Precisamente la posibilidad de degradar al contaminante confiere particular interés a este tipo de estudios frente a la fitorremediación de metales pesados y otros contaminantes elementales. La comparación de los datos generados en este estudio con estudios análogos que se realicen en el futuro con otras especies y xenobióticos, contribuirán a definir mejor la respuesta de las plantas ante la contaminación orgánica y mejorar su potencial descontaminante. ABSTRACT Soil degradation has acquired a disturbing magnitude. Traditional methods of decontamination are expensive and insufficient. Phytoremediation represent an effective alternative, low cost, respectful of the environment, that also improves soil properties, although there have been relevant developments in the last decade. From a life scientist, the challenge is to decipher the major metabolic pathways involved in response to pollutants and understand their regulation. This information is essential if we desire to enhance the natural abilities of some plant species to remediate contaminated soils. This thesis studies have focused on Populus, the best available forestry model following the sequencing of the entire genome. Moreover, Populus has a natural ability to degrade organic pollutants, which explains its predominance in phytoremediation forestry programs currently being developed. We have chosen specifically to hybrid Populus tremula x P. alba, the ease with which it is grown and its particular biotechnological interest. This thesis presents a comprehensive study of the molecular response to polychlorinated biphenyls (PCBs), a family of persistent organic pollutants of particular relevance worldwide. It has been used for a transcriptomic approach using RNA-seq technology, to identify genes involved in the metabolism of compounds in plant and quantify their levels of activation in different controlled situations. The thesis also aims to define the underlying transcriptional control the biochemical response to these pollutants. It is surprising that the response is virtually unknown at the molecular level, despite its great potential applied in the context of phytoremediation technology. To develop this project we applied our hybrid poplar crops different concentrations of Aroclor 1221, a mixture of PCBs widely used commercially for decades, its use is now banned internationally. And we RNA samples at two different concentrations and times of exposure to the pollutant, generating an array of four elements with their corresponding controls. In order to increase the specificity of our analysis, we consider mainly the most significant differentially expressed genes in four different statistical algorithms. Moreover, functional analyzes conducted with bioinformatics tools based on sequence comparisons and networks gene co-expression. The response of genes of particular interest was validated by qRT-PCR (polymerase reaction chain in real-time quantitative. This is the first comprehensive study of the response of a plant organism in the presence of PCBs. This study allowed us to identify a considerable amount of structural and regulatory genes, defining new transcription factors whose expression is proportional to the concentration of contaminant in the middle or at the time of exposure. Correlation analyzes allow us to affirm that the metabolic response to PCBs, including possible degradative pathways, at least fifteen involved in transcription factors and forty proteins or enzymes which are particularly induced. Among the families involved include cytochromes P450, the glutathione transferases, dehydrogenases reductases (short -chain dehydrogenase reductase) and MDR proteins (multi - drug resistance). While transcription factors belong to the family found ZF-TF, MYBs, WRKYs among others. We also identify proteins of unknown function that had not been previously linked to such responses in plants such as CSP (cold- shock domain proteins). To study their possible relationship with the presence of PCBs, a gene in this family was characterized and was detected by tandem mass spectrometry (MS/MS) from maps IEF x SDS -PAGE (sodium dodecyl isoelectro x sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) of high resolution. By qRT -PCR could confirm the induction of the corresponding gene, ortholog to PtCSP4 of P. trichocarpa (Potri.004g172600), in response to Aroclor 1221. Phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines over- expressing the protein CSP poplar hybrid confirmed a role for PCBs same tolerance, possibly through regulatory mechanisms activated MDR proteins. This work, in addition to providing new data on the molecular mechanisms triggered by the presence of PCBs in Populus, used here as a model system. Thus the potential of tree species not only as decontamination agents, and commercially exploited, but also as a potential source of interesting genes is shown. Among the genes identified in this thesis there are evident candidates to participate in tolerance mechanisms to stress induced by pollution and degrading metabolic pathways of PCBs. Precisely the possibility of degrading the pollutant attaches particular interest to this type of study off the phytoremediation of heavy metals and other elemental pollutants. The comparison of the data generated in this study with similar studies carried out in the future with other species and xenobiotics contribute to better define the response of plants to organic pollution and improve their decontamination potential.

Estudio de la diversidad genética de Botrytis sp en orquídeas y la resistencia al ataque del hongo

En la actualidad la mayoría de plantas sufren pérdidas debido a las enfermedades que les provocan los hongos. Uno de estos grupos amenazado por el ataque de los hongos son las especies de la familia Orchidaceae, especies que se encuentran amenazadas y con numerosas especies en peligro de extinción. Uno de los problemas sanitarios más destacados es Botrytis cinerea, hongo patógeno cosmopolita, causante de enfermedades importantes en muchas plantas tales como frutas, verduras, accesiones de viveros, plantas ornamentales y huertos cultivos (Jarvis 1977; Elad et al., 2007). Este género es uno de los grupos de hongos más ampliamente conocido y distribuido. Contiene 22 especies (Hennebert 1973; Yohalem et al., 2003) y un híbrido (B. allii) (Yohalem & Alabama, 2003) vinculado a las etapas sexuales y un amplio número de huéspedes específicos (Beever y Weds, 2000); infecta más de 200 especies vegetales distintas (Williamson et al., 2007). Dada la importancia de este patógeno se realiza un estudio de caracterización morfológica y molecular del hongo, aislado de plantas de orquídeas cultivadas en condiciones de invernadero, de hortalizas y plantas frutales, con síntomas de necrosis, atizonamientos y pudriciones. El análisis de las características morfológicas (presencia de esclerocios, tamaño de conidios, presencia de estructuras sexuales in vitro) y fenotípicas (crecimiento micelial a diferentes temperaturas, germinación de esporas), nos permitió determinar características importantes del comportamiento del hongo y establecer cuáles son las mejores condiciones para su patogenicidad. Se afianzo este trabajo con estudios moleculares a través del análisis de la región ribosomal ITS1-ITS4. Entre los aislados estudiados se identificaron dos especies diferentes, Botrytis cinerea y B. fabiopsis, esta última conocida como especifica de Vicia faba, se lo aisló de una planta de Pelargonium sp. Se hizo un análisis filogenético para comparar estas dos especies, encontrándose que B. fabiopsis está estrechamente relacionada con B. cinerea y B. elliptica, pero lejanamente relacionado con B. fabae. Además, se analizó las poblaciones de los aislados de Botrytis, para ello se seleccionaron tres parejas de cebadores microsatelites con altos porcentajes de polimorfismo. Al analizar la similaridad entre los aislados se determinaron tres grupos de poblaciones de B. cinerea entre los cuales Botrytis fabiopsis comparte un grupo grande con B. cinerea. La diferenciación genética no fue significativa entre la población de aislados de orquídeas y hortalizas, la diferencia génica que fue muy baja, lo que sugiere que la especificidad de Botrytis no está dada por los hospederos, aunque la posibilidad de la especificidad con algún cultivo no puede descartarse. ABSTRACT Most plants suffer diseases caused by fungi. Orchidaceae is one of the threatened groups with many endangered species. Included into the most important problems in plant health is Botrytis cinerea, a cosmopolitan pathogen which causes major diseases in many plants of agronomic interest such as fruits, vegetables, planthouses accessions and ornamental plants (Jarvis, 1977; Elad et al, 2007). The genus Botrytis is one of the most widely and disseminated fungi. The genus contains 22 species (Hennebert 1973; Yohalem et al, 2003) and a hybrid (B. allii) (Yohalem & Alabama, 2003) linked to the sexual stages of a large number of specific hosts (Beever & Weds, 2000); infects over 200 different plant species (Williamson et al., 2007). Due to the importance of this pathogen, a study of morphological and molecular characterization of the fungus was carried out. Fungi samples were isolated from orchid plants grown in greenhouse conditions, vegetables and fruits with signs of necrosis, blight and rottening. To establish the best conditions for pathogenicity, behavioral characteristics of the fungus were studied through the analysis of morphological characteristics (presence of sclerotia, conidia size, sexual structures in vitro) and mycelial growth at different temperatures. To complete the characterization of the fungi, a molecular study was performed via the analysis of ribosomal ITS1-ITS4 region. Two different species were identified: Botrytis cinerea and Botrytis fabiopsis (known by specificity to Vicia faba). B. fabiopsis was isolated from a plant of the genus Pelargonium. A phylogenetic analysis was carried out to compare these two species leading to the conclusion that B. fabiopsis is closely related to B. cinerea and B. elliptica, but distantly related to B. fabae. The populations of Botrytis isolates were also analyzed. Three pairs of microsatellite primers with high percentages of polymorphism were selected. A similarity analysis showed three groups of populations of B. cinerea, including Botrytis fabiopsis. The genetic differentiation was not significant among the populations of isolates from orchids and vegetables; genetic differences were very low, suggesting that the specificity of Botrytis species is not given by the hosts.