Genomic analyses of flowering transition and inflorescence development in grapevine = Análisis genómicos de la transición floral y del desarrollo de la inflorescencia en la vid

The general objective of this work is to analyze the regulatory processes underlying flowering transition and inflorescence and flower development in grapevine. Most of these crucial developmental events take place within buds growing during two seasons in two consecutive years. During the first season, the shoot apical meristem within the bud differentiates all the basic elements of the shoot including flowering transition in lateral primordia and development of inflorescence primordia. These events practically end with bud dormancy. The second season, buds resume shoot growth associated to flower formation and development. In grapevine, the lateral meristems can give rise either to tendril or inflorescence primordia that are homologous organs. With this purpose, we performed global transcriptome analyses along the bud annual cycle and during inflorescence and tendril development. In addition, we approach the genomic analysis of the MIKC type MADS-box gene family in grapevine to identify all its members and assign them putative biological functions. Regarding buds developmental cycle, the results indicate that the main factors explaining the global gene expression differences were the processes of bud dormancy and active growth as well as stress responses. Non dormant buds exhibited up-regulation in functional categories typical of actively proliferating and growing cells (photosynthesis, cell cycle regulation, chromatin assembly) whereas in dormant ones the main functional categories up-regulated were associated to stress response pathways together with transcripts related to starch catabolism. Major transcriptional changes during the dormancy period were associated to the para/endodormancy, endo/ecodormancy and ecodormancy/bud break transitions. Global transcriptional analyses along tendril and inflorescence development suggested that these two homologous organs share a common transcriptional program related to cell proliferation functions. Both structures showed a progressive decrease in the expression of categories such as cell-cycle, auxin metabolism/signaling, DNA metabolism, chromatin assembly and a cluster of five transcripts belonging to the GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) transcription factor family, that are known to control cell proliferation in other species and determine the size of lateral organs. However, they also showed organ specific transcriptional programs that can be related to their differential organ structure and function. Tendrils showed higher transcription of genes related to photosynthesis, hormone signaling and secondary metabolism than inflorescences, while inflorescences have higher transcriptional activity for genes encoding transcription factors (especially those belonging to the MADS-box gene family). Further analysis along inflorescence development evidenced the relevance of additional functions likely related to processes of flower development such as fatty acid and lipid metabolism, jasmonate signaling and oxylipin biosynthesis. The transcriptional analyses performed highlighted the relevance of several groups of transcriptional regulators in the developmental processes studied. The expression profiles along bud development revealed significant differences for some MADS-box subfamilies in relation to other plant species, like the members of the FLC and SVP subfamilies suggesting new roles for these groups in grapevine. In this way, it was found that VvFLC2 and VvAGL15.1 could participate, together with some members of the SPL-L family, in dormancy regulation, as was shown for some of them in other woody plants. Similarly, the expression patterns of the VvFLC1, VvFUL, VvSOC1.1 (together with VvFT, VvMFT1 and VFL) genes could indicate that they play a role in flowering transition in grapevine, in parallel to their roles in other plant systems. The expression levels of VFL, the grapevine LEAFY homolog, could be crucial to specify the development of inflorescence and flower meristems instead of tendril meristems. MADS-box genes VvAP3.1 and 2, VvPI, VvAG1 and 3, VvSEP1-4, as well as VvBS1 and 2 are likely associated with the events of flower meristems and flower organs differentiation, while VvAP1 and VvFUL-L (together with VvSOC1.1, VvAGL6.2) could be involved on tendril development given their expression patterns. In addition, the biological function ofVvAP1 and VvTFL1A was analyzed using a gene silencing approach in transgenic grapevine plants. Our preliminary results suggested a possible role for both genes in the initiation and differentiation of tendrils. Finally, the genomic analysis of the MADS-box gene family in grapevine revealed differential features regarding number and expression pattern of genes putatively involved in the flowering transition process as compared to those involved in the specification of flower and fruit organ identity. Altogether, the results obtained allow identifying putative candidate genes and pathways regulating grapevine reproductive developmental processes paving the way to future experiments demonstrating specific gene biological functions. RESUMEN El objetivo general de este trabajo es analizar los procesos regulatorios subyacentes a la inducción floral así como al desarrollo de la inflorescencia y la flor en la vid. La mayor parte de estos eventos cruciales tienen lugar en las yemas a lo largo de dos estaciones de crecimiento consecutivas. Durante la primera estación, el meristemo apical contenido en la yema diferencia los elementos básicos del pámpano, lo cual incluye la inducción de la floración en los meristemos laterales y el subsiguiente desarrollo de primordios de inflorescencia. Estos procesos prácticamente cesan con la entrada en dormición de la yema. En la segunda estación, se reanuda el crecimiento del pámpano acompañado por la formación y desarrollo de las flores. En la vid, los meristemos laterales pueden dar lugar a primordios de inflorescencia o de zarcillo que son considerados órganos homólogos. Con este objetivo llevamos a cabo un estudio a nivel del transcriptoma de la yema a lo largo de su ciclo anual, así como a lo largo del desarrollo de la inflorescencia y del zarcillo. Además realizamos un análisis genómico de la familia MADS de factores transcripcionales (concretamente aquellos del tipo MIKC) para identificar todos sus miembros y tratar de asignarles posibles funciones biológicas. En cuanto al ciclo de desarrollo de la yema, los resultados indican que los principales factores que explican las diferencias globales en la expresión génica fueron los procesos de dormición de la yema y el crecimiento activo junto con las respuestas a diversos tipos de estrés. Las yemas no durmientes mostraron un incremento en la expresión de genes contenidos en categorías funcionales típicas de células en proliferación y crecimiento activo (como fotosíntesis, regulación del ciclo celular, ensamblaje de cromatina), mientras que en las yemas durmientes, las principales categorías funcionales activadas estaban asociadas a respuestas a estrés, así como con el catabolismo de almidón. Los mayores cambios observados a nivel de transcriptoma en la yema coincidieron con las transiciones de para/endodormición, endo/ecodormición y ecodormición/brotación. Los análisis transcripcionales globales a lo largo del desarrollo del zarcillo y de la inflorescencia sugirieron que estos dos órganos homólogos comparten un programa transcripcional común, relacionado con funciones de proliferación celular. Ambas estructuras mostraron un descenso progresivo en la expresión de genes pertenecientes a categorías funcionales como regulación del ciclo celular, metabolismo/señalización por auxinas, metabolismo de ADN, ensamblaje de cromatina y un grupo de cinco tránscritos pertenecientes a la familia de factores transcripcionales GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF), que han sido asociados con el control de la proliferación celular y en determinar el tamaño de los órganos laterales en otras especies. Sin embargo, también pusieron de manifiesto programas transcripcionales que podrían estar relacionados con la diferente estructura y función de dichos órganos. Los zarcillos mostraron mayor actividad transcripcional de genes relacionados con fotosíntesis, señalización hormonal y metabolismo secundario que las inflorescencias, mientras que éstas presentaron mayor actividad transcripcional de genes codificantes de factores de transcripción (especialmente los pertenecientes a la familia MADS-box). Análisis adicionales a lo largo del desarrollo de la inflorescencia evidenciaron la relevancia de otras funciones posiblemente relacionadas con el desarrollo floral, como el metabolismo de lípidos y ácidos grasos, la señalización mediada por jasmonato y la biosíntesis de oxilipinas. Los análisis transcripcionales llevados a cabo pusieron de manifiesto la relevancia de varios grupos de factores transcripcionales en los procesos estudiados. Los perfiles de expresión estudiados a lo largo del desarrollo de la yema mostraron diferencias significativas en algunas de las subfamilias de genes MADS con respecto a otras especies vegetales, como las observadas en los miembros de las subfamilias FLC y SVP, lo cual sugiere que podrían desempeñar nuevas funciones en la vid. En este sentido, se encontró que los genes VvFLC2 y VvAGL15.1 podrían participar, junto con algunos miembros de la familia SPL-L, en la regulación de la dormición. De un modo similar, los patrones de expresión de los genes VvFLC1, VvFUL, VvSOC1.1 (junto con VvFT, VvMFT1 y VFL) podría indicar que desempeñan un papel en la regulación de la inducción de la floración en la vid, como se ha observado en otros sistemas vegetales. Los niveles de expresión de VFL, el homólogo en vid del gen LEAFY de A. thaliana podrían ser cruciales para la especificación del desarrollo de meristemos de inflorescencia y flor en lugar de meristemos de zarcillo. Los genes VvAP3.1 y 2, VvPI, VvAG1 y 3, VvSEP1-4, así como VvBS1 y 2 parecen estar asociados con los eventos de diferenciación de meristemos y órganos florales, mientras que VvAP1 y VvFUL-L (junto con VvSOC1.1 y VvAGL6.2) podrían estar implicados en el desarrollo del zarcillo dados sus patrones de expresión. Adicionalmente, se analizó la función biológica de los genes VvAP1 y VvTFL1A por medio de una estrategia de silenciamiento génico. Los datos preliminares sugieren un posible papel para ambos genes en la iniciación y diferenciación de los zarcillos. Finalmente, el análisis genómico de la familia MADS en vid evidenció diferencias con respecto a otras especies vegetales en cuanto a número de miembros y patrón de expresión en genes supuestamente implicados en la inducción de la floración, en comparación con aquellos relacionados con la especificación de identidad de órganos florales y desarrollo del fruto. En conjunto, los resultados obtenidos han permitido identificar posibles rutas y genes candidatos a participar en la regulación de los procesos de desarrollo reproductivo de la vid, sentando las bases de futuros experimentos encaminados a conocer la funciones biológicas de genes específicos.

Comportamiento a fatiga por cortante de elementos lineales de hormigón armado sin cercos

Las estructuras de hormigón son susceptibles de sufrir los efectos asociados a las acciones de fatiga cuando estas se ven sometidas a un elevado número de cargas repetidas. Muchas de estas estructuras no requieren armadura transversal para cumplir los condicionantes de dimensionamiento estático como por ejemplo las losas superiores de tableros de puentes, los muros de contención, las losas de transición de puentes, las torres eólicas o las estructuras marítimas. La mayor parte de los códigos de diseño vigentes no incluyen una comprobación específica del nivel de seguridad a cortante de estas estructuras para acciones de fatiga, y aquellas que lo hacen prefieren utilizar expresiones de tipo empírico basadas en curvas S-N que relacionan el número de ciclos resistentes con el valor de la carga aplicada. A pesar de que el empleo de curvas S-N es de gran utilidad desde un punto de vista práctico, estas curvas no permiten comprender el proceso de rotura por cortante para cargas repetidas. El objetivo principal de esta Tesis es el de estudiar el comportamiento a cortante de elementos de hormigón armado sin cercos sometidos a fatiga. Además, el análisis es ampliado al estudio del comportamiento transversal de los voladizos de las losas superiores de tableros de puentes de hormigón que de forma habitual son diseñados sin armadura de cortante. De forma habitual estos elementos se diseñan atendiendo a criterios de dimensionamiento estáticos sin tener en cuenta la resistencia a cortante cuando se ven sometidos a cargas cíclicas. A pesar de que las cargas de fatiga son inferiores a aquellas que producen el fallo estático, es importante tener en cuenta el comportamiento de estos elementos ante cargas repetidas. Los trabajos experimentales existentes en vigas de hormigón armado sin cercos evidenciaron diferencias significativas entre los modos de fallo ante cargas estáticas y cíclicas. Estos trabajos llegaron a la conclusión de que estos elementos diseñados para tener un fallo dúctil por flexión pueden llegar a desarrollar un tipo de fallo frágil por cortante cuando se ven sometidos a cargas repetidas. El proceso de rotura por cortante en elementos de hormigón armado sin cercos sometidos a fatiga es un proceso complejo que debe ser estudiado en profundidad debido al carácter frágil de este tipo de fallo. Los trabajos experimentales permitieron comprobar que el origen de este fallo tiene lugar tras la formación de una fisura de cortante a partir de una fisura de flexión formada durante los primeros ciclos en el vano de cortante. Tras la formación de esta fisura, esta se va propagando hacia la cabeza de compresión hasta que finalmente se produce el fallo como consecuencia de la destrucción de la cabeza de compresión cuando la altura alcanzada por esta es insuficiente para resistir la fuerza de compresión aplicada en esta zona. Por otra parte, la propagación de esta fisura diagonal puede desarrollarse por completo en el instante en el que esta se forma derivando en un tipo de fallo por cortante más frágil que el anterior. El proceso de fatiga es estudiado en esta Tesis mediante un modelo mecánico. Por una parte, se propone un modelo predictivo para determinar el número de ciclos acumulados hasta que se forma la fisura diagonal en función del estado tensional que se tiene en la punta de una fisura crítica de flexión formada en los primeros ciclos. Por otra parte, la resistencia a fatiga tras la formación de la fisura diagonal se analiza teniendo en cuenta el daño por fatiga acumulado en la cabeza de compresión y las variables que afectan a la propagación de esta fisura de cortante. Para la evaluación de la resistencia a fatiga tras la formación de la fisura crítica de cortante en este tipo de elementos, se plantea un modelo teórico basado en conceptos de Mecánica de la Fractura adaptados al hormigón. Este modelo puede ser aplicado a vigas de hormigón armado sin cercos de canto constante o variable siguiendo diferentes procedimientos. Una campaña experimental ha sido llevada a cabo con el objetivo de estudiar el comportamiento a cortante de vigas de hormigón armado sin cercos de canto variable sometidas a cargas estáticas y de fatiga. Se han desarrollado un total de diez ensayos estáticos y de fatiga para diferentes niveles de carga y esbelteces de cortante, teniendo lugar diferentes modos de fallo. Estos elementos fueron diseñados para reproducir, a escala real y de forma simplificada, los voladizos laterales de las losas superiores de tableros de puentes de carretera de hormigón. Los resultados experimentales demostraron que el tipo de fallo desarrollado depende de varios parámetros como por ejemplo el nivel de carga máxima, el nivel de oscilación de tensiones en la armadura longitudinal, la esbeltez de cortante o la calidad del hormigón utilizado entre otros. Para valores similares de esbeltez de cortante, los ensayos de fatiga realizados permitieron comprobar que la rotura por cortante de estos elementos está asociada a niveles de carga máxima elevados, mientras que el fallo por fatiga de la armadura longitudinal tiene mayor probabilidad de ocurrir en elementos sometidos a elevados niveles de oscilación de tensiones en esta armadura. Además, estos ensayos han sido analizados a través del modelo propuesto para tratar de comprender el comportamiento resistente de estos elementos sometidos a cargas de fatiga. Concrete structures are able to suffer fatigue when they are subjected to high number of cyclic loads. Many of these need not shear reinforcement to satisfy static design requirements, such as bridge deck slabs, retaining walls, bridge approach slabs, wind towers or maritime structures among others. Many codes of practice do not include a verification of the shear fatigue safety. Moreover, those which include it still prefer empirical S-N-based approaches that provide the number of cycles as a function of applied forces. S-N models are practical but they do not provide information to understand the shear fatigue process. The main objective of this Thesis is to study shear behaviour of reinforced concrete elements without stirrups subjected to fatigue loads. In addition, the analysis is extended in order to study the transverse behaviour of cantilever slabs of concrete bridges that traditionally are designed without shear reinforcement. These elements usually are designed on the basis of static strength and it is unusual that codes consider fatigue strength of concrete in shear. Accordingly, it is important to take into account the fatigue behaviour of structural members subjected to cyclic loads although these loads are lower than those which produce the static failure. Existing experimental works show important differences between the static and cyclic failure modes of reinforced concrete beams without stirrups. These works concluded that beams without transverse reinforcement, designed to have a ductile failure mode in flexure, can submit a brittle shear failure mode when they are subjected to repeated loads. Shear fatigue failure of reinforced concrete beams without stirrups is a rather complex process from the mechanical viewpoint. Since it leads to a brittle failure mode it should be better understood. Experimental evidence indicates that a diagonal crack first develops from the inclination of flexural cracks in the shear span. Thereafter, the diagonal crack propagates into the compression zone. Failure normally takes place by the destruction of the compression zone when its depth is too small to resist the applied force. The propagation of the diagonal crack can also be instantaneous, leading to sudden diagonal cracking fatigue failure rather than shear-compression failure. Fatigue process is studied in this Thesis on a mechanical basis. On the one hand, a predictive model is derived to obtain the number of cycles up to diagonal cracking, as a function of the stress state at the tip of a critical flexural crack. On the other hand, the residual fatigue strength after diagonal cracking is analyzed taking into account the fatigue damage accumulated by the compression zone and the variables affecting the propagation of the diagonal crack. In order to assess the residual fatigue strength after diagonal cracking of such elements, a theoretical model is proposed based on concepts from fracture mechanics adapted to concrete. This model can be successfully applied for straight or haunched reinforced concrete beams without stirrups following different procedures. In order to achieve a more advanced knowledge in this subject, an experimental campaign has been carried out with the aim of study the shear behaviour of reinforced concrete haunched beams without stirrups subjected to static and fatigue loads. A total of ten static and fatigue tests have been performed with distinct load levels and shear span-to-depth ratios, presenting different failures modes. These elements were designed to reproduce in a simplified form the cantilever slab of concrete bridges at real scale. Experimental results showed that the type of failure depends on several parameters as for example the maximum load level, the stress oscillation level on the longitudinal reinforcement, the shear span-to-depth ratio or the quality of the concrete used among others. For a similar value of the shear span-to-depth ratio, tests evidenced that shear fatigue failure is related to high maximum load levels, while steel fatigue failure is easier to occur in elements subjected to high stress oscillation level on the reinforcement bars. Besides, these tests have been analyzed through the proposed model in order to clarify the structural behaviour of such elements subjected to fatigue loads.