Rapid microbiological detection method based on ultrasonic instrumentation

Los métodos de detección rápida de microorganismos se están convirtiendo en una herramienta esencial para el control de calidad en el área de la biotecnología, como es el caso de las industrias de alimentos y productos farmacéuticos y bioquímicos. En este escenario, el objetivo de esta tesis doctoral es desarrollar una técnica de inspección rápida de microoganismos basada en ultrasonidos. La hipótesis propuesta es que la combinación de un dispositivo ultrasónico de medida y un medio líquido diseñado específicamente para producir y atrapar burbujas, pueden constituir la base de un método sensible y rápido de detección de contaminaciones microbianas. La técnica presentada es efectiva para bacterias catalasa-positivas y se basa en la hidrólisis del peróxido de hidrógeno inducida por la catalasa. El resultado de esta reacción es un medio con una creciente concentración de burbujas. Tal medio ha sido estudiado y modelado desde el punto de vista de la propagación ultrasónica. Las propiedades deducidas a partir del análisis cinemático de la enzima se han utilizado para evaluar el método como técnica de inspección microbiana. En esta tesis, se han investigado aspectos teóricos y experimentales de la hidrólisis del peróxido de hidrógeno. Ello ha permitido describir cuantitativamente y comprender el fenómeno de la detección de microorganismos catalasa-positivos mediante la medida de parámetros ultrasónicos. Más concretamente, los experimentos realizados muestran cómo el oxígeno que aparece en forma de burbujas queda atrapado mediante el uso de un gel sobre base de agar. Este gel fue diseñado y preparado especialmente para esta aplicación. A lo largo del proceso de hidrólisis del peróxido de hidrógeno, se midió la atenuación de la onda y el “backscattering” producidos por las burbujas, utilizando una técnica de pulso-eco. Ha sido posible detectar una actividad de la catalasa de hasta 0.001 unidades/ml. Por otra parte, este estudio muestra que por medio del método propuesto, se puede lograr una detección microbiana para concentraciones de 105 células/ml en un periodo de tiempo corto, del orden de unos pocos minutos. Estos resultados suponen una mejora significativa de tres órdenes de magnitud en comparación con otros métodos de detección por ultrasonidos. Además, la sensibilidad es competitiva con modernos y rápidos métodos microbiológicos como la detección de ATP por bioluminiscencia. Pero sobre todo, este trabajo muestra una metodología para el desarrollo de nuevas técnicas de detección rápida de bacterias basadas en ultrasonidos. ABSTRACT In an industrial scenario where rapid microbiological methods are becoming essential tools for quality control in the biotechnological area such as food, pharmaceutical and biochemical; the objective of the work presented in this doctoral thesis is to develop a rapid microorganism inspection technique based on ultrasounds. It is proposed that the combination of an ultrasonic measuring device with a specially designed liquid medium, able to produce and trap bubbles could constitute the basis of a sensitive and rapid detection method for microbial contaminations. The proposed technique is effective on catalase positive microorganisms. Well-known catalase induced hydrogen peroxide hydrolysis is the fundamental of the developed method. The physical consequence of the catalase induced hydrogen peroxide hydrolysis is an increasingly bubbly liquid medium. Such medium has been studied and modeled from the point of view of ultrasonic propagation. Properties deduced from enzyme kinematics analysis have been extrapolated to investigate the method as a microbial inspection technique. In this thesis, theoretical and experimental aspects of the hydrogen peroxide hydrolysis were analyzed in order to quantitatively describe and understand the catalase positive microorganism detection by means of ultrasonic measurements. More concretely, experiments performed show how the produced oxygen in form of bubbles is trapped using the new gel medium based on agar, which was specially designed for this application. Ultrasonic attenuation and backscattering is measured in this medium using a pulse-echo technique along the hydrogen peroxide hydrolysis process. Catalase enzymatic activity was detected down to 0.001 units/ml. Moreover, this study shows that by means of the proposed method, microbial detection can be achieved down to 105 cells/ml in a short time period of the order of few minutes. These results suppose a significant improvement of three orders of magnitude compared to other ultrasonic detection methods for microorganisms. In addition, the sensitivity reached is competitive with modern rapid microbiological methods such as ATP detection by bioluminescence. But above all, this work points out a way to proceed for developing new rapid microbial detection techniques based on ultrasound.

Isolation of recombinant antibody fragments (scFv) by phage display technology for detection of almond allergens in food products

Tree nut allergies are considered an important health issue in developed countries. To comply with the regulations on food labeling, reliable allergen detection methods are required. In this work we isolated almond-specific recombinant antibody fragments (scFv) from a commercial phage display library bypassing the use of live animals, hence being consistent with the latest policies on animal welfare. To this end an iterative selection procedure employing the Tomlinson I phage display library and a crude almond protein extract was carried out. Two different almond-specific scFv (named PD1F6 and PD2C9) were isolated after two rounds of biopanning, and an indirect phage ELISA was implemented to detect the presence of almond protein in foodstuffs. The isolated scFvs demonstrated to be highly specific and allowed detection of 40 ng mL?1 and 100 ng mL?1 of raw and roasted almond protein, respectively. The practical detection limit of the assay in almond spiked food products was 0.1 mg g?1 (110e120 ppm). The developed indirect phage ELISA was validated by analysis of 92 commercial food products, showing good correlation with the results obtained by a previously developed real-time PCR method for the detection of almond in foodstuffs. The selected phage clones can be affinity maturated to improve their sensitivity and genetically engineered to be employed in different assay formats.

The Risk of Using the Q Heterogeneity Estimator for Software Engineering Experiments

All meta-analyses should include a heterogeneity analysis. Even so, it is not easy to decide whether a set of studies are homogeneous or heterogeneous because of the low statistical power of the statistics used (usually the Q test). Objective: Determine a set of rules enabling SE researchers to find out, based on the characteristics of the experiments to be aggregated, whether or not it is feasible to accurately detect heterogeneity. Method: Evaluate the statistical power of heterogeneity detection methods using a Monte Carlo simulation process. Results: The Q test is not powerful when the meta-analysis contains up to a total of about 200 experimental subjects and the effect size difference is less than 1. Conclusions: The Q test cannot be used as a decision-making criterion for meta-analysis in small sample settings like SE. Random effects models should be used instead of fixed effects models. Caution should be exercised when applying Q test-mediated decomposition into subgroups.

Detecting Good Practices and Pitfalls when Publishing Vocabularies on the Web

The uptake of Linked Data (LD) has promoted the proliferation of datasets and their associated ontologies bringing their semantic to the data being published. These ontologies should be evaluated at different stages, both during their development and their publication. As important as correctly modelling the intended part of the world to be captured in an ontology, is publishing, sharing and facilitating the (re)use of the obtained model. In this paper, 11 evaluation characteristics, with respect to publish, share and facilitate the reuse, are proposed. In particular, 6 good practices and 5 pitfalls are presented, together with their associated detection methods. In addition, a grid-based rating system is generated. Both contributions, the set of evaluation characteristics and the grid system, could be useful for ontologists in order to reuse existing LD vocabularies or to check the one being built.

Codificador de voz MIDI

El presente proyecto tiene el objetivo de facilitar la composición de canciones mediante la creación de las distintas pistas MIDI que la forman. Se implementan dos controladores. El primero, con objeto de transcribir la parte melódica, convierte la voz cantada o tarareada a eventos MIDI. Para ello, y tras el estudio de las distintas técnicas del cálculo del tono (pitch), se implementará una técnica con ciertas variaciones basada en la autocorrelación. También se profundiza en el segmentado de eventos, en particular, una técnica basada en el análisis de la derivada de la envolvente. El segundo, dedicado a la base rítmica de la canción, permite la creación de la percusión mediante el golpe rítmico de objetos que disponga el usuario, que serán asignados a los distintos elementos de percusión elegidos. Los resultados de la grabación de estos impactos serán señales de corta duración, no lineales y no armónicas, dificultando su discriminación. La herramienta elegida para la clasificación de los distintos patrones serán las redes neuronales artificiales (RNA). Se realizara un estudio de la metodología de diseño de redes neuronales especifico para este tipo de señales, evaluando la importancia de las variables de diseño como son el número de capas ocultas y neuronas en cada una de ellas, algoritmo de entrenamiento y funciones de activación. El estudio concluirá con la implementación de dos redes de diferente naturaleza. Una red de Elman, cuyas propiedades de memoria permiten la clasificación de patrones temporales, procesará las cualidades temporales analizando el ataque de su forma de onda. Una red de propagación hacia adelante feed-forward, que necesitará de robustas características espectrales y temporales para su clasificación. Se proponen 26 descriptores como los derivados de los momentos del espectro: centroide, curtosis y simetría, los coeficientes cepstrales de la escala de Mel (MFCCs), y algunos temporales como son la tasa de cruces por cero y el centroide de la envolvente temporal. Las capacidades de discriminación inter e intra clase de estas características serán evaluadas mediante un algoritmo de selección, habiéndose elegido RELIEF, un método basado en el algoritmo de los k vecinos mas próximos (KNN). Ambos controladores tendrán función de trabajar en tiempo real y offline, permitiendo tanto la composición de canciones, como su utilización como un instrumento más junto con mas músicos. ABSTRACT. The aim of this project is to make song composition easier by creating each MIDI track that builds it. Two controllers are implemented. In order to transcribe the melody, the first controler converts singing voice or humming into MIDI files. To do this a technique based on autocorrelation is implemented after having studied different pitch detection methods. Event segmentation has also been dealt with, to be more precise a technique based on the analysis of the signal's envelope and it's derivative have been used. The second one, can be used to make the song's rhythm . It allows the user, to create percussive patterns by hitting different objects of his environment. These recordings results in short duration, non-linear and non-harmonic signals. Which makes the classification process more complicated in the traditional way. The tools to used are the artificial neural networks (ANN). We will study the neural network design to deal with this kind of signals. The goal is to get a design methodology, paying attention to the variables involved, as the number of hidden layers and neurons in each, transfer functions and training algorithm. The study will end implementing two neural networks with different nature. Elman network, which has memory properties, is capable to recognize sequences of data and analyse the impact's waveform, precisely, the attack portion. A feed-forward network, needs strong spectral and temporal features extracted from the hit. Some descriptors are proposed as the derivates from the spectrum moment as centroid, kurtosis and skewness, the Mel-frequency cepstral coefficients, and some temporal features as the zero crossing rate (zcr) and the temporal envelope's centroid. Intra and inter class discrimination abilities of those descriptors will be weighted using the selection algorithm RELIEF, a Knn (K-nearest neighbor) based algorithm. Both MIDI controllers can be used to compose, or play with other musicians as it works on real-time and offline.

Detección de patrones y anomalías espectrales del terreno mediante espectrometría de imagen de alta resolución : reconocimiento, optimización y evaluación multiescenario

El objeto de esta Tesis doctoral es el desarrollo de una metodologia para la deteccion automatica de anomalias a partir de datos hiperespectrales o espectrometria de imagen, y su cartografiado bajo diferentes condiciones tipologicas de superficie y terreno. La tecnologia hiperespectral o espectrometria de imagen ofrece la posibilidad potencial de caracterizar con precision el estado de los materiales que conforman las diversas superficies en base a su respuesta espectral. Este estado suele ser variable, mientras que las observaciones se producen en un numero limitado y para determinadas condiciones de iluminacion. Al aumentar el numero de bandas espectrales aumenta tambien el numero de muestras necesarias para definir espectralmente las clases en lo que se conoce como Maldicion de la Dimensionalidad o Efecto Hughes (Bellman, 1957), muestras habitualmente no disponibles y costosas de obtener, no hay mas que pensar en lo que ello implica en la Exploracion Planetaria. Bajo la definicion de anomalia en su sentido espectral como la respuesta significativamente diferente de un pixel de imagen respecto de su entorno, el objeto central abordado en la Tesis estriba primero en como reducir la dimensionalidad de la informacion en los datos hiperespectrales, discriminando la mas significativa para la deteccion de respuestas anomalas, y segundo, en establecer la relacion entre anomalias espectrales detectadas y lo que hemos denominado anomalias informacionales, es decir, anomalias que aportan algun tipo de informacion real de las superficies o materiales que las producen. En la deteccion de respuestas anomalas se asume un no conocimiento previo de los objetivos, de tal manera que los pixeles se separan automaticamente en funcion de su informacion espectral significativamente diferenciada respecto de un fondo que se estima, bien de manera global para toda la escena, bien localmente por segmentacion de la imagen. La metodologia desarrollada se ha centrado en la implicacion de la definicion estadistica del fondo espectral, proponiendo un nuevo enfoque que permite discriminar anomalias respecto fondos segmentados en diferentes grupos de longitudes de onda del espectro, explotando la potencialidad de separacion entre el espectro electromagnetico reflectivo y emisivo. Se ha estudiado la eficiencia de los principales algoritmos de deteccion de anomalias, contrastando los resultados del algoritmo RX (Reed and Xiaoli, 1990) adoptado como estandar por la comunidad cientifica, con el metodo UTD (Uniform Targets Detector), su variante RXD-UTD, metodos basados en subespacios SSRX (Subspace RX) y metodo basados en proyecciones de subespacios de imagen, como OSPRX (Orthogonal Subspace Projection RX) y PP (Projection Pursuit). Se ha desarrollado un nuevo metodo, evaluado y contrastado por los anteriores, que supone una variacion de PP y describe el fondo espectral mediante el analisis discriminante de bandas del espectro electromagnetico, separando las anomalias con el algortimo denominado Detector de Anomalias de Fondo Termico o DAFT aplicable a sensores que registran datos en el espectro emisivo. Se han evaluado los diferentes metodos de deteccion de anomalias en rangos del espectro electromagnetico del visible e infrarrojo cercano (Visible and Near Infrared-VNIR), infrarrojo de onda corta (Short Wavelenght Infrared-SWIR), infrarrojo medio (Meadle Infrared-MIR) e infrarrojo termico (Thermal Infrared-TIR). La respuesta de las superficies en las distintas longitudes de onda del espectro electromagnetico junto con su entorno, influyen en el tipo y frecuencia de las anomalias espectrales que puedan provocar. Es por ello que se han utilizado en la investigacion cubos de datos hiperepectrales procedentes de los sensores aeroportados cuya estrategia y diseno en la construccion espectrometrica de la imagen difiere. Se han evaluado conjuntos de datos de test de los sensores AHS (Airborne Hyperspectral System), HyMAP Imaging Spectrometer, CASI (Compact Airborne Spectrographic Imager), AVIRIS (Airborne Visible Infrared Imaging Spectrometer), HYDICE (Hyperspectral Digital Imagery Collection Experiment) y MASTER (MODIS/ASTER Simulator). Se han disenado experimentos sobre ambitos naturales, urbanos y semiurbanos de diferente complejidad. Se ha evaluado el comportamiento de los diferentes detectores de anomalias a traves de 23 tests correspondientes a 15 areas de estudio agrupados en 6 espacios o escenarios: Urbano - E1, Semiurbano/Industrial/Periferia Urbana - E2, Forestal - E3, Agricola - E4, Geologico/Volcanico - E5 y Otros Espacios Agua, Nubes y Sombras - E6. El tipo de sensores evaluados se caracteriza por registrar imagenes en un amplio rango de bandas, estrechas y contiguas, del espectro electromagnetico. La Tesis se ha centrado en el desarrollo de tecnicas que permiten separar y extraer automaticamente pixeles o grupos de pixeles cuya firma espectral difiere de manera discriminante de las que tiene alrededor, adoptando para ello como espacio muestral parte o el conjunto de las bandas espectrales en las que ha registrado radiancia el sensor hiperespectral. Un factor a tener en cuenta en la investigacion ha sido el propio instrumento de medida, es decir, la caracterizacion de los distintos subsistemas, sensores imagen y auxiliares, que intervienen en el proceso. Para poder emplear cuantitativamente los datos medidos ha sido necesario definir las relaciones espaciales y espectrales del sensor con la superficie observada y las potenciales anomalias y patrones objetivos de deteccion. Se ha analizado la repercusion que en la deteccion de anomalias tiene el tipo de sensor, tanto en su configuracion espectral como en las estrategias de diseno a la hora de registrar la radiacion prodecente de las superficies, siendo los dos tipos principales de sensores estudiados los barredores o escaneres de espejo giratorio (whiskbroom) y los barredores o escaneres de empuje (pushbroom). Se han definido distintos escenarios en la investigacion, lo que ha permitido abarcar una amplia variabilidad de entornos geomorfologicos y de tipos de coberturas, en ambientes mediterraneos, de latitudes medias y tropicales. En resumen, esta Tesis presenta una tecnica de deteccion de anomalias para datos hiperespectrales denominada DAFT en su variante de PP, basada en una reduccion de la dimensionalidad proyectando el fondo en un rango de longitudes de onda del espectro termico distinto de la proyeccion de las anomalias u objetivos sin firma espectral conocida. La metodologia propuesta ha sido probada con imagenes hiperespectrales reales de diferentes sensores y en diferentes escenarios o espacios, por lo tanto de diferente fondo espectral tambien, donde los resultados muestran los beneficios de la aproximacion en la deteccion de una gran variedad de objetos cuyas firmas espectrales tienen suficiente desviacion respecto del fondo. La tecnica resulta ser automatica en el sentido de que no hay necesidad de ajuste de parametros, dando resultados significativos en todos los casos. Incluso los objetos de tamano subpixel, que no pueden distinguirse a simple vista por el ojo humano en la imagen original, pueden ser detectados como anomalias. Ademas, se realiza una comparacion entre el enfoque propuesto, la popular tecnica RX y otros detectores tanto en su modalidad global como local. El metodo propuesto supera a los demas en determinados escenarios, demostrando su capacidad para reducir la proporcion de falsas alarmas. Los resultados del algoritmo automatico DAFT desarrollado, han demostrado la mejora en la definicion cualitativa de las anomalias espectrales que identifican a entidades diferentes en o bajo superficie, reemplazando para ello el modelo clasico de distribucion normal con un metodo robusto que contempla distintas alternativas desde el momento mismo de la adquisicion del dato hiperespectral. Para su consecucion ha sido necesario analizar la relacion entre parametros biofisicos, como la reflectancia y la emisividad de los materiales, y la distribucion espacial de entidades detectadas respecto de su entorno. Por ultimo, el algoritmo DAFT ha sido elegido como el mas adecuado para sensores que adquieren datos en el TIR, ya que presenta el mejor acuerdo con los datos de referencia, demostrando una gran eficacia computacional que facilita su implementacion en un sistema de cartografia que proyecte de forma automatica en un marco geografico de referencia las anomalias detectadas, lo que confirma un significativo avance hacia un sistema en lo que se denomina cartografia en tiempo real. The aim of this Thesis is to develop a specific methodology in order to be applied in automatic detection anomalies processes using hyperspectral data also called hyperspectral scenes, and to improve the classification processes. Several scenarios, areas and their relationship with surfaces and objects have been tested. The spectral characteristics of reflectance parameter and emissivity in the pattern recognition of urban materials in several hyperspectral scenes have also been tested. Spectral ranges of the visible-near infrared (VNIR), shortwave infrared (SWIR) and thermal infrared (TIR) from hyperspectral data cubes of AHS (Airborne Hyperspectral System), HyMAP Imaging Spectrometer, CASI (Compact Airborne Spectrographic Imager), AVIRIS (Airborne Visible Infrared Imaging Spectrometer), HYDICE (Hyperspectral Digital Imagery Collection Experiment) and MASTER (MODIS/ASTER Simulator) have been used in this research. It is assumed that there is not prior knowledge of the targets in anomaly detection. Thus, the pixels are automatically separated according to their spectral information, significantly differentiated with respect to a background, either globally for the full scene, or locally by the image segmentation. Several experiments on different scenarios have been designed, analyzing the behavior of the standard RX anomaly detector and different methods based on subspace, image projection and segmentation-based anomaly detection methods. Results and their consequences in unsupervised classification processes are discussed. Detection of spectral anomalies aims at extracting automatically pixels that show significant responses in relation of their surroundings. This Thesis deals with the unsupervised technique of target detection, also called anomaly detection. Since this technique assumes no prior knowledge about the target or the statistical characteristics of the data, the only available option is to look for objects that are differentiated from the background. Several methods have been developed in the last decades, allowing a better understanding of the relationships between the image dimensionality and the optimization of search procedures as well as the subpixel differentiation of the spectral mixture and its implications in anomalous responses. In other sense, image spectrometry has proven to be efficient in the characterization of materials, based on statistical methods using a specific reflection and absorption bands. Spectral configurations in the VNIR, SWIR and TIR have been successfully used for mapping materials in different urban scenarios. There has been an increasing interest in the use of high resolution data (both spatial and spectral) to detect small objects and to discriminate surfaces in areas with urban complexity. This has come to be known as target detection which can be either supervised or unsupervised. In supervised target detection, algorithms lean on prior knowledge, such as the spectral signature. The detection process for matching signatures is not straightforward due to the complications of converting data airborne sensor with material spectra in the ground. This could be further complicated by the large number of possible objects of interest, as well as uncertainty as to the reflectance or emissivity of these objects and surfaces. An important objective in this research is to establish relationships that allow linking spectral anomalies with what can be called informational anomalies and, therefore, identify information related to anomalous responses in some places rather than simply spotting differences from the background. The development in recent years of new hyperspectral sensors and techniques, widen the possibilities for applications in remote sensing of the Earth. Remote sensing systems measure and record electromagnetic disturbances that the surveyed objects induce in their surroundings, by means of different sensors mounted on airborne or space platforms. Map updating is important for management and decisions making people, because of the fast changes that usually happen in natural, urban and semi urban areas. It is necessary to optimize the methodology for obtaining the best from remote sensing techniques from hyperspectral data. The first problem with hyperspectral data is to reduce the dimensionality, keeping the maximum amount of information. Hyperspectral sensors augment considerably the amount of information, this allows us to obtain a better precision on the separation of material but at the same time it is necessary to calculate a bigger number of parameters, and the precision lowers with the increase in the number of bands. This is known as the Hughes effects (Bellman, 1957) . Hyperspectral imagery allows us to discriminate between a huge number of different materials however some land and urban covers are made up with similar material and respond similarly which produces confusion in the classification. The training and the algorithm used for mapping are also important for the final result and some properties of thermal spectrum for detecting land cover will be studied. In summary, this Thesis presents a new technique for anomaly detection in hyperspectral data called DAFT, as a PP's variant, based on dimensionality reduction by projecting anomalies or targets with unknown spectral signature to the background, in a range thermal spectrum wavelengths. The proposed methodology has been tested with hyperspectral images from different imaging spectrometers corresponding to several places or scenarios, therefore with different spectral background. The results show the benefits of the approach to the detection of a variety of targets whose spectral signatures have sufficient deviation in relation to the background. DAFT is an automated technique in the sense that there is not necessary to adjust parameters, providing significant results in all cases. Subpixel anomalies which cannot be distinguished by the human eye, on the original image, however can be detected as outliers due to the projection of the VNIR end members with a very strong thermal contrast. Furthermore, a comparison between the proposed approach and the well-known RX detector is performed at both modes, global and local. The proposed method outperforms the existents in particular scenarios, demonstrating its performance to reduce the probability of false alarms. The results of the automatic algorithm DAFT have demonstrated improvement in the qualitative definition of the spectral anomalies by replacing the classical model by the normal distribution with a robust method. For their achievement has been necessary to analyze the relationship between biophysical parameters such as reflectance and emissivity, and the spatial distribution of detected entities with respect to their environment, as for example some buried or semi-buried materials, or building covers of asbestos, cellular polycarbonate-PVC or metal composites. Finally, the DAFT method has been chosen as the most suitable for anomaly detection using imaging spectrometers that acquire them in the thermal infrared spectrum, since it presents the best results in comparison with the reference data, demonstrating great computational efficiency that facilitates its implementation in a mapping system towards, what is called, Real-Time Mapping.

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.