Mejora de la eficacia de Penicillium oxalicum como agente de biocontrol en enfermedades de plantas hortícolas

Actualmente, la reducción de materias activas (UE) y la implantación de la nueva Directiva comunitaria 2009/128/ que establece el marco de actuación para conseguir un uso sostenible de los plaguicidas químicos y la preferencia de uso de métodos biológicos, físicos y otros no químicos, obliga a buscar métodos de control menos perjudiciales para el medio ambiente. El control biológico (CB) de enfermedades vegetales empleando agentes de control biológico (ACB) se percibe como una alternativa más segura y con menor impacto ambiental, bien solos o bien como parte de una estrategia de control integrado. El aislado 212 de Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) fue aislado originalmente de la micoflora del suelo en España y ha demostrado ser un eficaz ACB frente a la marchitez vascular del tomate. Una vez identificado y caracterizado el ACB se inició el periodo de desarrollo del mismo poniendo a punto un método de producción en masa de sus conidias. Tras lo cual se inició el proceso de formulación del ACB deshidratando las conidias para su preservación durante un período de tiempo mayor mediante lecho fluido. Finalmente, se han desarrollado algunos formulados que contienen de forma individual diferentes aditivos que han alargado su viabilidad, estabilidad y facilitado su manejo y aplicación. Sin embargo, es necesario seguir trabajando en la mejora de su eficacia de biocontrol. El primer objetivo de esta Tesis se ha centrado en el estudio de la interacción ACB-patógeno-huésped que permita la actuación de P.oxalicum en diferentes patosistemas. Uno de los primeros puntos que se abordan dentro de este objetivo es el desarrollo de nuevas FORMULACIONES del ACB que incrementen su eficacia frente a la marchitez vascular del tomate. Las conidias formuladas de PO212 se obtuvieron por la adición conjunta de distintos aditivos (mojantes, adherentes o estabilizantes) en dos momentos diferentes del proceso de producción/secado: i) antes del proceso de producción (en la bolsa de fermentación) en el momento de la inoculación de las bolsas de fermentación con conidias de PO212 o ii) antes del secado en el momento de la resuspensión de las conidias tras su centrifugación. De las 22 nuevas formulaciones desarrolladas y evaluadas en plantas de tomate en ensayos en invernadero, seis de ellas (FOR22, FOR25, FOR32, FOR35, FOR36 y FOR37) mejoran significativamente (P=0,05) el control de la marchitez vascular del tomate con respecto al obtenido con las conidias secas de P.oxalicum sin aditivos (CSPO) o con el fungicida Bavistin. Los formulados que mejoran la eficacia de las conidias secas sin aditivos son aquellos que contienen como humectantes alginato sódico en fermentación, seguido de aquellos que contienen glicerol como estabilizante en fermentación, y metil celulosa y leche desnatada como adherentes antes del secado. Además, el control de la marchitez vascular del tomate por parte de los formulados de P. oxalicum está relacionado con la fecha de inicio de la enfermedad. Otra forma de continuar mejorando la eficacia de biocontrol es mejorar la materia activa mediante la SELECCIÓN DE NUEVAS CEPAS de P. oxalicum, las cuales podrían tener diferentes niveles de eficacia. De entre las 28 nuevas cepas de P. oxalicum ensayadas en cámara de cultivo, sólo el aislado PO15 muestra el mismo nivel de eficacia que PO212 (62-67% de control) frente a la marchitez vascular del tomate en casos de alta presión de enfermedad. Mientras que, en casos de baja presión de enfermedad todas las cepas de P. oxalicum y sus mezclas demuestran ser eficaces. Finalmente, se estudia ampliar el rango de actuación de este ACB a OTROS HUÉSPEDES Y OTROS PATÓGENOS Y DIFERENTES GRADOS DE VIRULENCIA. En ensayos de eficacia de P. oxalicum frente a aislados de diferente agresividad de Verticillium spp. y Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en plantas de tomate en cámaras de cultivo, se demuestra que la eficacia de PO212 está negativamente correlacionada con el nivel de enfermedad causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici pero que no hay ningún efecto diferencial en la reducción de la incidencia ni de la gravedad según la virulencia de los aislados. Sin embargo, en los ensayos realizados con V. dahliae, PO212 causa una mayor reducción de la enfermedad en las plantas inoculadas con aislados de virulencia media. La eficacia de PO212 también era mayor frente a aislados de virulencia media alta de F. oxysporum f. sp. melonis y F. oxysporum f. sp. niveum, en plantas de melón y sandía, respectivamente. En ambos huéspedes se demuestra que la dosis óptima de aplicación del ACB es de 107 conidias de PO212 g-1 de suelo de semillero, aplicada 7 días antes del trasplante. Además, entre 2 y 4 nuevas aplicaciones de PO212 a la raíces de las plantas mediante un riego al terreno de asiento mejoran la eficacia de biocontrol. La eficacia de PO212 no se limita a hongos patógenos vasculares como los citados anteriormente, sino también a otros patógenos como: Phytophthora cactorum, Globodera pallida y G. rostochiensis. PO212 reduce significativamente los síntomas (50%) causados por P. cactorum en plantas de vivero de fresa, tras la aplicación del ACB por inmersión de las raíces antes de su trasplante al suelo de viveros comerciales. Por otra parte, la exposición de los quistes de Globodera pallida y G. rostochiensis (nematodos del quiste de la patata) a las conidias de P. oxalicum, en ensayos in vitro o en microcosmos de suelo, reduce significativamente la capacidad de eclosión de los huevos. Para G. pallida esta reducción es mayor cuando se emplean exudados de raíz de patata del cv. 'Monalisa', que exudados de raíz del cv. 'Desirée'. No hay una reducción significativa en la tasa de eclosión con exudados de raíz de tomate del cv. 'San Pedro'. Para G. rostochiensis la reducción en la tasa de eclosión de los huevos se obtiene con exudados de la raíz de patata del cv. 'Desirée'. El tratamiento con P. oxalicum reduce también significativamente el número de quistes de G. pallida en macetas. Con el fin de optimizar la aplicación práctica de P. oxalicum cepa 212 como tratamiento biológico del suelo, es esencial entender cómo el entorno físico influye en la capacidad de colonización, crecimiento y supervivencia del mismo, así como el posible riesgo que puede suponer su aplicación sobre el resto de los microorganismos del ecosistema. Por ello en este segundo objetivo de esta tesis se estudia la interacción del ACB con el medio ambiente en el cual se aplica. Dentro de este objetivo se evalúa la INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA, DISPONIBILIDAD DE AGUA Y PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS SUELOS (POROSIDAD, TEXTURA, DENSIDAD...) SOBRE LA SUPERVIVENCIA Y EL CRECIMIENTO DE PO212 en condiciones controladas elaborando modelos que permitan predecir el impacto de cada factor ambiental en la supervivencia y crecimiento de P. oxalicum y conocer su capacidad para crecer y sobrevivir en diferentes ambientes. En las muestras de suelo se cuantifica: i) la supervivencia de Penicillium spp. usando el recuento del número de unidades formadoras de colonias en un medio de cultivo semi-selectivo y ii) el crecimiento (biomasa) de PO212 mediante PCR en tiempo real. En los resultados obtenidos se demuestra que P. oxalicum crece y sobrevive mejor en condiciones de sequía independientemente de la temperatura y del tipo de suelo. Si comparamos tipos de suelo P. oxalicum crece y sobrevive en mayor medida en suelos areno-arcillosos con un bajo contenido en materia orgánica, un mayor pH y una menor disponibilidad de fósforo y nitrógeno. La supervivencia y el crecimiento de P. oxalicum se correlaciona de forma negativa con la disponibilidad de agua y de forma positiva con el contenido de materia orgánica. Sólo la supervivencia se correlaciona también positivamente con el pH. Por otro lado se realizan ensayos en suelos de huertos comerciales con diferentes propiedades físico-químicas y diferentes condiciones ambientales para ESTUDIAR EL ESTABLECIMIENTO, SUPERVIVENCIA Y DISPERSIÓN VERTICAL Y MOVILIDAD HORIZONTAL DE PO212. P. oxalicum 212 puede persistir y sobrevivir en esos suelos al menos un año después de su liberación pero a niveles similares a los de otras especies de Penicillium indígenas presentes en los mismos suelos naturales. Además, P. oxalicum 212 muestra una dispersión vertical y movilidad horizontal muy limitada en los diferentes tipos de suelo evaluados. La introducción de P. oxalicum en un ambiente natural no sólo implica su actuación sobre el microorganismo diana, el patógeno, si no también sobre otros microorganismos indígenas. Para EVALUAR EL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE P. oxalicum SOBRE LAS POBLACIONES FÚNGICAS INDIGENAS PRESENTES EN EL SUELO de dos huertos comerciales, se analizan mediante electroforesis en gradiente desnaturalizante de poliacrilamida (DGGE) muestras de dichos suelos a dos profundidades (5 y 10 cm) y a cuatro fechas desde la aplicación de P. oxalicum 212 (0, 75, 180 y 365 días). El análisis de la DGGE muestra que las diferencias entre las poblaciones fúngicas se deben significativamente a la fecha de muestreo y son independientes del tratamiento aplicado y de la profundidad a la que se tomen las muestras. Luego, la aplicación del ACB no afecta a la población fúngica de los dos suelos analizados. El análisis de las secuencias de la DGGE confirma los resultados anteriores y permiten identificar la presencia del ACB en los suelos. La presencia de P. oxalicum en el suelo se encuentra especialmente relacionada con factores ambientales como la humedad. Por tanto, podemos concluir que Penicillium oxalicum cepa 212 puede considerarse un óptimo Agente de Control Biológico (ACB), puesto que es ecológicamente competitivo, eficaz para combatir un amplio espectro de enfermedades y no supone un riesgo para el resto de microorganismos fúngicos no diana presentes en el lugar de aplicación. ABSTRACT Currently, reduction of active (EU) and the implementation of the new EU Directive 2009/128 which establishing the framework for action to achieve the sustainable use of chemical pesticides and preference of use of biological, physical and other non-chemical methods, forces to look for control methods less harmful to the environment. Biological control (CB) of plant diseases using biological control agents (BCA) is perceived as a safer alternative and with less environmental impact, either alone or as part of an integrated control strategy. The isolate 212 of Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) was originally isolated from the soil mycoflora in Spain. P. oxalicum is a promising biological control agent for Fusarium wilt and other tomato diseases. Once identified and characterized the BCA, was developed a mass production method of conidia by solid-state fermentation. After determined the process of obtaining a formulated product of the BCA by drying of product by fluid-bed drying, it enables the preservation of the inoculum over a long period of time. Finally, some formulations of dried P. oxalicum conidia have been developed which contain one different additive that have improved their viability, stability and facilitated its handling and application. However, further work is needed to improve biocontrol efficacy. The first objective of this thesis has focused on the study of the interaction BCA- pathogen-host, to allow P.oxalicum to work in different pathosystems. The first point to be addressed in this objective is the development of new FORMULATIONS of BCA which increase their effectiveness against vascular wilt of tomato. PO212 conidial formulations were obtained by the joint addition of various additives (wetting agents, adhesives or stabilizers) at two different points of the production-drying process: i) to substrate in the fermentation bags before the production process, and (ii) to conidial paste obtained after production but before drying. Of the 22 new formulations developed and evaluated in tomato plants in greenhouse tests, six of them (FOR22 , FOR25 , FOR32 , FOR35 , FOR36 and FOR3) improved significantly (P = 0.05) the biocontrol efficacy against tomato wilt with respect to that obtained with dried P.oxalicum conidia without additives (CSPO) or the fungicide Bavistin. The formulations that improve the efficiency of dried conidia without additives are those containing as humectants sodium alginate in the fermentation bags, followed by those containing glycerol as a stabilizer in the fermentation bags, and methylcellulose and skimmed milk as adherents before drying. Moreover, control of vascular wilt of tomatoes by PO212 conidial formulations is related to the date of disease onset. Another way to further improve the effectiveness of biocontrol is to improve the active substance by SELECTION OF NEW STRAINS of P. oxalicum, which may have different levels of effectiveness. Of the 28 new strains of P. oxalicum tested in a culture chamber, only PO15 isolate shows the same effectiveness that PO212 (62-67 % of control) against tomato vascular wilt in cases of high disease pressure. Whereas in cases of low disease pressure all strains of P. oxalicum and its mixtures effective. Finally, we study extend the range of action of this BCA TO OTHER GUESTS AND OTHER PATHOGENS AND DIFFERENT DEGREES OF VIRULENCE. In efficacy trials of P. oxalicum against isolates of different aggressiveness of Verticillium spp. and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in tomato plants in growth chambers, shows that the efficiency of PO212 is negatively correlated with the level of disease caused by F. oxysporum f. sp. lycopersici. There is not differential effect in reducing the incidence or severity depending on the virulence of isolates. However, PO212 cause a greater reduction of disease in plants inoculated with virulent isolates media of V. dahlia. PO212 efficacy was also higher against isolates of high and average virulence of F. oxysporum f. sp. melonis and F. oxysporum f. sp. niveum in melon and watermelon plants, respectively. In both hosts the optimum dose of the BCA application is 107 conidia PO212 g-1 soil, applied on seedlings 7 days before transplantation into the field. Moreover, the reapplication of PO212 (2-4 times) to the roots by irrigation into the field improve efficiency of biocontrol. The efficacy of PO212 is not limited to vascular pathogens as those mentioned above, but also other pathogens such as Oomycetes (Phytophthora cactorum) and nematodes (Globodera pallida and G. rostochiensis). PO212 significantly reduces symptoms (50 %) caused by P. cactorum in strawberry nursery plants after application of BCA by dipping the roots before transplanting to soil in commercial nurseries. Moreover, the exposure of G. pallida and G. rostochiensis cysts to the conidia of P. oxalicum, in in vitro assays or in soil microcosms significantly reduces hatchability of eggs. The reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was greatest when root diffusates from the `Monalisa´ potato cultivar were used, followed by root diffusates from the `Désirée´ potato cultivar. However, no significant reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was found when root diffusates from the ‘San Pedro” tomato cultivar were used. For G. rostochiensis reduction in the juveniles hatching is obtained from the root diffusates 'Desirée' potato cultivar. Treatment with P. oxalicum also significantly reduces the number of cysts of G. pallida in pots. In order to optimize the practical application of P. oxalicum strain 212 as a biological soil treatment, it is essential to understand how the physical environment influences the BCA colonization, survival and growth, and the possible risk that can cause its application on other microorganisms in the ecosystem of performance. Therefore, the second objective of this thesis is the interaction of the BCA with the environment in which it is applied. Within this objective is evaluated the INFLUENCE OF TEMPERATURE, WATER AVAILABILITY AND PHYSICAL-CHEMICAL PROPERTIES OF SOILS (POROSITY, TEXTURE, DENSITY...) ON SURVIVAL AND GROWTH OF PO212 under controlled conditions to develop models for predicting the environmental impact of each factor on survival and growth of P. oxalicum and to know their ability to grow and survive in different environments. Two parameters are evaluated in the soil samples: i) the survival of Penicillium spp. by counting the number of colony forming units in semi-selective medium and ii) growth (biomass) of PO212 by real-time PCR. P. oxalicum grows and survives better in drought conditions regardless of temperature and soil type. P. oxalicum grows and survives more in sandy loam soils with low organic matter content, higher pH and lower availability of phosphorus and nitrogen. Survival and growth of P. oxalicum negatively correlates with the availability of water and positively with the organic content. Only survival also correlated positively with pH. Moreover, trials are carried out into commercial orchards soils with different physic-chemical properties and different environmental conditions TO STUDY THE ESTABLISHMENT, SURVIVAL, VERTICAL DISPERSION AND HORIZONTAL SPREAD OF PO212. P. oxalicum 212 can persist and survive at very low levels in soil one year after its release. The size of the PO212 population after its release into the tested natural soils is similar to that of indigenous Penicillium spp. Furthermore, the vertical dispersion and horizontal spread of PO212 is limited in different soil types. The introduction of P. oxalicum in a natural environment not only involves their action on the target organism, the pathogen, but also on other indigenous microorganisms. TO ASSESS THE EFFECT OF P. oxalicum APPLICATION ON SOIL INDIGENOUS FUNGAL COMMUNITIES in two commercial orchards, soil samples are analyzed by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis polyacrylamide (DGGE). Samples are taken from soil at two depths (5 and 10 cm) and four dates from the application of P. oxalicum 212 (0, 75, 180 and 365 days). DGGE analysis shows that differences are observed between sampling dates and are independent of the treatment of P. oxalicum applied and the depth. BCA application does not affect the fungal population of the two soil analyzed. Sequence analysis of the DGGE bands confirms previous findings and to identify the presence of BCA on soils. The presence of P. oxalicum in soil is especially related to environmental factors such as humidity. Therefore, we conclude that the 212 of strain Penicillium oxalicum can be considered an optimum BCA, since it is environmentally competitive and effective against a broad spectrum of diseases and does not have any negative effect on soil non-target fungi communities.

Toxicity and sublethal effects of six insecticides to last instar larvae and adults of the biocontrol agents Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera: Chrysopidae) and Adalia bipunctata (L.) (Coleoptera: Coccinellidae)

To further develop Integrated Pest Management (IPM) strategies against crop pests, it is important to evaluate the effects of insecticides on biological control agents. Therefore, we tested the toxicity and sublethal effects (fecundity and fertility) of flonicamid, flubendiamide, metaflumizone, spirotetramat, sulfoxaflor and deltamethrin on the natural enemies Chrysoperla carnea and Adalia bipunctata. The side effects of the active ingredients of the insecticides were evaluated with residual contact tests for the larvae and adults of these predators in the laboratory. Flonicamid, flubendiamide, metaflumizone and spirotetramat were innocuous to last instar larvae and adults of C. carnea and A. bipunctata. Sulfoxaflor was slightly toxic to adults of C. carnea and was highly toxic to the L4 larvae of A. bipunctata. For A. bipunctata, sulfoxaflor and deltamethrin were the most damaging compounds with a cumulative larval mortality of 100%. Deltamethrin was also the most toxic compound to larvae and adults of C. carnea. In accordance with the results obtained, the compounds flonicamid, flubendiamide, metaflumizone and spirotetramat might be incorporated into IPM programs in combination with these natural enemies for the control of particular greenhouse pests. Nevertheless, the use of sulfoxaflor and deltamethrin in IPM strategies should be taken into consideration when releasing either of these biological control agents, due to the toxic behavior observed under laboratory conditions. The need for developing sustainable approaches to combine the use of these insecticides and natural enemies within an IPM framework is discussed.

Dispersal of aphids, whiteflies and their natural enemies under photoselective nets

Integrated Pest Management of insects includes several control tactics, such as the use of photoselective nets, which may reduce the flight activity of insects. Limiting the dispersal of pests such as aphids and whiteflies is important because of their major role as vectors of plant viruses, while a minor impact on natural enemies is desired. In this study, we examined for the first time the dispersal ability of three vector species, Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae), Macrosiphum euphorbiae (Thomas) (Hemiptera: Aphididae) and Myzus persicae (Sulzer) (Hemiptera: Aphididae), in cages covered with photoselective nets. Contrary to the results obtained with aphids, the ability of the whitefly B. tabaci, to reach the target plant was reduced by photoselective nets. In a second set of experiments, the impact of UV-absorbing nets on the visual cues of two important predator species, Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) and Amblyseius swirskii Athias-Henriot (Acari: Phytoseiidae), was evaluated. The anthocorid was caught in higher numbers in traps placed under regular nets, whereas the mites preferably chose environments in which the UV radiation was attenuated. We have observed a wide range of effects that impedes generalization, although photoselective nets have a positive effect on pest management of whiteflies and aphids under protected environments.

Compatibilidad de Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) y Nesidiocoris tenuis (Reuter)(Hemiptera: Miridae), depredadores importantes en cultivos hortícolas protegidos, con nuevas barreras físicas selectivas y modernos plaguicidas

La nueva legislación en materia fitosanitaria se dirige hacia una Gestión Integrada de Plagas (GIP). Estos programas dan preferencia a aquellos métodos más respetuosos y sostenibles con el medio ambiente, siendo piezas claves en ellos el control biológico, el físico y otros de carácter no químico. Sin embargo, el uso de insecticidas selectivos es a veces necesario para el adecuado manejo de plagas en cultivos hortícolas. Por ello, el objetivo general de este estudio es aportar conocimientos para mejorar el control de plagas en cultivos hortícolas, mediante la integración de tres estrategias de lucha: biológica, física y química. Una parte de este trabajo ha consistido en el estudio de los posibles efectos que mallas tratadas con insecticida (bifentrin) pudieran provocar mediante diferentes ensayos de laboratorio, invernadero y campo, en los enemigos naturales Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) (depredador de trips), Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) (depredador de mosca blanca y Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera: Gelechiidae)), y otros agentes de biocontrol comúnmente usados en cultivos hortícolas protegidos. Este tipo de mallas se han empleado con éxito en entomología médica para controlar mosquitos vectores de la malaria, y actualmente se está trabajando en su desarrollo para uso agrícola como método de exclusión, y método directo de control de plagas. En los ensayos realizados en laboratorio, O. laevigatus y N. tenuis no fueron capaces de detectar la presencia de bifentrin en el ensayo de preferencia. Además, no se produjo mortalidad a corto plazo (72 horas) en ambos chinches depredadores. Por el contrario, se registró una elevada mortalidad cuando se expusieron por contacto a la malla tratada durante 72 horas en cajas de dimensiones reducidas (10 cm de diámetro X 3 cm de altura). En ensayos llevados a cabo bajo condiciones más reales de exposición, en un invernadero experimental con jaulas de 25 X 25 X 60 cm de altura, no se produjo ningún efecto en la mortalidad a corto plazo (72 horas) o en los parámetros reproductivos de O. laevigatus y N. tenuis. Finalmente, en ensayos de campo realizados en túneles semi-comerciales (8 m de largo X 6,5 m de ancho X 2,6 m de altura), ni las condiciones ambientales [temperatura, humedad relativa, radiación ultravioleta (UV) y fotosintéticamente activa (PAR)], ni los enemigos naturales, se vieron afectados por la presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo. Sin embargo, los resultados no fueron concluyentes, debido al bajo establecimiento de los agentes de biocontrol liberados. Por lo tanto, más estudios son necesarios en invernaderos comerciales para confirmar los resultados preliminares de compatibilidad. Además, en este trabajo se han evaluado los efectos letales (mortalidad) y subletales (parámetros reproductivos) de seis modernos insecticidas sobre los chinches depredadores O. laevigatus y N. tenuis, mediante ensayos de laboratorio y persistencia. Los ensayos se realizaron por contacto residual, aplicando los insecticidas a la dosis máxima de campo sobre placas de cristal (laboratorio) o plantas (persistencia). Los productos fitosanitarios se seleccionaron por representar a un grupo de modernos plaguicidas con modos de acción en principio más selectivos para los enemigos naturales que antiguos plaguicidas como organoclorados, oroganofosforados o carbamatos, y por su uso frecuente en cultivos hortícolas donde O. laevigatus y N. tenuis están presentes. Todos ellos están incluidos o en proceso de inclusión en la lista comunitaria de sustancias activas para uso agrícola, Anexo I de la Directiva 91/414/CEE: abamectina y emamectina (avermectinas neurotóxicas, activadoras del canal del cloro), deltametrina (piretroide neurotóxico, modulador del canal del sodio, control positivo), flubendiamida (neurotóxico, modulador del receptor de rianodina), spinosad (naturalito neurotóxico, agonistas/antagonistas del receptor de nicotínico acetilcolina) y spiromesifen (inhibidor de la acetil CoA carboxilasa). El estudio mostró que O. laevigatus fue más susceptible a los insecticidas que N. tenuis. Además, los resultados revelaron que flubendiamida y spiromesifen fueron compatibles con los dos enemigos naturales estudiados, y por tanto se podrían usar en programas de GIP. Por el contrario, los insecticidas abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad no fueron selectivos para ninguno de los chinches depredadores. Sin embargo, los estudios de persistencia demostraron que a pesar de que estos insecticidas no proporcionaron selectividad fisiológica, pueden proporcionar selectividad ecológica en algunos casos. Abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad podrían ser compatibles con N. tenuis si el enemigo natural es introducido en el cultivo 4 días después de su aplicación. En el caso de O. laevigatus, abamectina, deltametrina y spinosad se clasificaron como persistentes, por lo tanto es necesario completar el estudio con experimentos de semi-campo y campo que determinen si es posible su uso conjunto en programas de GIP. Por otro lado, emamectina podría ser compatible con O. laevigatus si el enemigo natural es introducido en el cultivo 7 días después de su aplicación. Por último, se ha comprobado la selectividad de tres insecticidas aceleradores de la muda (MACs) (metoxifenocida, tebufenocida y RH-5849) sobre O. laevigatus y N. tenuis. Además de realizar estudios para evaluar la toxicidad en laboratorio de los insecticidas por contacto residual e ingestión (principal modo de acción de los MAC´s), se extrajo RNA de los insectos y con el cDNA obtenido se secuenció y clonó el dominio de unión al ligando (LBD) del receptor de ecdisona correspondiente a O. laevigatus (OlEcR-LBD) y N. tenuis (NtEcR-LBD). Posteriormente, se obtuvo la configuración en tres dimensiones del LBD y se estudió el acoplamiento de las moléculas de los tres insecticidas en la cavidad que forman las 12 α-hélices que constituyen el EcR-LBD. En el caso de N. tenuis se debe mencionar que no fue posible la obtención de la secuencia completa del LBD. Sin embargo, se obtuvo una secuencia parcial (hélice 6-hélice 11), que mostró una alta conservación de aminoácidos con respecto a la obtenida en O. laevigatus. Los ensayos de toxicidad mostraron que metoxifenocida, tebufenocida y RH-5849 no produjeron ningún efecto nocivo en ambos depredadores. Además, los estudios de modelado por homología y acoplamiento molecular llevados a cabo con O. laevigatus, también indicaron que los MACs no produjeron ningún efecto deletéreo en este enemigo natural. Por lo tanto, estos compuestos pueden ser aplicados de manera segura en programas de GIP en los cuales O. laevigatus y N. tenuis estén presentes. ABSTRACT The new pesticide legislation on pest control is aimed at integrated pest management (IPM). These programs are based on the most environmentally sustainable approaches, where biological, physical control and other non-chemical methods are the cornerstone. However, selective pesticides are often required for pest management on horticultural crops. Therefore, the main goal of this study is to provide knowledge to improve pest control on horticultural crops through the integration of three strategies: biological, physical and chemical. Firstly, the effects of insecticide treated nets (bifenthrin) were evaluated in different laboratory, greenhouse and field experiments on the natural enemies Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) (predator of thrips), Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) (predator of whiteflies and Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera: Gelechiidae)), and other biocontrol agents commonly used on protected horticultural crops. These types of nets have been successfully used in medical entomology to control mosquito malaria vectors, and work is currently being done on their use as exclusion barriers and as a direct method of pest control in agriculture. In experiments made under laboratory conditions, O. laevigatus and N. tenuis were not able to detect the presence of bifenthrin in a dual-choice test. Furthermore, no shortterm mortality (72 hours) was recorded on both predatory bugs. In contrast, a high mortality rate was found when they were exposed by contact to the bifenthrin-treated net for 72 hours in small cages (10 cm diameter X 3 cm high). In assays carried out under more realistic conditions of exposure, in an experimental greenhouse with cages of 25 X 25 X 60 cm high, short-term mortality (72 hours) and reproductive parameters were not affected. Lastly, in field experiments carried out in semi-commercial tunnels (8 m long X 6.5 m width X 2.6 m high), neither environmental conditions [temperature, relative humidity, ultraviolet (UV) and photosynthetically active radiation (PAR)] nor natural enemies were affected by the presence of the bifenthrin-treated net on the crop. However, results were not conclusive, mainly due to a low settlement of the released biocontrol agents, and further studies are needed in commercial greenhouses to confirm our preliminary results of compatibility. Secondly, the lethal (mortality) and sublethal effects (reproductive parameters) of six modern pesticides on the predatory bugs O. laevigatus and N. tenuis has been evaluated through laboratory and persistence experiments. Trials were carried out by residual contact, applying the insecticides to the maximum field recommended concentration on glass plates (laboratory) or plants (persistence). Insecticides were chosen as representatives of modern pesticides with a more selective mode of action on natural enemies than organochlorine, organophosphorus and carbamate insecticides. Moreover, they were also chosen because of their frequent use on horticultural crops where O. laevigatus and N. tenuis are present. All of them have been included or have been requested for inclusion in the community list of active substances on the agricultural market, Annex I of the European Directive 91/414/EEC: abamectin and emamectin (neurotoxic avermectins, chloride channel activators), deltamethrin (neutotoxic pyrethroid, sodium channel modulator, positive commercial standard), flubendiamide (neurotoxic, rianodine receptor modulator), spinosad (neurotoxic naturalyte, nicotinic acetylcholine receptor allosteric activator) and spiromesifen (inhibitors of acetyl CoA carboxylase). The study showed that O. laevigatus was more susceptible to all the studied pesticides than N. tenuis. In addition, the research results indicated no impact of flubendiamide and spiromesifen on the two natural enemies studied under laboratory conditions. Consequently, both pesticides are candidates to be included in IPM programmes where these biocontrol agents are present. On the other hand, abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad were not selective for both predatory bugs in laboratory experiments. However, persistence test demonstrated that in spite of the lack of physiological selectivity, these pesticides can provide ecological selectivity in some cases. Abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad could be compatible with N. tenuis if the mirid bug is released 4 days after the insecticide treatment on the crop. With regard to O. laevigatus, abamectin, deltamethrin and spinosad were classified as persistent in our assays, thus the study should be completed with semi-field and field experiments in order to ascertain their possible joint use in IPM programs. In contrast, emamectin could be compatible with O. laevigatus if the pirate bug is released 7 days after the insecticide treatment on the crop. Finally, the selectivity of three moulting accelerating compounds (MACs) (methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849) has also been evaluated on O. laevigatus and N. tenuis. In addition to laboratory experiments to evaluate the toxicity of the insecticides by residual contact and ingestion, molecular approaches were used as well. RNA of both insects was isolated, cDNA was subsequently synthesized and the complete sequence of the ligand binding domain (LBD) of the ecdysone receptor of O. laevigatus (OlEcR-LBD) and N. tenuis (NtEcR-LBD) were determined. Afterwards, the three dimensional structure of LBD was constructed. Finally, the docking of the insecticide molecules in the cavity delineated by the 12 α-helix that composed the EcRLBD was performed. In the case of N. tenuis, it should be noted that in spite of intensive efforts, we did not manage to complete the sequence for the LBD.However, a partial sequence of the LBD was obtained (helix 6-helix 11), and a strong conservation between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was observed. Results showed no biological activity of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849, on both predatory bugs. Moreover, modeling of the OlEcR-LBD and docking experiments also suggested that MACs were devoid of any deleterious effect on O. laevigatus. Therefore, our results indicate that these compounds could be safely applied in IPM programs in which O. laevigatus and N. tenuis are present.

Purification and Characterization of AsES Protein A Subtilisin Secreted by Acremonium Strictum is a Novel Plant Defense Elicitor.

In this work, the purification and characterization of an extracellular elicitor protein, designated AsES, produced by an avirulent isolate of the strawberry pathogen Acremonium strictum, are reported. The defense eliciting activity present in culture filtrates was recovered and purified by ultrafiltration (cutoff, 30 kDa), anionic exchange (Q-Sepharose, pH 7.5), and hydrophobic interaction (phenyl-Sepharose) chromatographies. Two-dimensional SDS-PAGE of the purified active fraction revealed a single spot of 34 kDa and pI 8.8. HPLC (C2/C18) and MS/MS analysis confirmed purification to homogeneity. Foliar spray with AsES provided a total systemic protection against anthracnose disease in strawberry, accompanied by the expression of defense-related genes (i.e. PR1 and Chi2-1). Accumulation of reactive oxygen species (e.g. H2O2 and O2̇̄) and callose was also observed in Arabidopsis. By using degenerate primers designed from the partial amino acid sequences and rapid amplification reactions of cDNA ends, the complete AsES-coding cDNA of 1167 nucleotides was obtained. The deduced amino acid sequence showed significant identity with fungal serine proteinases of the subtilisin family, indicating that AsES is synthesized as a larger precursor containing a 15-residue secretory signal peptide and a 90-residue peptidase inhibitor I9 domain in addition to the 283-residue mature protein. AsES exhibited proteolytic activity in vitro, and its resistance eliciting activity was eliminated when inhibited with PMSF, suggesting that its proteolytic activity is required to induce the defense response. This is, to our knowledge, the first report of a fungal subtilisin that shows eliciting activity in plants. This finding could contribute to develop disease biocontrol strategies in plants by activating its innate immunity.

Integration of physical, chemical and biological tactics against insect pests and virus diseases in horticultural crops

Actualmente, la gestión de sistemas de Manejo Integrado de Plagas (MIP) en cultivos hortícolas tiene por objetivo priorizar los métodos de control no químicos en detrimento del consumo de plaguicidas, según recoge la directiva europea 2009/128/CE ‘Uso Sostenible de Plaguicidas’ (OJEC, 2009). El uso de agentes de biocontrol como alternativa a la aplicación de insecticidas es un elemento clave de los sistemas MIP por sus innegables ventajas ambientales que se utiliza ampliamente en nuestro país (Jacas y Urbaneja, 2008). En la región de Almería, donde se concentra el 65% de cultivo en invernadero de nuestro país (47.367 ha), MIP es la principal estrategia en pimiento (MAGRAMA, 2014), y comienza a serlo en otros cultivos como tomate o pepino. El cultivo de pepino, con 8.902 ha (MAGRAMA, 2013), tiene un protocolo semejante al pimiento (Robledo et al., 2009), donde la única especie de pulgón importante es Aphis gossypii Glover. Sin embargo, pese al continuo incremento de la superficie de cultivo agrícola bajo sistemas MIP, los daños originados por virosis siguen siendo notables. Algunos de los insectos presentes en los cultivos de hortícolas son importantes vectores de virus, como los pulgones, las moscas blancas o los trips, cuyo control resulta problemático debido a su elevada capacidad para transmitir virus vegetales incluso a una baja densidad de plaga (Holt et al., 2008; Jacas y Urbaneja, 2008). Las relaciones que se establecen entre los distintos agentes de un ecosistema son complejas y muy específicas. Se ha comprobado que, pese a que los enemigos naturales reducen de manera beneficiosa los niveles de plaga, su incorporación en los sistemas planta-insecto-virus puede desencadenar complicadas interacciones con efectos no deseables (Dicke y van Loon, 2000; Jeger et al., 2011). Así, los agentes de biocontrol también pueden inducir a que los insectos vectores modifiquen su comportamiento como respuesta al ataque y, con ello, el grado de dispersión y los patrones de distribución de las virosis que transmiten (Bailey et al., 1995; Weber et al., 1996; Hodge y Powell, 2008a; Hodge et al., 2011). Además, en ocasiones el control biológico por sí solo no es suficiente para controlar determinadas plagas (Medina et al., 2008). Entre los métodos que se pueden aplicar bajo sistemas MIP están las barreras físicas que limitan la entrada de plagas al interior de los invernaderos o interfieren con su movimiento, como pueden ser las mallas anti-insecto (Álvarez et al., 2014), las mallas fotoselectivas (Raviv y Antignus, 2004; Weintraub y Berlinger, 2004; Díaz y Fereres, 2007) y las mallas impregnadas en insecticida (Licciardi et al., 2008; Martin et al., 2014). Las mallas fotoselectivas reducen o bloquean casi por completo la transmisión de radiación UV, lo que interfiere con la visión de los insectos y dificulta o impide la localización del cultivo y su establecimiento en el mismo (Raviv y Antignus, 2004; Weintraub, 2009). Se ha comprobado cómo su uso puede controlar los pulgones y las virosis en cultivo de lechuga (Díaz et al., 2006; Legarrea et al., 2012a), así como la mosca blanca, los trips y los ácaros, y los virus que estos transmiten en otros cultivos (Costa y Robb, 1999; Antignus et al., 2001; Kumar y Poehling, 2006; Doukas y Payne, 2007a; Legarrea et al., 2010). Sin embargo, no se conoce perfectamente el modo de acción de estas barreras, puesto que existe un efecto directo sobre la plaga y otro indirecto mediado por la planta, cuya fisiología cambia al desarrollarse en ambientes con falta de radiación UV, y que podría afectar al ciclo biológico de los insectos fitófagos (Vänninen et al., 2010; Johansen et al., 2011). Del mismo modo, es necesario estudiar la compatibilidad de esta estrategia con los enemigos naturales de las plagas. Hasta la fecha, los estudios han evidenciado que los agentes de biocontrol pueden realizar su actividad bajo ambientes pobres en radiación UV (Chyzik et al., 2003; Chiel et al., 2006; Doukas y Payne, 2007b; Legarrea et al., 2012c). Otro método basado en barreras físicas son las mallas impregnadas con insecticidas, que se han usado tradicionalmente en la prevención de enfermedades humanas transmitidas por mosquitos (Martin et al., 2006). Su aplicación se ha ensayado en agricultura en ciertos cultivos al aire libre (Martin et al., 2010; Díaz et al., 2004), pero su utilidad en cultivos protegidos para prevenir la entrada de insectos vectores en invernadero todavía no ha sido investigada. Los aditivos se incorporan al tejido durante el proceso de extrusión de la fibra y se liberan lentamente actuando por contacto en el momento en que el insecto aterriza sobre la malla, con lo cual el riesgo medioambiental y para la salud humana es muy limitado. Los plaguicidas que se emplean habitualmente suelen ser piretroides (deltametrina o bifentrín), aunque también se ha ensayado dicofol (Martin et al., 2010) y alfa-cipermetrina (Martin et al., 2014). Un factor que resulta de vital importancia en este tipo de mallas es el tamaño del poro para facilitar una buena ventilación del cultivo, al tiempo que se evita la entrada de insectos de pequeño tamaño como las moscas blancas (Bethke y Paine, 1991; Muñoz et al., 1999). Asimismo, se plantea la necesidad de estudiar la compatibilidad de estas mallas con los enemigos naturales. Es por ello que en esta Tesis Doctoral se plantea la necesidad de evaluar nuevas mallas impregnadas que impidan el paso de insectos de pequeño tamaño al interior de los invernaderos, pero que a su vez mantengan un buen intercambio y circulación de aire a través del poro de la malla. Así, en la presente Tesis Doctoral, se han planteado los siguientes objetivos generales a desarrollar: 1. Estudiar el impacto de la presencia de parasitoides sobre el grado de dispersión y los patrones de distribución de pulgones y las virosis que éstos transmiten. 2. Conocer el efecto directo de ambientes pobres en radiación UV sobre el comportamiento de vuelo de plagas clave de hortícolas y sus enemigos naturales. 3. Evaluar el efecto directo de la radiación UV-A sobre el crecimiento poblacional de pulgones y mosca blanca, y sobre la fisiología de sus plantas hospederas, así como el efecto indirecto de la radiación UV-A en ambas plagas mediado por el crecimiento de dichas planta hospederas. 4. Caracterización de diversas mallas impregnadas en deltametrina y bifentrín con diferentes propiedades y selección de las óptimas para el control de pulgones, mosca blanca y sus virosis asociadas en condiciones de campo. Estudio de su compatibilidad con parasitoides. ABSTRACT Insect vectors of plant viruses are the main agents causing major economic losses in vegetable crops grown under protected environments. This Thesis focuses on the implementation of new alternatives to chemical control of insect vectors under Integrated Pest Management programs. In Spain, biological control is the main pest control strategy used in a large part of greenhouses where horticultural crops are grown. The first study aimed to increase our knowledge on how the presence of natural enemies such as Aphidius colemani Viereck may alter the dispersal of the aphid vector Aphis gossypii Glover (Chapter 4). In addition, it was investigated if the presence of this parasitoid affected the spread of aphid-transmitted viruses Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus) and Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV, Polerovirus) infecting cucumber (Cucumis sativus L). SADIE methodology was used to study the distribution patterns of both the virus and its vector, and their degree of association. Results suggested that parasitoids promoted aphid dispersal in the short term, which enhanced CMV spread, though consequences of parasitism suggested potential benefits for disease control in the long term. Furthermore, A. colemani significantly limited the spread and incidence of the persistent virus CABYV in the long term. The flight activity of pests Myzus persicae (Sulzer), Bemisia tabaci (Gennadius) and Tuta absoluta (Meyrick), and natural enemies A. colemani and Sphaerophoria rueppellii (Weidemann) under UV-deficient environments was studied under field conditions (Chapter 5). One-chamber tunnels were covered with cladding materials with different UV transmittance properties. Inside each tunnel, insects were released from tubes placed in a platform suspended from the ceiling. Specific targets were located at different distances from the platform. The ability of aphids and whiteflies to reach their targets was diminished under UV-absorbing barriers, suggesting a reduction of vector activity under this type of nets. Fewer aphids reached distant traps under UV-absorbing nets, and significantly more aphids could fly to the end of the tunnels covered with non-UV blocking materials. Unlike aphids, differences in B. tabaci captures were mainly found in the closest targets. The oviposition of lepidopteran T. absoluta was also negatively affected by a UV-absorbing cover. The photoselective barriers were compatible with parasitism and oviposition of biocontrol agents. Apart from the direct response of insects to UV radiation, plant-mediated effects influencing insect performance were investigated (Chapter 6). The impact of UV-A radiation on the performance of aphid M. persicae and whitefly B. tabaci, and growth and leaf physiology of host plants pepper and eggplant was studied under glasshouse conditions. Plants were grown inside cages covered by transparent and UV-A-opaque plastic films. Plant growth and insect fitness were monitored. Leaves were harvested for chemical analysis. Pepper plants responded directly to UV-A by producing shorter stems whilst UV-A did not affect the leaf area of either species. UV-A-treated peppers had higher content of secondary metabolites, soluble carbohydrates, free amino acids and proteins. Such changes in tissue chemistry indirectly promoted aphid performance. For eggplants, chlorophyll and carotenoid levels decreased with supplemental UVA but phenolics were not affected. Exposure to supplemental UV-A had a detrimental effect on whitefly development, fecundity and fertility presumably not mediated by plant cues, as compounds implied in pest nutrition were unaltered. Lastly, the efficacy of a wide range of Long Lasting Insecticide Treated Nets (LLITNs) was studied under laboratory and field conditions. This strategy aimed to prevent aphids and whiteflies to enter the greenhouse by determining the optimum mesh size (Chapter 7). This new approach is based on slow release deltamethrin- and bifenthrin-treated nets with large hole sizes that allow improved ventilation of greenhouses. All LLITNs produced high mortality of M. persicae and A. gossypii although their efficacy decreased over time with sun exposure. It was necessary a net with hole size of 0.29 mm2 to exclude B. tabaci under laboratory conditions. The feasibility of two selected nets was studied in the field under a high insect infestation pressure in the presence of CMV- and CABYV-infected cucumber plants. Besides, the compatibility of parasitoid A. colemani with bifenthrin-treated nets was studied in parallel field experiments. Both nets effectively blocked the invasion of aphids and reduced the incidence of both viruses, however they failed to exclude whiteflies. We found that our LLITNs were compatible with parasitoid A. colemani. As shown, the role of natural enemies has to be taken into account regarding the dispersal of insect vectors and subsequent spread of plant viruses. The additional benefits of novel physicochemical barriers, such as photoselective and insecticide-impregnated nets, need to be considered in Integrated Pest Management programs of vegetable crops grown under protected environments.