Obtención de clones de alcornoque (Quercus suber L.) mediante embriogénesis somática: aplicación de medios líquidos y biorreactores en la sincronización de los procesos de desarrollo y maduración de los embriones

El alcornoque tiene un gran valor ambiental, como integrante de los ecosistemas forestales mediterráneos, e interés comercial por el valor de la bellota (alimentación del cerdo ibérico), el carbón, la madera y sobre todo por las aplicaciones industriales del corcho. Las posibilidades de mejora genética del alcornoque, como las de otras especies forestales, están limitadas por sus largos ciclos reproductivos y porque su propagación vegetativa mediante estaquillado solo es posible en estados muy juveniles. Por ello este sistema de propagación tiene muy poca, o ninguna, utilidad práctica en la mejora genética. La embriogénesis somática es la vía más apropiada para la clonación de muchas especies forestales y ha hecho posible el desarrollo a gran escala de plantaciones multivarietales de coníferas. En alcornoque es posible la regeneración completa de árboles adultos mediante embriogénesis somática. Con los protocolos actuales (en medio semisólido), los embriones se generan formando acúmulos y en la fase de multiplicación conviven embriones en distintos estados de desarrollo. Es un sistema asincrónico, con baja eficacia para la propagación en masa, que no elimina completamente las dificultades para el desarrollo de programas de mejora genética del alcornoque. En otras especies la utilización de medios líquidos ha mejorado: la sincronización, productividad de los cultivos, el manejo y reducido los costes de producción. Por ello el desarrollo de suspensiones embriogénicas de alcornoque se plantea como una vía para aumentar la eficacia de la propagación clonal a gran escala. En la presente tesis se desarrollan cultivos embriogénicos de alcornoque en medio líquido. El capítulo 3 aborda el establecimiento y mantenimiento de suspensiones, el capítulo 4 el desarrollo de una fase de proliferación en medio líquido y el capítulo 5 la utilización de sistemas de cultivo en medio líquido, estacionarios y de inmersión temporal, como vía para favorecer la maduración de los embriones somáticos. Para iniciar los cultivos en medio líquido se emplearon agregados de embriones tomados de la fase de proliferación en medio semisólido. Cuando estos agregados se inocularon directamente en medio líquido no se logró el establecimiento de las suspensiones. El establecimiento se consiguió empleando como inóculo las células y Resumen pequeños agregados embriogénicos, de tamaño comprendido entre 41 y 800 μm, desprendidas por agitación breve de los agregados de embriones. El mantenimiento se logró inoculando en baja densidad masas embriogénicas compactas de tamaño comprendido entre 0,8 y 1,2 mm. Estas suspensiones, muy heterogéneas, mantuvieron su capacidad de proliferación y de regeneración de embriones al menos durante diez subcultivos consecutivos. El protocolo de iniciación y mantenimiento, desarrollado inicialmente con un solo genotipo, fue eficaz cuando se probó sobre otros 11 genotipos de alcornoque. En la fase de proliferación se ensayaron tres tipos de envase y tres velocidades de agitación. La combinación envase × velocidad determinó el intercambio gaseoso, la disponibilidad de oxígeno y el estrés hidrodinámico. Los agregados embriogénicos de alcornoque crecieron incluso en condiciones de hipoxia no siendo la disponibilidad de oxígeno un factor limitante del crecimiento para tasas de trasferencia de oxígeno comprendidas entre 0,11 h-1 y 1,47 h-1. Por otra parte la producción de biomasa creció con el estrés hidrodinámico para valores de índice de cizalladura inferiores a 5 x 10-3 cm min-1. La mayor producción de biomasa se obtuvo con matraces Erlenmeyer de 100 ml y alta velocidad de agitación (160 rpm) mientras que la diferenciación de embriones se vio favorecida por bajas velocidades de agitación (60 rpm) asociadas con bajas disponibilidades de oxígeno. La posibilidad de madurar embriones de alcornoque en medio líquido se estudió utilizando sistemas de inmersión permanente y sistemas de inmersión temporal. En inmersión permanente no se diferenciaron embriones cotiledonares (posiblemente por hiperhidricidad). Los sistemas de inmersión temporal permitieron obtener embriones maduros en estado cotiledonar y capaces de regenerar plantas in vitro. Concentraciones de sacarosa superiores a 60 g l-1 y frecuencias de inmersión iguales o inferiores a una diaria, tuvieron efectos negativos para el desarrollo de los embriones somáticos. En los sistemas de inmersión temporal los parámetros físico-químicos del medio de cultivo se mantuvieron estables y no se observó ninguna limitación de nutrientes. No obstante, estos sistemas se vieron afectados por la evaporación que generó el flujo de aire necesario para desplazar el líquido en cada periodo de inmersión. Abstract ABSTRACT Cork oak is one of the most important tree species of the Mediterranean ecosystem. Besides its high environmental value has a great economic interest due to the sustainable production of acorns (to feed the Iberian pig) charcoal, timber and cork, which is a renewable natural product with various technological applications. As happens with other forest species, cork oak genetic improvement programs are limited by their long life cycles and because vegetative propagation by cuttings it´s only possible in very juvenile plants. Hence this propagation system is useless or has little practical use for breeding cork oak. Plant regeneration by somatic embryogenesis is the most suitable way for cloning many forest species, and it is the enabling technology which has allowed the establishment of large-scale conifer multi-varietal plantations. Clonal plant regeneration of mature cork oak trees can be achieved through somatic embryogenesis. Somatic embryos at different stages of development and forming clusters are produced during the multiplication phase with current protocols (using semisolid medium). This is an asynchronous low-efficient process not suitable for mass propagation, and therefore it does not solve the difficulties presented by cork oak breeding programs. Culture in liquid medium has been used with other species to improve: synchronization, yield, handling, and to reduce production costs. Thus the development of cork oak embryogenic suspension cultures is envisaged as a way to increase the efficiency of large scale clonal propagation. The thesis herein develops cork oak embryogenic cultures in liquid medium. In chapter 3 establishment and maintenance of suspension cultures are developed, chapter 4 studies proliferation phase in liquid medium and chapter 5 considers the use of different systems of culture in liquid medium, both stationary and temporary immersion, as a way to promote somatic embryos maturation. Clusters of embryos taken from proliferating cultures on semisolid medium were used to initiate the cultures in liquid medium. When these clusters were inoculated directly in liquid medium establishment of suspension cultures was not executed. However using, as initial inoculum, cells and cell aggregates with a size between 41 and 800 μm detached from these clusters of embryos, subjected to a brief shaking, suspension cultures could be established. Suspension maintenance was achieved by inoculating compact embryogenic Abstract clumps with a size between 0.8 and 1.2 mm at low density. The suspension cultures, very heterogeneous, retained both their proliferation and embryo regeneration capacity for at least ten consecutive subcultures. The initiation and maintenance protocol, initially developed with a single genotype, was effective when tested on 11 additional genotypes of cork oak. In proliferation phase three types of vessels and three different levels of agitation were assayed. The combination vessel × orbiting speed determined gas exchange, oxygen availability and hydrodynamic stress. Cork oak embryogenic aggregates grew even under hypoxia conditions; oxygen availability at transfer rates between 0.11 and 1.47 h-1 was not a limiting factor for growth. Furthermore the biomass production was increased with hydrodynamic stress when shear rate values were of less than 5 x 10-3 cm min-1. The highest biomass production was obtained with 100 ml Erlenmeyer flask and high stirring speed (160 rpm) while the differentiation of embryos was favored by low agitation speeds (60 rpm) associated with low oxygen availability. The possibility to mature cork oak somatic embryos in liquid medium was studied using both permanent immersion systems and temporary immersion systems. Cotyledonary embryos did not differentiate in permanent immersion conditions (probably due to hyperhydricity). Temporary immersion systems allowed obtaining mature cotyledonary embryos, which were able to regenerate plants in vitro. Sucrose concentrations above 60 g l-1 and immersion frequencies equal to or lower than one each 24 h had negative effects on somatic embryo development. Physicochemical parameters of the culture medium in temporary immersion systems were stable and showed no limitation of nutrients. However, these systems were affected by the evaporation generated by the airflow necessary to relocate the medium at each immersion period.

Caracterización de la agitación local y la respuesta oscilatoria de un buque mediante el uso de técnicas de visión artificial : aplicación al análisis de los umbrales operativos en líneas de atraque y amarre

El desarrollo de actividades de carga y descarga son parte de la esencia de la naturaleza funcional de un puerto, de las cuales derivan en gran medida los ingresos del mismo y la eficiencia de la cadena logística en su conjunto. Las oscilaciones en el interior de una dársena y en un línea de atraque disminuyen la calidad de la estancia de las embarcaciones en puerto, reducen el rendimiento de la estiba de los buques y solicitan y fatigan las estructuras y los cuerpos flotantes amarrados. Si los parámetros que definen la agitación local se aproximan a regiones de fallo 0 parada, el subsistema pierde rendimiento, fiabilidad y finalmente se paralizan las operaciones, produciéndose de este modo tiempos de inactividad. Estas paradas operativas conllevan pérdidas económicas para la terminal y, consecuentemente, para el puerto. Hoy día se dispone vastas redes de monitorización destinadas a la caracterización del medio físico en el entorno de los puertos. Paralelamente, las operaciones de manipulación de cargas en las terminales se están dirigiendo hacia modelos de automatización o semi automatización, que permiten no sólo la sistematización de procesos, sino también un profundo conocimiento del flujo de tareas. En este contexto hay un déficit de información sobre cómo afectan los diferentes forzadores del medio físico al rendimiento, la seguridad funcionalidad del proceso de manipulación de carga y descarga. Esto se debe en gran medida a la falta de registros dilatados en el tiempo que permitan correlacionar todos los aspectos mencionados de un modo particularizado para cada línea de atraque y amarre de un puerto. En esta tesis se desarrolla una metodología de vídeo monitorización no intrusiva y de bajo coste basada en la aplicación de técnicas "pixel tool' y la obtención de los parámetros extrínsecos de una observación monofocal. Con ello pretende poner en valor las infraestructuras de vídeo vigilancia de los puertos y de los laboratorios de experimentación a escala reducida, con el objeto de facilitar el estudio los umbrales operativos de las áreas de atraque y amarre. The development of loading and unloading activities is an essential part of he functional nature of a port, which derive largely from he same income and the efficiency of he supply chain as a whole. The oscillations inside a dock and a mooring line diminish he quality of the stay of vessels in port reducing the performance of the stowage of ship and asking and fatigued structures and moored floating bodies. If the parameters defining the local al agitation regions are close to areas of failure or shutdown, he subsystem looses performance, reliability and eventually paralyzes the operations, thereby producing downtime. These operational stops entail economic 1osses to the terminal and, consequently for the port. Today vast networks of monitoring, aimed at he characterization of the physical environment in the vicinity of he ports, are available. In parallel, the cargo handling operations at terminals are moving towards automation or semi-automation models that allow not only the systematization of processes, but also a deep understanding of he workflow. In this context, there is a lack of information about how the different forcing agents of the physical environment affect the performance and he functional safety of the loading and unloading process. This is due largely to the lack of spread-over-time records which would allow to correlate all aspects mentioned, specifically, for each berthing and mooring of a port. This thesis develops a methodology for non-intrusive and low cost monitoring video based on the application of "pixel tool" techniques and on obtaining the extrinsic parameters of a monofocal observation. It seeks an enhancement of the video monitoring infrastructure at ports and at experimental laboratories of reduced scale, in order to facilitate the study of operational thresholds berthing and mooring areas.

Optimización de la agitación de un digestor anaerobio mediante mecánica de fluidos computacional

Debido al gran interés existente en el ahorro y recuperación de energía, y en el deseo de obtener productos que permitan usos beneficiosos del fango procedente de la depuración del agua residual, la digestión anaerobia es el proceso de estabilización de uso más extendido. El tiempo de retención de sólidos es un factor clave en el proceso de digestión anaerobia. En base al tiempo de retención de sólidos, se dimensiona el volumen de los digestores anaerobios para así obtener la reducción de materia orgánica deseada, con la correspondiente producción de biogás. La geometría del digestor y su sistema de agitación deben ser adecuados para alcanzar el tiempo de retención de sólidos de diseño. Los primeros trabajos sobre la agitación de los digestores realizaban únicamente experimentos con trazadores y otros métodos de medición. En otros casos, la mezcla era evaluada mediante la producción de biogás. Estas técnicas tenían el gran hándicap de no conocer lo que sucedía realmente dentro del digestor y sólo daban una idea aproximada de su funcionamiento. Mediante aplicación de la mecánica de fluidos computacional (CFD) es posible conocer con detalle las características del fluido objeto de estudio y, por lo tanto, simular perfectamente el movimiento del fango de un digestor anaerobio. En esta tesis se han simulado mediante CFD diferentes digestores a escala real (unos 2000 m3 de volumen) agitados con bomba/s de recirculación para alcanzar los siguientes objetivos: establecer la influencia de la relación entre el diámetro y la altura, de la pendiente de la solera, del número de bombas y del caudal de recirculación en dichos digestores, definir el campo de velocidades en la masa de fango y realizar un análisis energético y económico. Así, es posible conocer mejor cómo funciona el sistema de agitación de un digestor anaerobio a escala real equipado con bomba/s de recirculación. Los resultados obtenidos muestran que una relación diámetro/altura del digestor por encima de 1 empeora la agitación del mismo y que la pendiente en la solera del digestor favorece que la masa de fango esté mejor mezclada, siendo más determinante la esbeltez del tanque que la pendiente de su solera. No obstante, también es necesario elegir adecuadamente los parámetros de diseño del sistema de agitación, en este caso el caudal de recirculación de fango, para obtener una agitación completa sin apenas zonas muertas. En el caso de un digestor con una geometría inadecuada es posible mejorar su agitación aumentando el número de bombas de recirculación y el caudal de las mismas, pero no se llegará a alcanzar una agitación total de la masa de fango debido a su mal diseño original. Anaerobic digestion is the process for waste water treatment sludge stabilization of more widespread use due to the huge interest in saving and recovering energy and the wish to obtain products that allow beneficial uses for the sludge. The solids retention time is a key factor in the anaerobic digestion. Based on the solids retention time, volume anaerobic digester is sized to obtain the desired reduction in organic matter, with the corresponding production of biogas. The geometry of the digester and the stirring system should be adequate to achieve the design solid retention time. Early works on digesters stirring just performed tracer experiments and other measurement methods. In other cases, mixing was evaluated by biogas production. These techniques had the great handicap of not knowing what really happened inside the digester and they only gave a rough idea of its operation. By application of computational fluid dynamics (CFD), it is possible to know in detail the characteristics of the fluid under study and, therefore, simulate perfectly the sludge movement of an anaerobic digester. Different full-scale digesters (about 2000 m3 of volume) agitated with pump/s recirculation have been simulated by CFD in this thesis to achieve the following objectives: to establish the influence of the relationship between the diameter and height, the slope of the bottom, the number of pumps and the recirculation flow in such digesters, to define the velocity field in the mass of sludge and carry out an energy and economic analysis. Thus, it is possible to understand better how the agitation system of a full-scale anaerobic digester equipped with pump/s recirculation works. The results achieved show that a diameter/height ratio of the digester above 1 worsens its stirring and that the slope of the digester bottom favors that the mass of sludge is better mixed, being more decisive the tank slenderness than the slope of its bottom. However, it is also necessary to select properly the design parameters of the agitation system, in this case the sludge recirculation flow rate, for a complete agitation with little dead zones. In the case of a digester with inadequate geometry, its agitation can be improved by increasing the number of recirculation pumps and flow of them, but it will not reach a full agitation of the mass of sludge because of the poor original design.