Function of C1A barley peptidases and their inhibitors (cystatins) in barley seed germination : Funcion de las peptidasas C1A de cebada y sus inhibidores (cistatinas) en la germinacion de la semilla

Plant proteolysis is a metabolic process where specific enzymes called peptidases degrade proteins. In plants, this complex process involves broad metabolic networks and different sub-cellular compartments. Several types of peptidases take part in the proteolytic process, mainly cysteine-, serine-, aspartyl- and metallo- peptidases. Among the cysteine-peptidases, the papain-like or C1A peptidases (family C1, clan CA) are extensively present in land plants and are classified into catepsins L-, B-, H- and Flike. The catalytic mechanism of these C1A peptidases is highly conserved and involves the three amino acids Cys, His and Asn in the catalytic triad, and a Gln residue which seems essential for maintaining an active enzyme conformation. These proteins are synthesized as inactive precursors, which comprise an N-terminal signal peptide, a propeptide, and the mature protein. In barley, we have identified 33 cysteine-peptidases from the papain-like family, classifying them into 8 different groups. Five of them corresponded to cathepsins L-like (5 subgroups), 1 cathepsin B-like group, 1 cathepsin F-like group and 1 cathepsin H-like group. Besides, C1A peptidases are the specific targets of the plant proteinaceous inhibitors known as phytocystatins (PhyCys). The cystatin inhibitory mechanism is produced by a tight and reversible interaction with their target enzymes. In barley, the cystatin gene family is comprised by 13 members. In this work we have tried to elucidate the role of the C1A cysteine-peptidases and their specific inhibitors (cystatins) in the germination process of the barley grain. Therefore, we selected a representative member of each group/subgroup of C1A peptidases (1 cathepsin B-like, 1 cathepsin F-like, 1 cathepsin H-like and 5 cathepsins L-like). The molecular characterization of the cysteine-peptidases was done and the peptidase-inhibitor interaction was analyzed in vitro and in vivo. A study in the structural basis for specificity of pro-peptide/enzyme interaction in barley C1A cysteine-peptidases has been also carried out by inhibitory assays and the modeling of the three-dimensional structures. The barley grain maturation produces the accumulation of storage proteins (prolamins) in the endosperm which are mobilized during germination to supply the required nutrients until the photosynthesis is fully established. In this work, we have demonstrated the participation of the cysteine-peptidases and their inhibitors in the degradation of the different storage protein fractions (hordeins, albumins and globulins) present in the barley grain. Besides, transgenic barley plants overexpressing or silencing cysteine-peptidases or cystatins were obtained by Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos to analyze their physiological function in vivo. Preliminary assays were carried out with the T1 grains of several transgenic lines. Comparing the knock-out and the overexpressing lines with the WT, alterations in the germination process were detected and were correlated with their grain hordein content. These data will be validated with the homozygous grains that are being produced through the double haploid technique by microspore culture. Resumen La proteólisis es un proceso metabólico por el cual se lleva a cabo la degradación de las proteínas de un organismo a través de enzimas específicas llamadas proteasas. En plantas, este complejo proceso comprende un entramado de rutas metabólicas que implican, además, diferentes compartimentos subcelulares. En la proteólisis participan numerosas proteasas, principalmente cisteín-, serín-, aspartil-, y metalo-proteasas. Dentro de las cisteín-proteasas, las proteasas tipo papaína o C1A (familia C1, clan CA) están extensamente representadas en plantas terrestres, y se clasifican en catepsinas tipo L, B, H y F. El mecanismo catalítico de estas proteasas está altamente conservado y la triada catalítica formada por los aminoácidos Cys, His y Asn, y a un aminoácido Gln, que parece esencial para el mantenimiento de la conformación activa de la proteína. Las proteasas C1A se sintetizan como precursores inactivos y comprenden un péptido señal en el extremo N-terminal, un pro-péptido y la proteína madura. En cebada hemos identificado 33 cisteín-proteasas de tipo papaína y las hemos clasificado filogenéticamente en 8 grupos diferentes. Cinco de ellos pertenecen a las catepsinas tipo L (5 subgrupos), un grupo a las catepsinas tipo-B, otro a las catepsinas tipo-F y un último a las catepsinas tipo-H. Las proteasas C1A son además las dianas específicas de los inhibidores protéicos de plantas denominados fitocistatinas. El mecanismo de inhibición de las cistatinas está basado en una fuerte interacción reversible. En cebada, se conoce la familia génica completa de las cistatinas, que está formada por 13 miembros. En el presente trabajo se ha investigado el papel de las cisteín-proteasas de cebada y sus inhibidores específicos en el proceso de la germinación de la semilla. Para ello, se seleccionó una proteasa representante de cada grupo/subgrupo (1 catepsina tipo- B, 1 tipo-F, 1 tipo-H, y 5 tipo-L, una por cada subgrupo). Se ha llevado a cabo su caracterización molecular y se ha analizado la interacción enzima-inhibidor tanto in vivo como in vitro. También se han realizado estudios sobre las bases estructurales que demuestran la especificidad en la interacción enzima/propéptido en las proteasas C1A de cebada, mediante ensayos de inhibición y la predicción de modelos estructurales de la interacción. Finalmente, y dado que durante la maduración de la semilla se almacenan proteínas de reserva (prolaminas) en el endospermo que son movilizadas durante la germinación para suministrar los nutrientes necesarios hasta que la nueva planta pueda realizar la fotosíntesis, en este trabajo se ha demostrado la participación de las cisteínproteasas y sus inhibidores en la degradación de las diferentes tipos de proteínas de reserva (hordeinas, albúmins y globulinas) presentes en el grano de cebada. Además, se han obtenido plantas transgénicas de cebada que sobre-expresan o silencian cistatinas y cisteín-proteasas con el fin de analizar la función fisiológica in vivo. Se han realizado análisis preliminares en las semillas T1 de varias líneas tránsgenicas de cebada y al comparar las líneas knock-out y las líneas de sobre-expresión con las silvestres, se han detectado alteraciones en la germinación que están además correlacionadas con el contenido de hordeinas de las semillas. Estos datos serán validados en las semillas homocigotas que se están generando mediante la técnica de dobles haploides a partir del cultivo de microesporas.

Uso de marcadores moleculares para la racionalización y evaluación de la calidad en las colecciones de Recursos Fitogenéticos de trigo

Esta tesis tiene dos objetivos generales: el primero, analizar el uso de proteínas del endospermo y SSRs para la racionalización de las colecciones de trigo, y el segundo, estudiar la influencia de las proteínas del endospermo, del año de cultivo y del abonado nitrogenado en la calidad en un grupo de variedades locales españolas. Dentro del primer objetivo, se estudió la diversidad genética de la colección de Triticum monococcum L. (escaña menor), y de una muestra de la colección de Triticum turgidum L. (trigo duro) del CRF-INIA, con 2 y 6 loci de gliadinas, y 6 y 24 SSRs, para la escaña menor y el trigo duro, respectivamente. Ambas colecciones presentaron una gran diversidad genética, con una gran diferenciación entre las variedades y pequeña dentro de ellas. Los loci de gliadinas mostraron una gran variabilidad, siendo los loci Gli-2 los más útiles para distinguir variedades. En la escaña menor, las gliadinas presentaron mayor poder de discriminación que los SSRs; aunque en trigo duro los SSRs identificaron más genotipos. El número de alelos encontrado fue alto; 24 y 38 en gliadinas, y 29 y 203 en SSRs, en escaña menor y trigo duro, respectivamente. En trigo duro, se identificaron 17 alelos nuevos de gliadinas lo que demuestra que el germoplasma español es muy singular. En ambas especies, se detectaron asociaciones entre la variación alélica en prolaminas y el origen geográfico y filogenético de las variedades. La utilidad de las proteínas (6 loci de gliadinas, 2 loci de gluteninas y proteína total) y de los SSRs (24 loci) para verificar duplicados, y analizar la variabilidad intraaccesión, se estudió en 23 casos de duplicados potenciales de trigo duro. Los resultados indicaron que tanto los biotipos como las accesiones duplicadas mostraban el mismo genotipo en gliadinas, pocas diferencias o ninguna en las subunidades de gluteninas HMW y proteína total, y diferencias en menos de tres loci de SSRs. El mismo resultado se obtuvo para los biotipos de la colección de T. monococcum. Sin embargo, las discrepancias observadas en algunos casos entre proteínas y SSRs demostraron la utilidad del uso conjunto de ambos tipos de marcadores. Tanto las proteínas como los SSRs mostraron gran concordancia con los caracteres agro-morfológicos, especialmente cuando las diferencias entre los genotipos eran grandes. Sin embargo, los caracteres agro-morfológicos fueron menos discriminantes que los marcadores moleculares. Para el segundo objetivo de la tesis, se analizó la variación alélica en siete loci de prolaminas relacionados con la calidad en trigo duro: Glu-A1 y Glu-B1 de gluteninas HMW, Glu-A3, Glu-B3 y Glu-B2 de gluteninas B-LMW, y Gli-A1 y Gli-B1 de gliadinas. La submuestra analizada incluía variedades locales de todas las provincias españolas donde se ha cultivado tradicionalmente el trigo duro. Todos los loci, excepto el Glu-B2, mostraron gran variabilidad genética, siendo los Glu-3 los más polimórficos. En total, se identificaron 65 alelos, de los que 29 eran nuevos, que representan una fuente importante de variabilidad genética para la mejora de la calidad. Se detectaron diferencias en la composición en prolaminas entre la convar. turgidum y la zona norte, y la convar. durum y la zona sur; el genotipo Glu-B3new-1 - Gli-B1new-1 fue muy común en la convar. turgidum, mientras que el Glu-B3a - Gli-B1c, asociado con mejor calidad, fue más frecuente en la convar. durum. En la convar. turgidum, se observó mayor variabilidad que en la convar. durum, principalmente en los loci Glu-B1 y Glu-B3, lo que indica que esta convariedad puede ser una fuente valiosa de nuevos alelos de gluteninas. Esta submuestra fue evaluada para calidad (contenido en proteína, P, y test de sedimentación, SDSS) con dos dosis de abonado nitrogenado (N), y en dos años diferentes. No se detectaron interacciones Variedad × Año, ni Variedad × N en la calidad. Para la P, los efectos ambientales (año y N) fueron mayores que el efecto de la variedad, siendo, en general, mayor la P con dosis altas de N. La variedad influyó más en el test SDSS, que no se vio afectado por el año ni el N. El aumento del contenido en proteína no influyó significativamente sobre la fuerza del gluten estimada con el SDSS. Respecto a la influencia de las prolaminas en la fuerza del gluten, se confirmó la superioridad del Glu-B3a; aunque también se detectó una influencia alta y positiva de los alelos nuevos Glu-A3new-1, y Glu-B3new-6 y new-9. La no correlación entre el rendimiento (evaluado en un trabajo anterior) y la P, en las variedades adaptadas a bajo N, permitió seleccionar cuatro variedades locales con alto rendimiento y buena fuerza del gluten para producción con bajo N. SUMMARY There are two main objectives in this thesis: The first, to analyse the use of endosperm proteins and SSRs to rationalize the wheat collections, and the second, to study the influence on quality of endosperm proteins, year and nitrogen fertilization in a group of Spanish landraces. For the first objective, we studied the genetic diversity of the collection of Triticum monococcum L. (cultivated einkorn), and of a sample of the collection of Triticum turgidum L. (durum wheat) maintained at the CRF-INIA. Two and 6 gliadin loci, and 6 and 24 SSRs, were used for einkorn and durum wheat, respectively. Both collections possessed a high genetic diversity, being the differentiation large between varieties and small within them. Gliadin loci showed great variability, being the loci Gli-2 the most useful for distinguish among varieties. In einkorn, the gliadins showed higher discrimination power than SSRs; although SSRs identified more genotypes in durum wheat. Large number of alleles were found; 24 and 38 in gliadins, and 29 and 203 in SSRs, for einkorn and durum wheat, respectively. In durum wheat, 17 new alleles of gliadins were identified, which indicate that Spanish durum wheat germplasm is rather unique. Some associations between prolamin alleles and geographical and phylogenetic origin of varieties were found in both species. The value of endosperm proteins (6 gliadin loci, 2 glutenin loci and total protein) and SSRs (24 loci) for validation of duplicates, and monitoring the intra-accession variability, was studied in 23 potential duplicates of durum wheat. The results indicated that biotypes and duplicated accessions showed identical gliadin genotype, few or none differences in HMW glutenin subunits and total protein, and less than three different SSR loci. A similar result was obtained for biotypes of T. monococcum. However, the discrepancies in some cases support the convenience to use together both marker systems. A good concordance among endosperm proteins, agro-morphological traits and SSRs were also found, mainly when differences between genotypes were high. However, agro-morphological traits discriminated less between accessions than molecular markers. For the second objective of the thesis, we analysed the allelic variation at seven prolamin loci, involved in durum wheat quality: Glu-A1 and Glu-B1 of HMW glutenin, Glu-A3, Glu-B3 and Glu-B2 of B-LMW glutenin, and Gli-A1 and Gli-B1 of gliadin. The subsample analysed included landraces from all the Spanish provinces where the crop was traditionally cultivated. All the loci, except for Glu-B2, showed high genetic variability, being Glu-3 the most polymorphic. A total of 65 alleles were studied, 29 of them being new, which represent an important source of variability for quality improvement. Differences in prolamin composition were detected between convar. turgidum and the North zone, and the convar. durum and the South zone; the genotype Glu-B3new-1 - Gli-B1new-1 was very common in the convar. turgidum, while the Glu- B3a - Gli-B1c, associated with better quality, was more frequent in the convar. durum. Higher variability was detected in the convar. turgidum than in the convar. durum, mainly at the Glu-B1 and Glu-B3, showing that this convariety could be a valuable source of new glutenin alleles. The subsample was evaluated for quality (protein content, P, and sedimentation test, SDSS) with two doses of nitrogen fertiliser (N), and in two different years. No significant Variety x Year or Variety x Nitrogen interactions were detected. For P, environmental (year and N) effects were higher than variety effect, being P values , in general, larger with high dose of N. The variety exhibited a strong influence on SDSS test, which was not affected by year and N. Increasing values of P did not significantly influence on gluten strength, estimated with the SDSS. Respect to the prolamin effects on gluten strength, the superiority of Glu-B3a was confirmed; although a high positive effect of the new alleles Glu-A3new-1, and Glu-B3new-6 and new-9 was also detected. The no correlation between yield (evaluated in a previous research) and P, in the landraces adapted to low N, allowed to select four landraces with high yield and high gluten strength for low N production.

Factores transcripcionales de la clase DOF en Brachypodium distachyon: caracterización molecular de BdDOF24 durante la germinación de las semillas

La semilla es el órgano que garantiza la propagación y continuidad evolutiva de las plantas espermatofitas y constituye un elemento indispensable en la alimentación humana y animal. La semilla de cereales acumula en el endospermo durante la maduración, mayoritariamente, almidón y proteínas de reserva. Estas reservas son hidrolizadas en la germinación por hidrolasas sintetizadas en la aleurona en respuesta a giberelinas (GA), siendo la principal fuente de energía hasta que la plántula emergente es fotosintéticamente activa. Ambas fases del desarrollo de la semilla, están reguladas por una red de factores de transcripción (TF) que unen motivos conservados en cis- en los promotores de sus genes diana. Los TFs son proteínas que han desempeñado un papel central en la evolución y en el proceso de domesticación, siendo uno de los principales mecanismos de regulación génica; en torno al 7% de los genes de plantas codifican TFs. Atendiendo al motivo de unión a DNA, éstos, se han clasificado en familias. La familia DOF (DNA binding with One Finger) participa en procesos vitales exclusivos de plantas superiores y sus ancestros cercanos (algas, musgos y helechos). En las semillas de las Triticeae (subfamilia Pooideae), se han identificado varias proteínas DOF que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. Brachypodium distachyon es la primera especie de la subfamilia Pooideae cuyo genoma (272 Mbp) ha sido secuenciado. Su pequeño tamaño, ciclo de vida corto, y la posibilidad de ser transformado por Agrobacterium tumefaciens (plásmido Ti), hacen que sea el sistema modelo para el estudio de cereales de la tribu Triticeae con gran importancia agronómica mundial, como son el trigo y la cebada. En este trabajo, se han identificado 27 genes Dof en el genoma de B. distachyon y se han establecido las relaciones evolutivas entre estos genes Dof y los de cebada (subfamilia Pooideae) y de arroz (subfamilia Oryzoideae), construyendo un árbol filogenético en base al alineamiento múltiple del dominio DOF. La cebada contiene 26 genes Dof y en arroz se han anotado 30. El análisis filogenético establece cuatro grupos de genes ortólogos (MCOGs: Major Clusters of Orthologous Genes), que están validados por motivos conservados adicionales, además del dominio DOF, entre las secuencias de las proteínas de un mismo MCOG. El estudio global de expresión en diferentes órganos establece un grupo de nueve genes BdDof expresados abundantemente y/o preferencialmente en semillas. El estudio detallado de expresión de estos genes durante la maduración y germinación muestra que BdDof24, ortólogo putativo a BPBF-HvDOF24 de cebada, es el gen más abundante en las semillas en germinación de B. distachyon. La regulación transcripcional de los genes que codifican hidrolasas en la aleurona de las semillas de cereales durante la post‐germinación ha puesto de manifiesto la existencia en sus promotores de un motivo tripartito en cis- conservado GARC (GA-Responsive Complex), que unen TFs de la clase MYB-R2R3, DOF y MYBR1-SHAQKYF. En esta tesis, se ha caracterizado el gen BdCathB de Brachypodium que codifica una proteasa tipo catepsina B y es ortólogo a los genes Al21 de trigo y HvCathB de cebada, así como los TFs responsables de su regulación transcripcional BdDOF24 y BdGAMYB (ortólogo a HvGAMYB). El análisis in silico del promotor BdCathB ha identificado un motivo GARC conservado, en posición y secuencia, con sus ortólogos en trigo y cebada. La expresión de BdCathB se induce durante la germinación, así como la de los genes BdDof24 y BdGamyb. Además, los TFs BdDOF24 y BdGAMYB interaccionan en el sistema de dos híbridos de levadura e in planta en experimentos de complementación bimolecular fluorescente. En capas de aleurona de cebada, BdGAMYB activa el promotor BdCathB, mientras que BdDOF24 lo reprime; este resultado es similar al obtenido con los TFs ortólogos de cebada BPBF-HvDOF24 y HvGAMYB. Sin embargo, cuando las células de aleurona se transforman simultáneamente con los dos TFs, BdDOF24 tiene un efecto aditivo sobre la trans-activación mediada por BdGAMYB, mientras que su ortólogo BPBF-HvDOF24 produce el efecto contrario, revirtiendo el efecto de HvGAMYB sobre el promotor BdCathB. Las diferencias entre las secuencias deducidas de las proteínas BdDOF24 y BPBF-HvDOF24 podrían explicar las funciones opuestas que desempeñan en su interacción con GAMYB. Resultados preliminares con líneas de inserción de T-DNA y de sobre-expresión estable de BdGamyb, apoyan los resultados obtenidos en expresión transitoria. Además las líneas homocigotas knock-out para el gen BdGamyb presentan alteraciones en anteras y polen y no producen semillas viables. ABSTRACT The seed is the plant organ of the spermatophytes responsible for the dispersion and survival in the course of evolution. In addition, it constitutes one of the most importan elements of human food and animal feed. The main reserves accumulated in the endosperm of cereal seeds through the maturation phase of development are starch and proteins. Its degradation by hydrolases synthetized in aleurone cells in response to GA upon germination provides energy, carbon and nitrogen to the emerging seedling before it acquires complete photosynthetic capacity. Both phases of seed development are controlled by a network of transcription factors (TFs) that interact with specific cis- elements in the promoters of their target genes. TFs are proteins that have played a central role during evolution and domestication, being one of the most important regulatory mechanisms of gene expression. Around 7% of genes in plant genomes encode TFs. Based on the DNA binding motif, TFs are classified into families. The DOF (DNA binding with One Finger) family is involved in specific processes of plants and its ancestors (algae, mosses and ferns). Several DOF proteins have been described to play important roles in the regulation of genes in seeds of the Triticeae tribe (Pooideae subfamily). Brachypodium distachyon is the first member of the Pooideae subfamily to be sequenced. Its small size and compact structured genome (272 Mbp), the short life cycle, small plant size and the possibility of being transformed with Agrobacterium tumefaciens (Ti-plasmid) make Brachypodium the model system for comparative studies within cereals of the Triticeae tribe that have big economic value such as wheat and barley. In this study, 27 Dof genes have been identified in the genome of B. distachyon and the evolutionary relationships among these Dof genes and those frome barley (Pooideae subfamily) and those from rice (Oryzoideae subfamily) have been established by building a phylogenetic tree based on the multiple alignment of the DOF DNA binding domains. The barley genome (Hordeum vulgare) contains 26 Dof genes and in rice (Oryza sativa) 30 genes have been annotated. The phylogenetic analysis establishes four Major Clusters of Orthologous Genes (MCOGs) that are supported by additional conserved motives out of the DOF domain, between proteins of the same MCOG. The global expression study of BdDof genes in different organs and tissues classifies BdDof genes into two groups; nine of the 27 BdDof genes are abundantly or preferentially expressed in seeds. A more detailed expression analysis of these genes during seed maturation and germination shows that BdDof24, orholog to barley BPBF-HvDof24, is the most abundantly expressed gene in germinating seeds. Transcriptional regulation studies of genes that encode hydrolases in aleurone cells during post-germination of cereal seeds, have identified in their promoters a tripartite conserved cis- motif GARC (GA-Responsive Complex) that binds TFs of the MYB-R2R3, DOF and MYBR1-SHAQKYF families. In this thesis, the characterization of the BdCathB gene, encoding a Cathepsin B-like protease and that is ortholog to the wheat Al21 and the barley HvCathB genes, has been done and its transcriptional regulation by the TFs BdDOF24 and BdGAMYB (ortholog to HvGAMYB) studied. The in silico analysis of the BdCathB promoter sequence has identified a GARC motif. BdCathB expression is induced upon germination, as well as, those of BdDof24 and BdGamyb genes. Moreover, BdDOF24 and BdGAMYB interact in yeast (Yeast 2 Hybrid System, Y2HS) and in planta (Bimolecular Fluorecence Complementation, BiFC). In transient assays in aleurone cells, BdGAMYB activates the BdCathB promoter, whereas BdDOF24 is a transcriptional repressor, this result is similar to that obtained with the barley orthologous genes BPBF-HvDOF24 and HvGAMYB. However, when aleurone cells are simultaneously transformed with both TFs, BdDOF24 has an additive effect to the trans-activation mediated by BdGAMYB, while its ortholog BPBF-HvDOF24 produces an opposite effect by reducing the HvGAMYB activation of the BdCathB promoter. The differences among the deduced protein sequences between BdDOF24 and BPBF-HvDOF24 could explain their opposite functions in the interaction with GAMYB protein. Preliminary results of T-DNA insertion (K.O.) and stable over-expression lines of BdGamyb support the data obtained in transient expression assays. In addition, the BdGamyb homozygous T-DNA insertion (K.O.) lines have anther and pollen alterations and they do not produce viable seeds.

Potenciación de la respuesta productiva en rumiantes mediante el empleo de proteínas protegidas

El principal objetivo de esta tesis fue incrementar la eficiencia proteica en las dietas de rumiantes mediante el uso de proteínas protegidas (harina de girasol y guisante de primavera), así como mejorar la predicción de los aportes de proteína microbiana. Una partida de harinas comerciales de girasol (HG) y de guisante de primavera (GP) fueron tratadas con soluciones 4 N de ácido málico (268,2 g/L) o ácido ortofosfórico (130,6 g/L). Para cada harina, ácido y día de tratamiento, dos fracciones de 12,5 kg fueron pulverizadas sucesivamente en una hormigonera con la solución de ácido correspondiente mediante un pulverizador de campo. Las dos fracciones fueron mezcladas posteriormente y se dejaron reposar durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla fue luego secada en una estufa de aire forzado a 120 ºC durante 1 h. La estufa fue apagada inmediatamente después y el material tratado se mantuvo dentro de ésta hasta la mañana siguiente. El material fue removido durante el proceso de secado cada 30 min durante las primeras 2 h y cada 60 min durante las 5 h posteriores. Este proceso se repitió hasta conseguir las cantidades de harinas tratadas necesarias en los distintos ensayos. En el primer experimento (capitulo 3) se llevaron a cabo estudios de digestión ruminal e intestinal para evaluar los efectos de la aplicación de las soluciones ácidas indicadas y calor a fin de proteger las proteínas de HG y GP contra la degradación ruminal. Estos estudios se realizaron con tres corderos canulados en el rumen y en el duodeno. El estudio de digestión ruminal fue realizado en tres periodos experimentales en los que los corderos fueron alimentados sucesivamente con tres dietas isoproteicas que incluían HG y GP, sin tratar o tratadas con ácidos málico u ortofosfórico. Cada periodo experimental de 21 días incluyó sucesivamente: 10 días de adaptación a las dietas, un estudio del tránsito ruminal de las partículas de HG y GP (días 11 a 14), y la incubación de las muestras de ambos alimentos en bolsas de nailon (días 15–21). Las harinas incubadas en cada periodo experimental correspondieron a las que fueron incluidas en las dietas. Las bacterias ruminales fueron marcadas desde el día 11 hasta el día 21 del periodo experimental mediante infusión intra-ruminal continua con una fuente de 15N. Tras finalizar las incubaciones in situ el día 21 el rumen fue vaciado en cada periodo para aislar las bacterias asociadas a la fase sólida y liquida del rumen. El estudio de digestión intestinal fue realizado veinte días después del final del estudio ruminal a fin de eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta. En este estudio se incubaron muestras compuestas obtenidas mediante la combinación de los diferentes residuos no degradados en el rumen de forma que fuesen representativas de la composición química de la fracción no degradada en el rumen (RU). En esta fase los corderos fueron alimentados con la dieta sin tratar para determinar la digestibilidad de las harinas tanto tratadas como sin tratar mediante la técnica de las bolsas móviles. Además, las proteínas contenidas en las harinas tratadas y sin tratar, así como en las muestras correspondientes a los residuos a 0 h, las muestras compuestas anteriormente indicadas y las muestras no digeridas intestinalmente fueron extraídas y sometidas a electroforesis para determinar el sitio de digestión de las diferentes fracciones proteicas. Las estimaciones de la RU y la digestibilidad intestinal de la materia seca, la materia orgánica (solamente para RU), la proteína bruta (PB) y el almidón (solamente en GP) fueron obtenidos considerando la contaminación microbiana y las tasas de conminución y salida de partículas. Las estimaciones de RU y de la digestibilidad intestinal disminuyeron en todas las fracciones evaluadas de ambos alimentos al corregir por la contaminación microbiana acaecida en el rumen. Todas las estimaciones de RU aumentaron con los tratamientos de protección, incrementándose también la digestibilidad intestinal de la materia seca en la HG. Los bajos valores de la digestibilidad de la proteína de GP tratado y sin tratar sugieren la presencia de algún factor antitripsico no termolábil es esta harina. Los tratamientos de protección incrementaron consistentemente la fracción de materia seca y PB digerida intestinalmente en los dos alimentos, mientras que la fracción de almidón en la muestra de GP solamente aumentó numéricamente (60,5% de media). Sin embargo, los tratamientos también redujeron la fermentación de la materia orgánica, lo cual podría disminuir la síntesis de proteína microbiana. Los estudios de electroforesis muestran la práctica desaparición de la albumina por la degradación ruminal en ambos alimentos, así como que los cambios en otras proteínas de la muestra RU fueron más pronunciados en GP que en HG. La composición de las bacterias asociadas con las fases de digesta ruminal sólida (BAS) y líquida (BAL) fue estudiada para revisar la precisión de un sistema de predicción previo que determinaba la infravaloración del aporte de nutrientes correspondiente a las BAS cuando de usa 15N como marcador y las BAL como referencia microbiana (capitulo 4). Al comparar con BAS, BAL mostraron menores contenidos en materia orgánica, polisacáridos de glucosa y lípidos totales y un mayor contenido en PB, así como un mayor enriquecimiento en 15N. Los datos obtenidos en el estudio actual se ajustan bien a la ecuación previa que predice el enriquecimiento en 15N de las BAS a partir del mismo valor en BAL. Esta nueva ecuación permite establecer que se produce una infravaloración de un 22% en el aporte de PB al animal a partir de las BAS sintetizadas si las BAL son usadas como muestras de referencia. Una segunda relación calculada utilizando los valores medios por dieta expuestos en numerosos trabajos encontrados en la literatura confirma la magnitud de este error. Esta infravaloración asociada al uso de BAL como referencia fue mayor para el aporte de glucosa (43,1%) y todavía mayor para el aporte de lípidos (59,9%), como consecuencia de los menores contenidos de ambas fracciones en BAL frente a SAB. Estos errores deberían ser considerados para obtener mayor precisión en la estimación del aporte de nutrientes microbianos y mejorar la nutrición de los rumiantes. En el experimento 2 se realizó un estudio de producción (capitulo 5) para evaluar los efectos del tratamiento de las harinas HG y GP con soluciones de ácido málico o ácido ortofosfórico sobre el crecimiento, el consumo de concentrado y el rendimiento y engrasamiento de las canales de corderos de engorde. Noventa corderos machos de cruce entrefino procedentes de tres granjas comerciales (peso inicial medio = 14,6, 15,3 y 13,3 kg, respectivamente) fueron asignados aleatoriamente a cinco dietas con diferentes niveles de proteína y diferentes tratamientos con ácidos y engordados hasta un peso medio al sacrificio de 25 kg. Las fuentes de proteína en el pienso control (C; PB=18,0%) fueron harina de soja, HG y GP sin tratar. En tres de los piensos experimentales, las harinas tratadas con ácido ortofosfórico sustituyeron a las de HG y GP sin tratar (Control Ortofosfórico, PC; PB=18,0% sobre materia seca), sustituyéndose, además, la harina de soja parcialmente (Sustitución Media Ortofosfórico, MSP; PB=16,7%) o totalmente (Sustitución Total Ortofosfórico, TSP; PB=15,6%). Finalmente, en uno de los piensos el ácido ortofosfórico fue reemplazo por acido málico para proteger ambas harinas (Sustitución Media Málico, MSM; PB= 16,7%). La paja de trigo (fuente de forraje) y el concentrado fueron ofrecidos ad libitum. Dieciocho corderos fueron distribuidos en seis cubículos con tres animales para cada dieta. Los datos fueron analizados según un análisis factorial considerando el peso inicial como covariable y la granja de procedencia como bloque. Los datos de consumo de concentrado y eficiencia de conversión fueron analizados usando el cubículo como unidad experimental, mientras que los datos sobre ganancia media diaria, rendimiento a la canal, grasa dorsal y grasa pélvico renal fueron analizados usando el cordero como unidad experimental. No se encontró ningún efecto asociado con el nivel de PB sobre ninguna variable estudiada. Esto sugiere que usando proteínas protegidas es posible utilizar concentrados con 15,6% de PB (sobre materia seca) disminuyendo así la cantidad de concentrados de proteína vegetal a incluir en los piensos y la calidad de los concentrados proteicos. Los corderos alimentados con la dieta MSM tuvieron mayores ganancias medias diarias (15,2%; P= 0,042), y mejores rendimiento a la canal en caliente (1,3 unidades porcentuales; P= 0,037) que los corderos alimentados con el concentrado MSP. Esto podría ser explicado por los efectos benéficos ruminales del malato o por el mayor efecto de protección conseguido con el ácido málico. ABSTRACT The main objective of this thesis project was to increase the protein efficiency in ruminant diets by using protected protein (sunflower meal and spring pea), and improving the prediction of microbial protein supply. Commercial sunflower meal (SFM) and spring pea (SP) were treated with 4 N solutions (200 mL/kg) of malic acid (268.2 g/L) or orthophosphoric acid (130.6 g/L). Daily, two fractions of 12.5 kg of one of these meals were successively sprayed with the tested acid solution in a concrete mixer using a sprayer. Both fractions were then mixed and allowed to rest for 1 h at room temperature. The blend was then dried in a forced air oven at 120 ºC for 1 h. Then the oven was turned off and the treated material was left in the oven overnight. During the drying process, the material was stirred every 30 min during the first 2 h and then every 60 min for the subsequent 5 h. This process was repeated until the amounts of treated flour needed for the different trials performed. In the first experiment (chapter 3), ruminal and intestinal digestion trials were conducted to study the effects of the application of these acid solutions and heat to protect proteins of SFM and SP against ruminal degradation using three wethers fitted with rumen and duodenum cannulae. The ruminal digestion study was carried out in three experimental periods in which the wethers were successively fed three isoproteic diets including SFM and SP, untreated or treated with malic or orthophosphoric acids. The experimental periods of 21 days included successively: 10 days of diet adaptation, SFM and SP particle ruminal transit study (days 11–14) and ruminal nylon-bag incubations (days 15–21). The meals incubated in each experimental period were those corresponding to the associated diet. Rumen bacteria were labelled from days 11 to 21 by continuous intra-ruminal infusion of a 15N source and the rumen was emptied at the end of in situ incubations in each period to isolate solid adherent bacteria and liquid associate bacteria. The intestinal digestion trial was conducted twenty days after the end of the ruminal studies to eliminate the 15N enrichment in the digesta. The tested samples were composite samples obtained pooling the different ruminally undegraded residues to be representative of the chemical composition of the ruminally undegraded fraction (RU). Wethers were fed the untreated diet to determine the intestinal digestibility of untreated and treated meals using the mobile nylon bag technique. In addition, protein in untreated and treated meals and their 0 h, composite and intestinally undigested samples were extracted and subjected to electrophoresis to determine the digestion site of the different protein fractions. Estimates of the RU and its intestinal digestibility of dry matter, organic matter (only for RU), crude protein (CP) and starch (only in SP) were obtained considering ruminal microbial contamination and particle comminution and outflow rates. When corrected for the microbial contamination taking place in the rumen, estimates of RU and intestinal digestibility decreased in all tested fractions for both feeds. All RU estimates increased with the protective treatments, whereas intestinal digestibility-dry matter also increased in SFM. Low intestinal digestibility-CP values in untreated and treated samples suggested the presence of non-heat labile antitrypsin factors in SP. Protective treatments of both feeds led to consistent increases in the intestinal digested fraction of dry matter and CP, being only numerically different for SP-starch (60.5% as average). However, treatments also reduced the organic matter fermentation, which may decrease ruminal microbial protein synthesis. Electrophoretic studies showed albumin disappearance in both SFM and SP, whereas changes in other RU proteins were more pronounced in SP than SFM. The chemical composition of bacteria associated with solid (SAB) and liquid (LAB) rumen-digesta phases was studied to examine the accuracy of a previous regression system determining the underevaluation of SAB-nutrient supply using 15N as marker and LAB as microbial reference (chapter 4). Compared with SAB, LAB showed lower contents of organic matter, polysaccharide-glucose and total lipids and the opposite for the CP content and the 15N enrichment. Present data fitted well to the previous relationship predicting the 15N enrichment of SAB from the same value in LAB. This new equation allows establishing an underevaluation in the supply of CP from the synthesized SAB in 22.0% if LAB is used as reference. Another relationship calculated using mean diet values from the literature confirmed the magnitude of this error. This underevaluation was higher for the supply of glucose (43.1%) and still higher for the lipid supply (59.9%) as a consequence of the lower contents of these both fractions in LAB than in SAB. These errors should be considered to obtain more accurate estimates of the microbial nutrient supply and to improve ruminant nutrition. A production study was performed in experiment 2 (chapter 5) to examine the effects of treating SFM and SP meals with orthophosphoric or malic acid solutions on growth performance, concentrate intake, and carcass yield and fatness of growing-fattening lambs. Ninety "Entrefino" cross male lambs from three commercial farms (average initial body weights (BW) = 14.6, 15.3 and 13.3 kg) were randomly assigned to five diets with different acid treatment and protein levels, and fattened to an average slaughter weight of 25 kg. Protein sources in the control concentrate (C; CP=18%) were soybean meal and untreated SFM and SP. In three of the experimental concentrates, orthophosphoric acid-treated meals substituted untreated SFM and SP (Orthophosphoric Control, PC; CP=18% dry matter basis), and soybean meal was partially (Medium Substitution Orthophosphoric, MSP; CP=16.7%) or totally removed (Total Substitution Orthophosphoric, TSP; CP=15.6%). In addition, in one concentrate orthophosphoric acid was replaced by malic acid to protect these meals (Medium Substitution Malic, MSM; CP= 16.7%). Wheat straw (roughage source) and concentrate were offered ad libitum. Eighteen lambs were allocated to six pens of three animals on each diet. Data were analyzed using a factorial analysis with initial body weight BW as covariate and farm of origin as block. Data on concentrate intake and feed conversion efficiency were analyzed using pen as experimental unit, while data on average daily gain, carcass yield, dorsal fat, and kidney-pelvic-fat were analyzed with lamb as experimental unit. No effect associated with the CP level was observed on any parameter. This suggests that with protected proteins it is possible to feed concentrates with 15.6% CP (dry matter basis) reducing the quantity of vegetable protein meals to include in the concentrate as well as the quality of the protein concentrates. Lambs feed MSM had higher average daily gains (15.2%; P= 0.042), and better hot carcass yields (1.3 percentage points; P= 0.037) than lambs feed MSP. This probably can be explained by ruminal malate actions and by greater protection effects obtained with malic acid.

Modelos de computación lógica con ADN

La computación molecular es una disciplina que se ocupa del diseño e implementación de dispositivos para el procesamiento de información sobre un sustrato biológico, como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) o las proteínas. Desde que Watson y Crick descubrieron en los años cincuenta la estructura molecular del ADN en forma de doble hélice, se desencadenaron otros descubrimientos como las enzimas que cortan el ADN o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), contribuyendo más que signi�cativamente a la irrupción de la tecnología del ADN recombinante. Gracias a esta tecnología y al descenso vertiginoso de los precios de secuenciación y síntesis del ADN, la computación biomolecular pudo abandonar su concepción puramente teórica. En 1994, Leonard Adleman logró resolver un problema de computación NP-completo (El Problema del Camino de Hamilton Dirigido) utilizando únicamente moléculas de ADN. La gran capacidad de procesamiento en paralelo ofrecida por las técnicas del ADN recombinante permitió a Adleman ser capaz de resolver dicho problema en tiempo polinómico, aunque a costa de un consumo exponencial de moléculas de ADN. Utilizando algoritmos similares al de �fuerza bruta� utilizado por Adleman se logró resolver otros problemas NP-completos (por ejemplo, el de Satisfacibilidad de Fórmulas Lógicas / SAT). Pronto se comprendió que la computación con biomolecular no podía competir en velocidad ni precisión con los ordenadores de silicio, por lo que su enfoque y objetivos se centraron en la resolución de problemas biológicos con aplicación biomédica, dejando de lado la resolución de problemas clásicos de computación. Desde entonces se han propuesto diversos modelos de dispositivos biomoleculares que, de forma autónoma (sin necesidad de un bio-ingeniero realizando operaciones de laboratorio), son capaces de procesar como entrada un sustrato biológico y proporcionar una salida también en formato biológico: procesadores que aprovechan la extensión de la Polimerasa, autómatas que funcionan con enzimas de restricción o con deoxiribozimas, circuitos de hibridación competitiva. Esta tesis presenta un conjunto de modelos de dispositivos de ácidos nucleicos escalables, sensibles al tiempo y energéticamente e�cientes, capaces de implementar diversas operaciones de computación lógica aprovechando el fenómeno de la hibridación competitiva del ADN. La capacidad implícita de estos dispositivos para aplicar reglas de inferencia como modus ponens, modus tollens, resolución o el silogismo hipotético tiene un gran potencial. Entre otras funciones, permiten representar implicaciones lógicas (o reglas del tipo SI/ENTONCES), como por ejemplo, �si se da el síntoma 1 y el síntoma 2, entonces estamos ante la enfermedad A�, o �si estamos ante la enfermedad B, entonces deben manifestarse los síntomas 2 y 3�. Utilizando estos módulos lógicos como bloques básicos de construcción, se pretende desarrollar sistemas in vitro basados en sensores de ADN, capaces de trabajar de manera conjunta para detectar un conjunto de síntomas de entrada y producir un diagnóstico de salida. La reciente publicación en la revista Science de un autómata biomolecular de diagnóstico, capaz de tratar las células cancerígenas sin afectar a las células sanas, es un buen ejemplo de la relevancia cientí�ca que este tipo de autómatas tienen en la actualidad. Además de las recién mencionadas aplicaciones en el diagnóstico in vitro, los modelos presentados también tienen utilidad en el diseño de biosensores inteligentes y la construcción de bases de datos con registros en formato biomolecular que faciliten el análisis genómico. El estudio sobre el estado de la cuestión en computación biomolecular que se presenta en esta tesis está basado en un artículo recientemente publicado en la revista Current Bioinformatics. Los nuevos dispositivos presentados en la tesis forman parte de una solicitud de patente de la que la UPM es titular, y han sido presentados en congresos internacionales como Unconventional Computation 2010 en Tokio o Synthetic Biology 2010 en París.

Algunas consideraciones acerca de la superficie foliar del viñedo

Las hojas representan el centro básico de la actividad de la vid, en ellas se realizan múltiples funciones que van desde las funciones fisiológicas más conocidas entre las que destaca la fotosíntesis, a través de la cual las hojas captan de la atmosfera la energía luminosa, que trasforman en energía química para trasformar el anhídrido carbónico (CO2) atmosférico en hidratos de carbono, en azúcares, que son el primer eslabón de todas las cadenas metabólicas de la planta, azúcares que la vid utilizará para edificar los diferentes tejidos y órganos, que empleará como fuente de energía para las diferentes funciones de crecimiento y metabolismo, azúcares que acumula como reserva en frutos o en los o en otras partes de las plantas (hojas, tallos o raíces); con el concurso de los azúcares las plantas obtienen los restantes compuestos orgánicos, desde las proteínas, las hormonas o los ácidos orgánicos tienen su origen en los azucares.

Mejora del valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos (málico y fosfórico) y calor = Improvement of the protein value for ruminants of sunflower meal by combined treatments with acids (malic and orthophosphoric) and heat

El objetivo principal de esta tesis fue incrementar el valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos y calor para proteger sus proteínas frente a la degradación ruminal. Estos estudios comprenden dos experimentos realizados sobre ovinos mediante tecnologías in vitro (experimento 1) o in situ e in vivo (experimento 2), empleando siempre dos ácidos: málico u ortofosfórico. Aprovechando este último experimento, también se consideraron otros objetivos de carácter metodológico con el fin de mejorar la precisión de las estimas de i) la degradabilidad ruminal y la digestibilidad intestinal de la proteína y los aminoácidos (AAs) de los alimentos y ii) la síntesis microbiana ruminal y su contribución al flujo post-ruminal de nutrientes al animal. En el experimento 1 (capítulo 2) se efectuaron cuatro ensayos in vitro para estudiar la influencia de distintos factores que puedan afectar la eficacia de estos tratamientos. En cada ensayo se utilizó una réplica por tratamiento (dos para el tratamiento control) y dos bolsas vacías (empleadas para corregir la contaminación microbiana) en cada una de las cuatro botellas del incubador (ANKOM Daisy II). Cada botella contenía 2 l de medio de incubación, saturado con CO2 para asegurar la anaerobiosis. Este medio consistió en una mezcla de solución McDougall y liquido ruminal filtrado en relación 4:1. El liquido ruminal fue obtenido de 2 corderos canulados en rumen, utilizándose bien solo o mezclado con el del otro cordero en una relación 3:1. Así, cada botella de incubación contenía un inoculo ruminal diferente. Las incubaciones se realizaron a 39 ºC durante 20 h, siendo las bolsas lavadas con agua corriente y almacenadas a -20 ºC. Tras ser descongeladas, se lavaron 3 veces durante 5 min en una mini-lavadora de turbina, se desecaron a 80 ºC durante 48 h y se destinaron íntegras al análisis de N-Kjeldahl. En el ensayo 1 se estudió el efecto del volumen de disolución de dos dosis de ácido ortofosfórico (0,4 y 1,2 equivalentes gramo (eq)/kg de harina de girasol), testando cinco volúmenes de disolución (80, 160, 240, 320 and 400 ml/kg de harina) para cada dosis, desecándose las harinas a 60 ºC hasta sequedad al tacto. La proteína bruta (PB) indegradada se incremento con la dosis de ácido empleada y también (como tendencia, P < 0,1) con el volumen de dilución. En base a ello en los siguientes ensayos se utilizo el volumen de dilución mayor (400 ml/kg). En el ensayo 2 se estudió el efecto de la dosis y del tipo de ácido a cuatro dosis (1,2; 2,4; 3,6 y 4,8 eq/kg), secándose igualmente las muestras tratadas a 60 ºC. La PB indegradada aumentó con la dosis de ácido, siendo también mayor para el ácido málico, tanto en este ensayo como en los posteriores. En el ensayo 3 se estudiaron los efectos de los dos ácidos, cuatro concentraciones (0,6; 1,2; 1,8 y 2,4 eq/kg) y tres tratamientos térmicos para el secado de las muestras (100, 150 and 200 ºC durante 60, 30 y 20 minutos, respectivamente). Con los tratamientos térmicos a 100 y 150 ºC no hubo un incremento de protección para concentraciones superiores a 0,8 eq/kg para ambos ácidos. Para incrementar la protección fue necesario aumentar la temperatura a 200 ºC y la dosis a 1,2 eq/kg, no observándose un aumento de protección a dosis mayores. En el ensayo 4 se estudiaron los efectos sobre la lisina disponible, la solubilidad de la PB en saliva artificial de McDougall y la PB indegradada in vitro de tratar la harina solo con agua o con disoluciones de ambos ácidos a dosis de 0,8 eq/kg y temperaturas de secado de 100 ó 150 ºC en las mismas condiciones que en el ensayo 3. No se apreciaron efectos sobre la lisina disponible para ninguno de los tratamientos. El efecto específico de los ácidos quedo demostrado tanto por la fuerte reducción de la solubilidad de la PB como por el aumento de la PB indegradada frente al tratamiento con agua. En conjunto, los resultados de este experimento mostraron que la eficacia de estos tratamientos depende del tipo y dosis de ácido y de su dilución, así como de las condiciones de secado. Como tratamiento de mayor interés a aplicar posteriormente en el experimento 2 se consideró una dosis de 0,8 eq/kg de harina, aplicada en un volumen de 400 ml/kg (correspondiente a soluciones 1 M y 0,67 M para los ácidos málico y ortofosfórico, respectivamente) y desecación a 150 ºC. El experimento 2 (capítulos 3 a 7) se realizó con un diseño en cuadrado latino 3x3, empleando tres corderos canulados en rumen y duodeno y tres dietas isoproteicas: U, M y P, que incluían harinas de girasol sin tratar (control) y tratadas con acido málico u ortofosfórico, respectivamente. La harina de girasol se trató en las condiciones ya indicadas siendo necesarias 6 horas para su secado en estufa. Las dietas incluían 40% de heno de raigrás italiano y 60% de concentrado a base de harina de girasol (tratada y/o sin tratar), trigo y corrector vitamínico-mineral, siendo suministradas a 75 g/kg P0.75 (equivalente a 2,3 × mantenimiento). La relación harina de girasol sin tratar y tratada fue de 100:0 en la dieta U y entorno a 40:60 en las dietas M y P. Tras 10 días de adaptación a la dieta, se estudiaron sucesivamente: i) el tránsito hasta el duodeno de las partículas del heno (solo en la dieta control) y de la harina de girasol marcadas previamente con europio e iterbio, respectivamente; ii) la fermentación ruminal durante el periodo postprandial, iii) la degradación ruminal in situ de la harina de girasol específica de cada dieta (y del trigo y el heno en la dieta control) y iv) la magnitud y composición del contenido ruminal mediante el vaciado manual del rumen-retículo. Durante todo el periodo experimental se infundio de forma continua una solución de sulfato amónico enriquecido en 15N (98 átomos %) para corregir la contaminación microbiana ruminal en los estudios in situ y para establecer las diferencias de composición química entre las bacterias libres (BAL) y adherentes (BAS) del rumen. Esta solución incluyó en los dos últimos días Li-Cr- EDTA para determinar la tasa de dilución ruminal. Posteriormente, y tras un periodo de al menos 10 días para eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta, se estudió la digestibilidad intestinal de los distintos alimentos mediante la técnica de bolsas móviles. La determinación del bypass (BP) o de la degradabilidad efectiva (DE) de la materia seca (MS) y de la PB se realizó por el método tradicional de integración matemática; estos valores se obtuvieron también para la PB y los AAs generando una muestra representativa del flujo post-ruminal del alimento en estudio en cada animal. Ello se realizó mediante la mezcla de los distintos residuos de incubación en base a la función que describe el flujo de alimento indegradado que abandona el rumen. Todos estos trabajos se realizaron considerando la tasa de salida de partículas del rumen (kp) y, según casos, considerando también la tasa de conminución y mezcla de las partículas en este compartimento (kc). Para este último caso se ha desarrollado también el modelo matemático que describe este flujo y permite este cálculo. Los valores no corregidos por la contaminación microbiana del BP (o de DE) de la PB resultantes de ambos métodos se han comparado tanto en las harinas de girasol como en los restantes alimentos de la dieta, obteniéndose valores similares, sin apreciarse desviaciones sistemáticas. Sobre las muestras compuestas representativas de la composición química del BP se determino la digestibilidad intestinal efectiva (DIE) de la MS, PB y AAs. Todos los valores resultantes de esta técnica fueron corregidos para la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen. Los estudios de transito digestivo se realizaron tras suministrar en el comedero a los corderos una dosis simple de los alimentos marcados, seguida de la toma de muestras de la digesta duodenal durante 82 h. En la dieta testigo se suministraron simultáneamente el heno de raigrás y la harina de girasol, mientras que en las otras dietas solo se suministró esta última. La harina de girasol mostro un mayor valor para kc frente al heno (0,5766 v. 0,0892, /h), mientras que no hubo diferencias entre los dos alimentos para kp (0,0623 v. 0,0609, /h). Para la harina de girasol no se apreciaron diferencias entre dietas para kc, pero si se redujo de manera moderada la tasa kp con los tratamientos, siendo ésta también menor al utilizar ácido ortofosfórico frente al uso de ácido malico (0,0577 v. 0,0600, /h). El empleo de las harinas tratadas no modifico los parámetros de fermentación ruminal, la composición de los contenidos ruminales o la tasa de dilución del rumen. Los valores efectivos del BP y de DIE de la MS, PB y AAs de las harinas de girasol se obtuvieron considerando kc y kp, conjuntamente. Los tratamientos de protección incrementaron el BP de MS y PB en 48,5 y 268% de media, respectivamente. Estos incrementos se debieron principalmente al descenso de la fracción soluble y de la velocidad de degradación, pero también al aumento de la fracción indegradable, especialmente usando ácido ortofosfórico. Con los tratamientos se incrementó también la DIE de la MS (108% de media) y de la PB con gran diferencia entre los ácidos málico y ortofosfórico (20,7 v. 11,8%). Como consecuencia de estos cambios la protección aumentó la fracción realmente digerida en el intestino en 211% (MS) y 325% (PB), sin efectos entre ambos ácidos. Considerando la reducción del suministro de energía fermentable para los microorganismos ruminales asociada a la protección y los parámetros indicados por el sistema PDI francés para la síntesis de proteína microbiana digestible, la eficacia de conversión de PB en proteína metabolizable aumentó de 0,244 a 0,559 y 0,515 con el tratamiento con acido málico y ortofosfórico, respectivamente. El contenido en aminoácidos (AAs) fue similar en todas las harinas salvo por una disminución de lisina en las harinas tratadas. De forma análoga a la PB, los tratamientos de protección incrementaron el BP y la DIE de la mayoría de AAs. El aporte de AAs metabolizabes de la harina se multiplico en 3,87 para los AAs azufrados y en menor medida (2,5 veces) para la lisina, como consecuencia de las pérdidas sufridas a consecuencia del tratamiento térmico. Estos tratamientos se muestran, por tanto, útiles para incrementar el valor proteico de la harina de girasol, si bien su empleo junto con concentrados proteicos ricos en lisina bypass digestible mejoraría el perfil de la proteína metabolizable. La corrección de la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen se asoció en todos los alimentos testados y, de forma general, con reducciones del BP y de su DIE en todas las fracciones estudiadas. Estas reducciones fueron pequeñas en todos los concentrados, de forma acorde con los muy pequeños niveles de contaminación registrados tanto en las harinas de girasol como en el grano de trigo. Por el contrario, esta contaminación, al igual que los efectos de su corrección, fueron muy importantes en el heno de raigrás. Esta contaminación aumentó al tener en cuenta kc. Así, para la proporción de PB de origen microbiano existente en las muestras compuestas representativas del BP, este aumento fue significativo para el heno de raigrás (0,463 v. 0,706) y solo numérico para la harina de girasol (0,0170 v. 0,0208). La reducción de las estimas de DIE al corregir esta contaminación fue consecuencia de la eliminación de forma casi completa de los microorganismos adherentes en todos los residuos testados. Así, esta biomasa se redujo en 96,1% como media de 7x3 observaciones. Como resultado de las diferencias acumulativas a nivel del rumen e intestino, la no corrección de la contaminación microbiana junto con la no consideración de kc condujo a fuertes sobrestimaciones de la PB digerida en el intestino. Ésta fue de 39% en la harina de girasol (0,146 v. 0,105) y de 761% en el heno de raigrás (0,373 v. 0,0433). Estos resultados muestran que es necesario considerar tanto kc como corregir la contaminación microbiana para obtener estimas in situ precisas en forrajes, mientras que en concentrados, siempre que la contaminación microbiana sea pequeña, es más importante considerar kc. La elevada contaminación microbiana observada en el heno de raigrás se asoció también con importantes errores a nivel del N asociado a la fibra neutro (FND) y ácido (FAD) detergente (NDIN y ADIN, respectivamente) e incluso de estas fracciones de fibra, evidenciándose que estos métodos no eliminan completamente la contaminación microbiana que sufren los alimentos en su paso por el retículorumen. Así, en la muestra compuesta representativa de la composición química del flujo postruminal antes descrita, la sobrevaloración por no corregir la contaminación microbiana fue de 99,8; 24,2; 3,34 y 0,48% para NDIN, ADIN, FND y FAD, respectivamente. Las subvaloraciones asociadas para su DE fueron 34,1; 8,79; 4,41 y 0,51%, respectivamente. La DE corregida del NDIN y ADIN (0,743 y 0,728, respectivamente) mostró un aprovechamiento ruminal elevado de estos compuestos, si bien menor al de la PB total (0,85). El estudio de este aprovechamiento sobre los residuos de incubación ruminal a 6 y 72 h demostró, además, una más rápida degradación del ADIN frente al NDIN, así como un mayor potencial de degradación de este último en este alimento. Para comprobar si la digestión en el abomaso eliminaba la contaminación microbiana en la FND y FAD se estudio esta contaminación y sus posibles errores en muestras liofilizadas de contenidos ruminales y duodenales correspondientes a una dieta mixta de similar composición a la utilizada en el experimento 2, comparándose, además, las diferencias entre la extracción secuencial o directa de la FAD. Utilizando como referencia las BAS se apreciaron elevadas contaminaciones en la FND y FAD y su N asociado tanto en las muestras ruminales como en las duodenales. Sin embargo, los resultados de enriquecimiento en 15N de las partículas fueron intermedios entre los correspondientes a BAS y BAL lo que evidencia una elevada contaminación con BAL en estas muestras probablemente durante el proceso de liofilización. Ello conlleva una sobrevaloración de esta estimación. El método de extracción directa de FAD se mostró, por otra parte, marcadamente menos eficaz en la eliminación de la contaminación microbiana. Los resultados muestran la necesidad de corregir la contaminación microbiana para obtener estimaciones precisas de la degradabilidad de las proteínas de las paredes celulares vegetales. Estos errores deberían ser también considerados para FND y FAD en estudios in situ e in vivo. La elevada tasa fraccional de degradación del grano de trigo (60,9 y 42,0%/h para MS y PB, respectivamente) implico que su flujo de material indegradado (calculado solo en base a la kp obtenida para la harina de girasol) se redujera muy rápidamente, de forma que es casi nulo a 8 h tras la ingestión. Los valores corregidos de PB digerida en el intestino (0,15) representan solo el 18,7% de la proteína metabolizable, lo que muestra que el valor proteico del grano de trigo está estrechamente ligado a la síntesis de proteína microbiana derivada de su fermentación. En el experimento 2 se observaron menores concentraciones para materia orgánica, lípidos y PB, así como en la proporción N-AAs/N total en BAL que en BAS, siendo, por el contrario, mayor su enriquecimiento en 15N. Estos últimos resultados se utilizaron (junto con los de otros trabajos previos de este equipo) para validar una predicción preexistente del enriquecimiento en 15N de las BAS a partir de este valor en las BAL. Esta ecuación, de muy alta precisión (R2 = 0.995), permite calcular la subvaloración que se comete en los aportes de nutrientes correspondientes a las BAS al usar las BAL como muestra de referencia. Esta subvaloración representa aproximadamente 21, 32,5 y 60% para PB, proteína verdadera y lípidos.

Influence of liposoluble vitamin status on health parameter and physical fitness in European adolescents = Influencia del estado en vitaminas liposolubles en parámetros de salud y condición física en adolescentes europeos

La adolescencia es un período de crecimiento y desarrollo crítico e importante para la adquisición de hábitos saludables, en los que tanto la alimentación como la actividad física tienen un papel destacado. Junto con el primer año de vida, los requerimientos de energía y nutrientes son mayores que en cualquier otro periodo. Dentro de la nutrición, las vitaminas se ven involucradas en múltiples procesos celulares y tisulares, y sus deficiencias se vinculan a enfermedades crónicas degenerativas en la edad adulta como las cardiovasculares, cáncer, diabetes y osteoporosis, pero cuyos factores de riesgo se establecen a edades más tempranas. Las concentraciones sanguíneas de vitaminas están influenciadas en gran medida por la ingesta dietética, pero existen otros factores del individuo, entre los que cabe citar la composición corporal, la actividad física y condición física que, junto a la genética, podrían desempeñar un papel crucial. La presente memoria de Tesis Doctoral tiene como objetivo analizar el estado en vitaminas liposolubles y su relación con diversos factores de salud, entre los que destacan la composción corporal, hábitos dietéticos, actividad física y condición física en adolescentes Europeos. El trabajo está basado en los datos del estudio HELENA (“Healthy Lifestyle in Europe by Nutrition in Adolescence”). Se han analizado un total de 1089 adolescentes procedentes de diez ciudades en nueve paises europeos. Los principales resultados de este trabajo indican; a) La existencia de un estado deficiente en vitaminas liposolubles en adolescentes Europeos, especialmente de vitamina D, que alcanza valores del 80%. b) La estación del año, la latitud, el índice de masa corporal, la condición física, la ingesta de calcio dietético, los suplementos vitamínicos y la edad son las variables más relacionadas con el estado de vitamina D. c) A su vez, la capacidad cardiorrespiratoria puede predecir los niveles de vitamina D en los chicos, mientras que la fuerza muscular y masa magra parecen influir en los niveles de vitamina D en las chicas. La grasa corporal y el índice de masa corporal se correlaccionan negativamente con los niveles de vitamina D, especialmente en chicos. d) Un estado de vitamina D óptimo provoca una mejora de la masa ósea sólo cuando se tiene un nivel adecuado de actividad física. e) Se identifica la necesidad de establecer un consenso sobre los rangos aceptables y puntos de corte para las concentraciones sanguíneas de estas vitaminas en este grupo de población, ya que los actuales están extrapolados de la población adulta ABSTRACT Adolescence is a critical period of physiological growth and development as well as for the acquisition of healthy behaviors where both diet and physical activity play a major role. Apart from the first year of life, both energy and nutrient requirements are greatest during adolescence and the way to spend this energy by movement is also crucial. Vitamins are specifically involved in multiple cellular and tissue processes, and there is increasing evidence that deficiencies at these early ages could contribute to risk factors of chronic diseases like cardiovascular and cerebrovascular disease, cancer, diabetes and osteoporosis in adulthood, regardless data are scarce for younger ages. Vitamin concentrations are largely influenced by diet but other individual factors like body composition, physical activity or fitness together with genetics could play also an important role. The current thesis analyzes the liposoluble vitamin status in European adolescents and their relation with several health related factors, like body composción, dietary intake, physical activity and fitness. The work is based on data from the HELENA study ("Healthy Lifestyle in Europe by Nutrition in Adolescence"), for which a total of 1089 adolescents from ten different cities, in nine European countries were recruited. The main outcomes of this thesis are: a) There is a high liposoluble vitamin deficiency prevalence in European adolescents, specifically for vitamin D, which is presenting almost 80% of the adolescents. b) Season, latitude, BMI, fitness, dietary calcium intake, supplements intake and age are highly related to 25(OH)D concentrations found in European adolescents. c) Cardiorespiratory fitness may predict 25(OH)D concentrations in male adolescents, whereas upper limbs muscular strength and FFM may predict 25(OH)D concentrations in young females. Fat mass and BMI are inversely related to 25(OH)D concentrations, especially in males. d) The effect of 25(OH)D concentrations on bone mineral content in adolescents depends on physical activity levels. e) There is a need to establish a consensus on acceptable ranges and cut-offs of blood concentrations of these vitamins during adolescence, as currently they are extrapolated from adults.

A framework for building distributed social network websites

Las redes son la esencia de comunidades y sociedades humanas; constituyen el entramado en el que nos relacionamos y determinan cómo lo hacemos, cómo se disemina la información o incluso cómo las cosas se llevan a cabo. Pero el protagonismo de las redes va más allá del que adquiere en las redes sociales. Se encuentran en el seno de múltiples estructuras que conocemos, desde las interaciones entre las proteínas dentro de una célula hasta la interconexión de los routers de internet. Las redes sociales están presentes en internet desde sus principios, en el correo electrónico por tomar un ejemplo. Dentro de cada cliente de correo se manejan listas contactos que agregadas constituyen una red social. Sin embargo, ha sido con la aparición de los sitios web de redes sociales cuando este tipo de aplicaciones web han llegado a la conciencia general. Las redes sociales se han situado entre los sitios más populares y con más tráfico de la web. Páginas como Facebook o Twitter manejan cifras asombrosas en cuanto a número de usuarios activos, de tráfico o de tiempo invertido en el sitio. Pero las funcionalidades de red social no están restringidas a las redes sociales orientadas a contactos, aquellas enfocadas a construir tu lista de contactos e interactuar con ellos. Existen otros ejemplos de sitios que aprovechan las redes sociales para aumentar la actividad de los usuarios y su involucración alrededor de algún tipo de contenido. Estos ejemplos van desde una de las redes sociales más antiguas, Flickr, orientada al intercambio de fotografías, hasta Github, la red social de código libre más popular hoy en día. No es una casualidad que la popularidad de estos sitios web venga de la mano de sus funcionalidades de red social. El escenario es más rico aún, ya que los sitios de redes sociales interaccionan entre ellos, compartiendo y exportando listas de contactos, servicios de autenticación y proporcionando un valioso canal para publicitar la actividad de los usuarios en otros sitios web. Esta funcionalidad es reciente y aún les queda un paso hasta que las redes sociales superen su condición de bunkers y lleguen a un estado de verdadera interoperabilidad entre ellas, tal como funcionan hoy en día el correo electrónico o la mensajería instantánea. Este trabajo muestra una tecnología que permite construir sitios web con características de red social distribuída. En primer lugar, se presenta una tecnología para la construcción de un componente intermedio que permite proporcionar cualquier característica de gestión de contenidos al popular marco de desarrollo web modelo-vista-controlador (MVC) Ruby on Rails. Esta técnica constituye una herramienta para desarrolladores que les permita abstraerse de las complejidades de la gestión de contenidos y enfocarse en las particularidades de los propios contenidos. Esta técnica se usará también para proporcionar las características de red social. Se describe una nueva métrica de reusabilidad de código para demostrar la validez del componente intermedio en marcos MVC. En segundo lugar, se analizan las características de los sitios web de redes sociales más populares, con el objetivo de encontrar los patrones comunes que aparecen en ellos. Este análisis servirá como base para definir los requisitos que debe cumplir un marco para construir redes sociales. A continuación se propone una arquitectura de referencia que proporcione este tipo de características. Dicha arquitectura ha sido implementada en un componente, Social Stream, y probada en varias redes sociales, tanto orientadas a contactos como a contenido, en el contexto de una asociación vecinal tanto como en proyectos de investigación financiados por la UE. Ha sido la base de varios proyectos fin de carrera. Además, ha sido publicado como código libre, obteniendo una comunidad creciente y está siendo usado más allá del ámbito de este trabajo. Dicha arquitectura ha permitido la definición de un nuevo modelo de control de acceso social que supera varias limitaciones presentes en los modelos de control de acceso para redes sociales. Más aún, se han analizado casos de estudio de sitios de red social distribuídos, reuniendo un conjunto de caraterísticas que debe cumplir un marco para construir redes sociales distribuídas. Por último, se ha extendido la arquitectura del marco para dar cabida a las características de redes sociales distribuídas. Su implementación ha sido validada en proyectos de investigación financiados por la UE. Abstract Networks are the substance of human communities and societies; they constitute the structural framework on which we relate to each other and determine the way we do it, the way information is diseminated or even the way people get things done. But network prominence goes beyond the importance it acquires in social networks. Networks are found within numerous known structures, from protein interactions inside a cell to router connections on the internet. Social networks are present on the internet since its beginnings, in emails for example. Inside every email client, there are contact lists that added together constitute a social network. However, it has been with the emergence of social network sites (SNS) when these kinds of web applications have reached general awareness. SNS are now among the most popular sites in the web and with the higher traffic. Sites such as Facebook and Twitter hold astonishing figures of active users, traffic and time invested into the sites. Nevertheless, SNS functionalities are not restricted to contact-oriented social networks, those that are focused on building your own list of contacts and interacting with them. There are other examples of sites that leverage social networking to foster user activity and engagement around other types of content. Examples go from early SNS such as Flickr, the photography related networking site, to Github, the most popular social network repository nowadays. It is not an accident that the popularity of these websites comes hand-in-hand with their social network capabilities The scenario is even richer, due to the fact that SNS interact with each other, sharing and exporting contact lists and authentication as well as providing a valuable channel to publize user activity in other sites. These interactions are very recent and they are still finding their way to the point where SNS overcome their condition of data silos to a stage of full interoperability between sites, in the same way email and instant messaging networks work today. This work introduces a technology that allows to rapidly build any kind of distributed social network website. It first introduces a new technique to create middleware that can provide any kind of content management feature to a popular model-view-controller (MVC) web development framework, Ruby on Rails. It provides developers with tools that allow them to abstract from the complexities related with content management and focus on the development of specific content. This same technique is also used to provide the framework with social network features. Additionally, it describes a new metric of code reuse to assert the validity of the kind of middleware that is emerging in MVC frameworks. Secondly, the characteristics of top popular SNS are analysed in order to find the common patterns shown in them. This analysis is the ground for defining the requirements of a framework for building social network websites. Next, a reference architecture for supporting the features found in the analysis is proposed. This architecture has been implemented in a software component, called Social Stream, and tested in several social networks, both contact- and content-oriented, in local neighbourhood associations and EU-founded research projects. It has also been the ground for several Master’s theses. It has been released as a free and open source software that has obtained a growing community and that is now being used beyond the scope of this work. The social architecture has enabled the definition of a new social-based access control model that overcomes some of the limitations currenly present in access control models for social networks. Furthermore, paradigms and case studies in distributed SNS have been analysed, gathering a set of features for distributed social networking. Finally the architecture of the framework has been extended to support distributed SNS capabilities. Its implementation has also been validated in EU-founded research projects.

Inference Models in DNA Computing

La computación molecular es una disciplina que se ocupa del diseño e implementación de dispositivos para el procesamiento de información sobre un sustrato biológico, como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) o las proteínas. Desde que Watson y Crick descubrieron en los años cincuenta la estructura molecular del ADN en forma de doble hélice, se desencadenaron otros descubrimientos, como las enzimas de restricción o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), contribuyendo de manera determinante a la irrupción de la tecnología del ADN recombinante. Gracias a esta tecnología y al descenso vertiginoso de los precios de secuenciación y síntesis del ADN, la computación biomolecular pudo abandonar su concepción puramente teórica. El trabajo presentado por Adleman (1994) logró resolver un problema de computación NP-completo (El Problema del Camino de Hamilton dirigido) utilizando únicamente moléculas de ADN. La gran capacidad de procesamiento en paralelo ofrecida por las técnicas del ADN recombinante permitió a Adleman ser capaz de resolver dicho problema en tiempo polinómico, aunque a costa de un consumo exponencial de moléculas de ADN. Utilizando algoritmos de fuerza bruta similares al utilizado por Adleman se logró resolver otros problemas NP-completos, como por ejemplo el de Satisfacibilidad de Fórmulas Lógicas / SAT (Lipton, 1995). Pronto se comprendió que la computación biomolecular no podía competir en velocidad ni precisión con los ordenadores de silicio, por lo que su enfoque y objetivos se centraron en la resolución de problemas con aplicación biomédica (Simmel, 2007), dejando de lado la resolución de problemas clásicos de computación. Desde entonces se han propuesto diversos modelos de dispositivos biomoleculares que, de forma autónoma (sin necesidad de un bio-ingeniero realizando operaciones de laboratorio), son capaces de procesar como entrada un sustrato biológico y proporcionar una salida también en formato biológico: procesadores que aprovechan la extensión de la polimerasa (Hagiya et al., 1997), autómatas que funcionan con enzimas de restricción (Benenson et al., 2001) o con deoxiribozimas (Stojanovic et al., 2002), o circuitos de hibridación competitiva (Yurke et al., 2000). Esta tesis presenta un conjunto de modelos de dispositivos de ácidos nucleicos capaces de implementar diversas operaciones de computación lógica aprovechando técnicas de computación biomolecular (hibridación competitiva del ADN y reacciones enzimáticas) con aplicaciones en diagnóstico genético. El primer conjunto de modelos, presentados en el Capítulo 5 y publicados en Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón (2012b), Rodríguez-Patón et al. (2010a) y Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón (2010), define un tipo de biosensor que usa hebras simples de ADN para codificar reglas sencillas, como por ejemplo "SI hebra-ADN-1 Y hebra-ADN-2 presentes, ENTONCES enfermedad-B". Estas reglas interactúan con señales de entrada (ADN o ARN de cualquier tipo) para producir una señal de salida (también en forma de ácido nucleico). Dicha señal de salida representa un diagnóstico, que puede medirse mediante partículas fluorescentes técnicas FRET) o incluso ser un tratamiento administrado en respuesta a un conjunto de síntomas. El modelo presentado en el Capítulo 5, publicado en Rodríguez-Patón et al. (2011), es capaz de ejecutar cadenas de resolución sobre fórmulas lógicas en forma normal conjuntiva. Cada cláusula de una fórmula se codifica en una molécula de ADN. Cada proposición p se codifica asignándole una hebra simple de ADN, y la correspondiente hebra complementaria a la proposición ¬p. Las cláusulas se codifican incluyendo distintas proposiciones en la misma hebra de ADN. El modelo permite ejecutar programas lógicos de cláusulas Horn aplicando múltiples iteraciones de resolución en cascada, con el fin de implementar la función de un nanodispositivo autónomo programable. Esta técnica también puede emplearse para resolver SAP sin ayuda externa. El modelo presentado en el Capítulo 6 se ha publicado en publicado en Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón (2012c), y el modelo presentado en el Capítulo 7 se ha publicado en (Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón, 2013c). Aunque explotan métodos de computación biomolecular diferentes (hibridación competitiva de ADN en el Capítulo 6 frente a reacciones enzimáticas en el 7), ambos modelos son capaces de realizar inferencia Bayesiana. Funcionan tomando hebras simples de ADN como entrada, representando la presencia o la ausencia de un indicador molecular concreto (una evidencia). La probabilidad a priori de una enfermedad, así como la probabilidad condicionada de una señal (o síntoma) dada la enfermedad representan la base de conocimiento, y se codifican combinando distintas moléculas de ADN y sus concentraciones relativas. Cuando las moléculas de entrada interaccionan con las de la base de conocimiento, se liberan dos clases de hebras de ADN, cuya proporción relativa representa la aplicación del teorema de Bayes: la probabilidad condicionada de la enfermedad dada la señal (o síntoma). Todos estos dispositivos pueden verse como elementos básicos que, combinados modularmente, permiten la implementación de sistemas in vitro a partir de sensores de ADN, capaces de percibir y procesar señales biológicas. Este tipo de autómatas tienen en la actualidad una gran potencial, además de una gran repercusión científica. Un perfecto ejemplo fue la publicación de (Xie et al., 2011) en Science, presentando un autómata biomolecular de diagnóstico capaz de activar selectivamente el proceso de apoptosis en células cancerígenas sin afectar a células sanas.

Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Cycling Dof Factors: Molecular and functional characterization of Arabidopsis thaliana AtCDF3 and tomato (Solanum lycopersicum L.) SlCDF3 in response to abiotic stress

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es considerado uno de los cultivos hortícolas de mayor importancia económica en el territorio Español. Sin embargo, su producción está seriamente afectada por condiciones ambientales adversas como, salinidad, sequía y temperaturas extremas. Para resolver los problemas que se presentan en condiciones de estrés, se han empleado una serie de técnicas culturales que disminuyen sus efectos negativos, siendo de gran interés el desarrollo de variedades tolerantes. En este sentido la obtención y análisis de plantas transgénicas, ha supuesto un avance tecnológico, que ha facilitado el estudio y la evaluación de genes seleccionados en relación con la tolerancia al estrés. Estudios recientes han mostrado que el uso de genes reguladores como factores de transcripción (FTs) es una gran herramienta para obtener nuevas variedades de tomate con mayor tolerancia a estreses abióticos. Las proteínas DOF (DNA binding with One Finger) son una familia de FTs específica de plantas (Yangisawa, 2002), que están involucrados en procesos fisiológicos exclusivos de plantas como: asimilación del nitrógeno y fijación del carbono fotosintético, germinación de semilla, metabolismo secundario y respuesta al fotoperiodo pero su preciso rol en la tolerancia a estrés abiótico se desconoce en gran parte. El trabajo descrito en esta tesis tiene como objetivo estudiar genes reguladores tipo DOF para incrementar la tolerancia a estrés abiotico tanto en especies modelo como en tomate. En el primer capítulo de esta tesis se muestra la caracterización funcional del gen CDF3 de Arabidopsis, así como su papel en la respuesta a estrés abiótico y otros procesos del desarrollo. La expresión del gen AtCDF3 es altamente inducido por sequía, temperaturas extremas, salinidad y tratamientos con ácido abscísico (ABA). La línea de inserción T-DNA cdf3-1 es más sensible al estrés por sequía y bajas temperaturas, mientras que líneas transgénicas de Arabidopsis 35S::AtCDF3 aumentan la tolerancia al estrés por sequía, osmótico y bajas temperaturas en comparación con plantas wild-type (WT). Además, estas plantas presentan un incremento en la tasa fotosintética y apertura estomática. El gen AtCDF3 se localiza en el núcleo y que muestran una unión específica al ADN con diferente afinidad a secuencias diana y presentan diversas capacidades de activación transcripcional en ensayos de protoplastos de Arabidopsis. El dominio C-terminal de AtCDF3 es esencial para esta localización y su capacidad activación, la delección de este dominio reduce la tolerancia a sequía en plantas transgénicas 35S::AtCDF3. Análisis por microarray revelan que el AtCDF3 regula un set de genes involucrados en el metabolismo del carbono y nitrógeno. Nuestros resultados demuestran que el gen AtCDF3 juega un doble papel en la regulación de la respuesta a estrés por sequía y bajas temperaturas y en el control del tiempo de floración. En el segundo capítulo de este trabajo se lleva a cabo la identificación de 34 genes Dof en tomate que se pueden clasificar en base a homología de secuencia en cuatro grupos A-D, similares a los descritos en Arabidopsis. Dentro del grupo D se han identificado cinco genes DOF que presentan características similares a los Cycling Dof Factors (CDFs) de Arabidopsis. Estos genes son considerados ortólogos de Arabidopsis CDF1-5, y han sido nombrados como Solanum lycopersicum CDFs o SlCDFs. Los SlCDF1-5 son proteínas nucleares que muestran una unión específica al ADN con diferente afinidad a secuencias diana y presentan diversas capacidades de activación transcripcional in vivo. Análisis de expresión de los genes SlCDF1-5 muestran diferentes patrones de expresión durante el día y son inducidos de forma diferente en respuesta a estrés osmótico, salino, y de altas y bajas temperaturas. Plantas de Arabidopsis que sobre-expresan SlCDF1 y SlCDF3 muestran un incremento de la tolerancia a la sequía y salinidad. Además, de la expresión de varios genes de respuesta estrés como AtCOR15, AtRD29A y AtERD10, son expresados de forma diferente en estas líneas. La sobre-expresión de SlCDF3 en Arabidopsis promueve un retardo en el tiempo de floración a través de la modulación de la expresión de genes que controlan la floración como CONSTANS (CO) y FLOWERING LOCUS T (FT). En general, nuestros datos demuestran que los SlCDFs están asociados a funciones aun no descritas, relacionadas con la tolerancia a estrés abiótico y el control del tiempo de floración a través de la regulación de genes específicos y a un aumento de metabolitos particulares. ABSTRACT Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the horticultural crops of major economic importance in the Spanish territory. However, its production is being affected by adverse environmental conditions such as salinity, drought and extreme temperatures. To resolve the problems triggered by stress conditions, a number of agricultural techniques that reduce the negative effects of stress are being frequently applied. However, the development of stress tolerant varieties is of a great interest. In this direction, the technological progress in obtaining and analysis of transgenic plants facilitated the study and evaluation of selected genes in relation to stress tolerance. Recent studies have shown that a use of regulatory genes such as transcription factors (TFs) is a great tool to obtain new tomato varieties with greater tolerance to abiotic stresses. The DOF (DNA binding with One Finger) proteins form a family of plant-specific TFs (Yangisawa, 2002) that are involved in the regulation of particular plant processes such as nitrogen assimilation, photosynthetic carbon fixation, seed germination, secondary metabolism and flowering time bur their precise roles in abiotic stress tolerance are largely unknown. The work described in this thesis aims at the study of the DOF type regulatory genes to increase tolerance to abiotic stress in both model species and the tomato. In the first chapter of this thesis, we present molecular characterization of the Arabidopsis CDF3 gene as well as its role in the response to abiotic stress and in other developmental processes. AtCDF3 is highly induced by drought, extreme temperatures, salt and abscisic acid (ABA) treatments. The cdf3-1 T-DNA insertion mutant was more sensitive to drought and low temperature stresses, whereas the AtCDF3 overexpression enhanced the tolerance of transgenic plants to drought, cold and osmotic stress comparing to the wild-type (WT) plants. In addition, these plants exhibit increased photosynthesis rates and stomatal aperture. AtCDF3 is localized in the nuclear region, displays specific binding to the canonical DNA target sequences and has a transcriptional activation activity in Arabidopsis protoplast assays. In addition, the C-terminal domain of AtCDF3 is essential for its localization and activation capabilities and the deletion of this domain significantly reduces the tolerance to drought in transgenic 35S::AtCDF3 overexpressing plants. Microarray analysis revealed that AtCDF3 regulated a set of genes involved in nitrogen and carbon metabolism. Our results demonstrate that AtCDF3 plays dual roles in regulating plant responses to drought and low temperature stress and in control of flowering time in vegetative tissues. In the second chapter this work, we carried out to identification of 34 tomato DOF genes that were classified by sequence similarity into four groups A-D, similar to the situation in Arabidopsis. In the D group we have identified five DOF genes that show similar characteristics to the Cycling Dof Factors (CDFs) of Arabidopsis. These genes were considered orthologous to the Arabidopsis CDF1 - 5 and were named Solanum lycopersicum CDFs or SlCDFs. SlCDF1-5 are nuclear proteins that display specific binding to canonical DNA target sequences and have transcriptional activation capacities in vivo. Expression analysis of SlCDF1-5 genes showed distinct diurnal expression patterns and were differentially induced in response to osmotic, salt and low and high temperature stresses. Arabidopsis plants overexpressing SlCDF1 and SlCDF3 showed increased drought and salt tolerance. In addition, various stress-responsive genes, such as AtCOR15, AtRD29A and AtERD10, were expressed differently in these lines. The overexpression of SlCDF3 in Arabidopsis also results in the late flowering phenotype through the modulation of the expression of flowering control genes such CONSTANS (CO) and FLOWERING LOCUS T (FT). Overall, our data connet SlCDFs to undescribed functions related to abiotic stress tolerance and flowering time through the regulation of specific target genes and an increase in particular metabolites.

Expresión de la resistencia en plantas de tomate a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica)

La resistencia genética mediada por los genes R es uno de los sistemas de defensa de las plantas frente a patógenos y se activa una vez que los patógenos han superado la defensa basal que otorgan la cutícula y pared celular. Los mecanismos de resistencia genética se inician a su vez, por el reconocimiento de productos derivados de genes de avirulencia de los patógenos (avr) por parte de las proteínas R. Tanto la respuesta de defensa basal como la respuesta de defensa por genes R están influenciadas por patrones de regulación hormonal, que incluye a las principales hormonas vegetales ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET). En tomate (Solanum lycopersicum) uno de los genes R es el gen MiG1, que confiere resistencia a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica, M. incognita y M. arenaria). Uno de los eventos más importantes que caracterizan a la respuesta de resistencia es la reacción hipersensible (HR), que está mediada por la activación temprana de una serie de sistemas enzimáticos, entre los que destaca el de las peroxidasas (PRXs) Clase III. Su función es importante tanto para limitar el establecimiento y expansión del nematodo, al generar ambientes altamente tóxicos por su contribución en la producción masiva de ROS, como por su implicación en la síntesis y depósito de lignina generando barreras estructurales en el sitio de infección. Además de estos mecanismos de defensa asociados a la resistencia constitutiva, las plantas pueden desarrollar resistencia sistémica adquirida (SAR) que en la naturaleza ocurre, en ocasiones, en una fase posterior a que la planta haya sufrido el ataque de un patógeno. Así mismo hay diferentes productos de origen químico como el benzotiadiazol o BTH (ácido S-metil benzol-(1,2,3)-tiadiozole-7-carbónico ester) que pueden generar esta misma respuesta SAR. Como resultado, la planta adquiere resistencia sistémica frente a nuevos ataques de patógenos. En este contexto, el presente trabajo aborda en primer lugar el análisis comparativo, mediante microarrays de oligonucleótidos, de los transcriptomas de los sistemas radicales de plantas de tomate de 8 semanas de edad de dos variedades, una portadora del gen de resistencia MiG1 (Motelle) y otra carente del mismo y, por tanto, susceptible (Moneymaker), antes y después de la infección por M. javanica. Previo a la infección se observó que la expresión de un gran número de transcritos era más acusada en la variedad resistente que en la susceptible, entre ellos el propio gen MiG1 o los genes PrG1 (o P4), LEJA1 y ER24, lo que indica que, en ausencia de infección, las rutas hormonales del SA, JA y ET están más activas en la raíz de la variedad resistente. Por el contrario, un número mucho menor de transcritos presentaban su expresión más reducida en Motelle que en Moneymaker, destacando un gen de señalización para sintetizar la hormona giberelina (GA). La infección por M. javanica causa importantes cambios transcripcionales en todo el sistema radical que modifican sustancialmente las diferencias basales entre plantas Motelle y Moneymaker, incluida la sobreexpresión en la variedad resistente de los transcritos de MiG1, que se reduce parcialmente, mientras que las rutas hormonales del SA y el JA continuan más activas que en la susceptible (evidente por los genes PrG1 y LEJA1). Además, los cambios asociados a la infección del nematodo se evidencian por las grandes diferencias entre los dos tiempos post-infección considerados, de tal forma que en la fase temprana (2 dpi) de la interacción compatible predomina la sobreexpresión de genes de pared celular y en la tardía (12 dpi) los relacionados con el ARN. En el análisis de la interacción incompatible, aunque también hay muchas diferencias entre ambas fases, hay que destacar la expresión diferencial común de los genes loxA y mcpi (sobrexpresados) y del gen loxD (reprimido) por su implicación en defensa en otras interacciones planta-patógeno. Cabe destacar que entre las interacciones compatible e incompatible hubo muy pocos genes en común. En la etapa temprana de la interacción compatible destacó la activación de genes de pared celular y la represión de la señalización; en cambio, en la interacción incompatible hubo proteínas principalmente implicadas en defensa. A los 12 días, en la interacción compatible los genes relacionados con el ARN y la pared celular se sobreexpresaban principalmente, y se reprimían los de proteínas y transporte, mientras que en la incompatible se sobreexpresaron los relacionados con el estrés, el metabolismo secundario y el de hormonas y se reprimieron los de ARN, señalización, metabolismo de hormonas y proteínas. Por otra parte, la técnica de silenciamiento génico VIGS reveló que el gen TGA 1a está implicado en la resistencia mediada por el gen MiG1a M. javanica. Así mismo se evaluó el transcriptoma de todo el sistema radical de la variedad susceptible tras la aplicación del inductor BTH, y se comparó con el transcriptoma de la resistente. Los resultados obtenidos revelan que el tratamiento con BTH en hojas de Moneymaker ejerce notables cambios transcripcionales en la raíz; entre otros, la activación de factores de transcripción Myb (THM16 y THM 27) y del gen ACC oxidasa. Las respuestas inducidas por el BTH parecen ser de corta duración ya que no hubo transcritos diferenciales comunes a las dos fases temporales de la infección comparadas (2 y 12 dpi). El transcriptoma de Moneymaker tratada con BTH resultó ser muy diferente al de la variedad resistente Motelle, ambas sin infectar, destacando la mayor expresión en el primero del gen LeEXP2, una expansina relacionada con defensa frente a nematodos. Las respuestas inducidas por los nematodos en Moneymaker-BTH también fueron muy distintas a las observadas previamente en la interacción incompatible mediada por MiG1, pues sólo se detectaron 2 genes sobreexpresados comunes a ambos eventos. Finalmente, se abordó el estudio de la expresión diferencial de genes que codifican PRXs y su relación con la resistencia en la interacción tomate/M. javanica. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio del análisis del transcriptoma de tomate de la interacción compatible, obtenido en un estudio previo a partir de tejido radical infectado en distintos tiempos de infección. Se han identificado 16 unigenes de PRXs con expresión diferencial de los cuales 15 se relacionan por primera vez con la respuesta a la infección de nematodos. La mayoría de los genes de PRXs identificados, 11, aparecen fuertemente reprimidos en el sitio de alimentación, en las células gigantes (CG). Dada la implicación directa de las PRXs en la activación del mecanismo de producción de ROS, la supresión de la expresión génica local de genes de PRXs en el sitio de establecimiento y alimentación pone de manifiesto la capacidad del nematodo para modular y superar la respuesta de defensa de la planta de tomate en la interacción compatible. Posteriormente, de estos genes identificados se han elegido 4: SGN-U143455, SGN-U143841 y SGN-U144042 reprimidos en el sitio de infección y SGN-U144671 inducido, cuyos cambios de expresión se han determinado mediante análisis por qRT-PCR y de hibridación in situ en dos tiempos de infección (2 dpi y 4 dpi) y en distintos tejidos radicales de tomate resistente y susceptible. Los patrones de expresión obtenidos demuestran que en la interacción incompatible la transcripción global de los 4 genes estudiados se dispara en la etapa más temprana en el sitio de infección, detectándose la localización in situ de transcritos en el citoplasma de las células corticales de la zona meristemática afectadas por el nematodo. A 4 dpi se observó que los niveles de expresión en el sitio de infección cambian de tendencia y los genes SGN-U144671 y SGN-U144042 se reprimen significativamente. Los diferentes perfiles de expresión de los genes PRXs en los dos tiempos de infección sugieren que su inducción en las primeras 48 horas es crucial para la respuesta de defensa relacionada con la resistencia frente a la invasión del nematodo. Por último, al analizar el tejido radical sistémico, se detectó una inducción significativa de la expresión en la fase más tardía de la infección del gen SGN-U144042 en el genotipo susceptible y del SGN-U143841 en ambos genotipos. En este estudio se describe por primera vez la inducción de la expresión sistémica de genes de PRXs en tomate durante la interacción compatible e incompatible con M. javanica lo que sugiere su posible implicación funcional en la respuesta de defensa SAR activada por la infección previa del nematodo. ABSTRACT Plants defend themselves from pathogens by constitutive and/or induced defenses. A common type of induced defense involves plant resistance genes (R), which are normally activated in response to attack by specific pathogen species. Typically, a specific plant R protein recognizes a specific pathogen avirulence (avr) compound. This initiates a complex biochemical cascade inside the plant that results in synthesis of antipathogen compounds. This response can involve chemical signaling, transcription, translation, enzymes and metabolism, and numerous plant hormones such as salicylic acid (SA), jasmonates (JA) and ethylene (ET). Induced plant defense can also activate Class III peroxidases (PRXs), which produce reactive oxygen species (ROS), regulate extracellular H2O2, and play additional roles in plant defense. R-gene activation and the resulting induced defense often remain localized in the specific tissues invaded by the plant pathogen. In other cases, the plant responds by signaling the entire plant to produce defense compounds (systemic induction). Plant defense can also be induced by the exogenous application of natural or synthetic elicitors, such as benzol-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothionic acid. There is much current scientific interest in R-genes and elicitors, because they might be manipulated to increase agricultural yield. Scientists also are interested in systemic induction, because this allows the entire plant to be defended. In this context, one of the aims of this investigation was the transcriptoma analysis of the root systems of two varieties of tomato, the resistant variety (Motelle) that carrier MiG1 and the susceptible (Moneymaker) without MiG1, before and after infection with M. javanica. The overexpression was more pronounced in the transcriptoma of the resistant variety compared with susceptible, before infection, including the MiG1 gene, PrG1 (or P4) genes, LEJA1 and ER24, indicating that hormone SA, JA and ET are active in the resistant variety. Moreover, GA hormone presents an opposite behavior. M. javanica infection causes significant transcriptional changes in both compatible (Moneymaker-M. javanica) and incompatible (Motelle-M. javanica) interaction. In the incompatible transcriptome root system, was notably reduced the expression of the MiG1 gene, and a continuity in the expression of the hormonal pathways of SA and JA. In other hand, transcriptional profile changes during compatible interaction were associated with nematode infection. The large differences between the two times point infection considered (2 dpi and 12 dpi) indicates an overexpression of cell wall related genes in the first phase, and conversely an overexpression of RNA genes in the late phase. Transcriptoma analysis of incompatible interaction, although there were differences between the two phases, should be highlighted the common differential gene expression: loxA and mcpi (overexpressed) and loxD gene (suppressed), as they are involved in defenses in other plant-pathogen interactions. The VIGS tool has provided evidence that TGA 1a is involved in MiG1 mediated resistance to M. javanica. Likewise, the systemic application of BTH was assessed and compared with susceptible and resistant variety. Root system transcriptoma of BTH treatment on leaves showed the activation of Myb transcription factors (THM16 and THM27), the ACC oxidase gene. and the LeEXP2 gene, encoding for an expansin enzyme, related with defense against nematodes. The activation appears to be reduced by subsequent infection and establishment of nematodes. To assist in elucidate the role of tomato PRXs in plant defence against M. javanica, the transcriptome obtained previously from isolated giant cells (GC) and galls at 3 and 7 dpi from the compatible interaction was analysed. A total of 18 different probes corresponding to 16 PRX encoding genes were differentially expressed in infection site compared to the control uninfected root tissues. Most part of them (11) was down-regulated. These results yielded a first insight on 15 of the PRX genes responding to tomato–Meloidogyne interaction and confirm that repression of PRX genes might be crucial for feeding site formation at the initial stages of infection. To study the involvement of PRX genes in resistance response, four genes have been selected: SGN-U143455, SGN-U143841 and SGN-U144042 consistently down-regulated and SGN-U144671 consistently up-regulated at infection site in compatible interaction. The expression changes were determined by qRT-PCR and in situ location at 2 dpi and 4 dpi, and in different root tissues of resistant and susceptible plants. Early upon infection (2 dpi), the transcripts levels of the four genes were strongly increased in infected tissue of resistant genotype. In situ hybridization showed transcript accumulation of them in meristem cortical cells, where the nematode made injury. The results obtained provide strong evidence that early induction of PRX genes is important for defence response of the resistance against nematode invasion. Moreover, the induction patterns of SGN-U144042 gene observed at 4 dpi in distal noninfected root tissue into the susceptible genotype and of SGN-U143841 gene in both genotypes suggest a potential involvement of PRX in the systemic defence response.

Influencia de la alimentación sobre los rendimientos productivos en el cebo de conejos

La formulación de un pienso de conejos en crecimiento persigue maximizar los rendimientos productivos (índice de conversión, velocidad de crecimiento y rendimiento a la canal) y limitar la incidencia de trastornos digestivos. Las necesidades de los principales ?principios inmediatos/nutrientes? están bien establecidas (Tabla 1) para el periodo global de cebo, y permiten optimizar los rendimientos productivos en granjas libres de enteropatía epizoótica o que utilicen antibióticos. Sin embargo, la gran incidencia de esta enfermedad durante las dos semanas posteriores al destete ha obligado a profundizar en la fisiología digestiva de los gazapos durante este periodo para tratar de establecer recomendaciones nutricionales que se ajusten mejor sus necesidades, al igual que sucede con lechones y pollos de primera edad.

New insights into the regulation of NADPH oxidase dependent reactive oxygen species signaling during the plant immune response

Las NADPH oxidasas de plantas, denominadas “respiratory burst oxidase homologues” (RBOHs), producen especies reactivas del oxígeno (ROS) que median un amplio rango de funciones. En la célula vegetal, el ajuste preciso de la producción de ROS aporta la especificidad de señal para generar una respuesta apropiada ante las amenazas ambientales. RbohD y RbohF, dos de los diez genes Rboh de Arabidopsis, son pleiotrópicos y median diversos procesos fisiológicos en respuesta a patógenos. El control espacio-temporal de la expresión de los genes RbohD y RbohF podría ser un aspecto crítico para determinar la multiplicidad de funciones de estas oxidasas. Por ello, generamos líneas transgénicas de Arabidopsis con fusiones de los promoters de RbohD y RbohF a los genes delatores de la B-glucuronidasa y la luciferasa. Estas líneas fueron empleadas para revelar el patrón de expresión diferencial de RbohD y RbohF durante la respuesta inmune de Arabidopsis a la bacteria patógena Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, el hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina y en respuesta a señales relacionadas con la respuesta inmune. Nuestros experimentos revelan un patrón de expresión diferencial de los promotores de RbohD y RbohF durante el desarrollo de la planta y en la respuesta inmune de Arabidopsis. Además hemos puesto de manifiesto que existe una correlación entre el nivel de actividad de los promotores de RbohD y RbohF con la acumulación de ROS y el nivel de muerte celular en respuesta a patógenos. La expression de RbohD y RbohF también es modulada de manera diferencial en respuesta a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y por ácido abscísico (ABA). Cabe destacar que, mediante una estrategia de intercambio de promotores, hemos revelado que la región promotora de RbohD, es necesaria para dirigir la producción de ROS en respuesta a P. cucumerina. Adicionalmente, la activación del promotor de RbohD en respuesta al aislado de P. cucumerina no adaptado a Arabidopsis 2127, nos llevó a realizar ensayos de susceptibilidad con el doble mutante rbohD rbohF que han revelado un papel desconocido de estas oxidasas en resistencia no-huesped. La interacción entre la señalización dependiente de las RBOHs y otros componentes de la respuesta inmune de plantas podría explicar también las distintas funciones que median estas oxidasas en relación con la respuesta inmune. Entre la gran cantidad de señales coordinadas con la actividad de las RBOHs, existen evidencias genéticas y farmacológicas que indican que las proteínas G heterotriméricas están implicadas en algunas de las rutas de señalización mediadas por ROS derivadas de los RBOHs en respuesta a señales ambientales. Por ello hemos estudiado la relación entre estas RBOH-NADPH oxidasas y AGB1, la subunidad β de las proteínas G heterotriméricas en la respuesta inmune de Arabidopsis. Análisis de epistasis indican que las proteínas G heterotriméricas están implicadas en distintas rutas de señalización en defensa mediadas por las RBOHs. Nuestros resultados ilustran la relación compleja entre la señalización mediada por las RBOHs y las proteínas G heterotriméricas, que varía en función de la interacción planta-patógeno analizada. Además, hemos explorado la posible asociación entre AGB1 con RBOHD y RBOHF en eventos tempranos de la respuesta immune. Cabe señalar que experimentos de coímmunoprecipitación apuntan a una posible asociación entre AGB1 y la kinasa citoplasmática reguladora de RBOHD, BIK1. Esto indica un posible mecanismo de control de la función de esta NADPH oxidase por AGB1. En conjunto, estos datos aportan nuevas perspectivas sobre cómo, a través del control transcripcional o mediante la interacción con las proteínas G heterotriméricas, las NADPH oxidases de plantas median la producción de ROS y la señalización por ROS en la respuesta inmune. Nuestro trabajo ejemplifica cómo la regulación diferencial de dos miembros de una familia multigénica, les permite realizar distintas funciones fisiológicas especializadas usando un mismo mecanismo enzimático. ABSTRACT The plant NADPH oxidases, termed respiratory burst oxidase homologues (RBOHs), produce reactive oxygen species (ROS) which mediate a wide range of functions. Fine tuning this ROS production provides the signaling specificity to the plant cell to produce the appropriate response to environmental threats. RbohD and RbohF, two of the ten Rboh genes present in Arabidopsis, are pleiotropic and mediate diverse physiological processes in response to pathogens. One aspect that may prove critical to determine the multiplicity of functions of RbohD and RbohF is the spatio-temporal control of their gene expression. Thus, we generated Arabidopsis transgenic lines with RbohD- and RbohF-promoter fusions to the β-glucuronidase and the luciferase reporter genes. These transgenics were employed to reveal RbohD and RbohF promoter activity during Arabidopsis immune response to the pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina and in response to immunity-related cues. Our experiments revealed a differential expression pattern of RbohD and RbohF throughout plant development and during Arabidopsis immune response. Moreover, we observed a correlation between the level of RbohD and RbohF promoter activity, the accumulation of ROS and the amount of cell death in response to pathogens. RbohD and RbohF gene expression was also differentially modulated by pathogen associated molecular patterns and abscisic acid. Interestingly, a promoter-swap strategy revealed the requirement for the promoter region of RbohD to drive the production of ROS in response to P. cucumerina. Additionally, since the RbohD promoter was activated during Arabidopsis interaction with a non-adapted P. cucumerina isolate 2127, we performed susceptibility tests to this fungal isolate that uncovered a new role of these oxidases on non-host resistance. The interplay between RBOH-dependent signaling with other components of the plant immune response might also explain the different immunity-related functions mediated by these oxidases. Among the plethora of signals coordinated with RBOH activity, pharmacological and genetic evidence indicates that heterotrimeric G proteins are involved in some of the signaling pathways mediated by RBOH–derived ROS in response to environmental cues. Therefore, we analysed the interplay between these RBOH-NADPH oxidases and AGB1, the Arabidopsis β-subunit of heterotrimeric G proteins during Arabidopsis immune response. We carried out epistasis studies that allowed us to test the implication of AGB1 in different RBOH-mediated defense signaling pathways. Our results illustrate the complex relationship between RBOH and heterotrimeric G proteins signaling, that varies depending on the type of plant-pathogen interaction. Furthermore, we tested the potential association between AGB1 with RBOHD and RBOHF during early immunity. Interestingly, our co-immunoprecipitation experiments point towards an association of AGB1 and the RBOHD regulatory kinase BIK1, thus providing a putative mechanism in the control of the NADPH oxidase function by AGB1. Taken all together, these studies provide further insights into the role that transcriptional control or the interaction with heterotrimeric G-proteins have on RBOH-NADPH oxidase-dependent ROS production and signaling in immunity. Our work exemplifies how, through a differential regulation, two members of a multigenic family achieve specialized physiological functions using a common enzymatic mechanism.