Transcriptional changes and oxidative stress associated with the synergistic interaction between potato virus X and potato virus Y and their relationship with symptom expression.

Many virus diseases of economic importance to agriculture result from mixtures of different pathogens invading the host at a given time. This contrasts with the relatively scarce studies available on the molecular events associated with virus---host interactions in mixed infections. Compared with single infections, co-infection of Nicotiana benthamiana with Potato virus X (PVX) and Potato virus Y (PVY) resulted in increased systemic symptoms (synergism) that led to necrosis of the newly emerging leaves and death of the plant. A comparative transcriptional analysis was undertaken to identify quantitative and qualitative differences in gene expression during this synergistic infection and correlate these changes with the severe symptoms it caused. Global transcription profiles of doubly infected leaves were compared with those from singly infected leaves using gene ontology enrichment analysis and metabolic pathway annotator software. Functional gene categories altered by the double infection comprise suites of genes regulated coordinately, which are associated with chloroplast functions (downregulated), protein synthesis and degradation (upregulated), carbohydrate metabolism (upregulated), and response to biotic stimulus and stress (upregulated). The expressions of reactive oxygen species?generating enzymes as well as several mitogen-activated protein kinases were also significantly induced. Accordingly, synergistic infection induced a severe oxidative stress in N. benthamiana leaves, as judged by increases in lipid peroxidation and by the generation of superoxide radicals in chloroplasts, which correlated with the misregulation of antioxidative genes in microarray data. Interestingly, expression of genes encoding oxylipin biosynthesis was uniquely upregulated by the synergistic infection. Virus-induced gene silencing of ?-dioxygenase1 delayed cell death during PVX?PVY infection.

Caracterización de la necrosis sistémica inducida por la interacción sinérgica entre el Virus X de la patata y potyvirus en Nicotiana benthamiana

Los virus de plantas pueden causar enfermedades severas que conllevan serias pérdidas económicas a nivel mundial. Además, en la naturaleza son comunes las infecciones simultáneas con distintos virus que conducen a la exacerbación de los síntomas de enfermedad, fenómeno al que se conoce como sinergismo viral. Una de las sintomatologías más severas causadas por los virus en plantas susceptibles es la necrosis sistémica (NS), que incluso puede conducir a la muerte del huésped. Este fenotipo ha sido comparado en ocasiones con la respuesta de resistencia de tipo HR, permitiendo establecer una serie de paralelismos entre ambos tipos de respuesta que sugieren que la NS producida en interacciones compatibles sería el resultado de una respuesta hipersensible sistémica (SHR). Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de la NS, su relación con procesos de defensa antiviral o su relevancia biológica aún no son bien entendidos, al igual que tampoco han sido estudiados los cambios producidos en la planta a escala genómica en infecciones múltiples que muestran sinergismo en patología. En esta tesis doctoral se han empleado distintas aproximaciones de análisis de expresión génica, junto con otras técnicas genéticas y bioquímicas, en el sistema modelo de Nicotiana benthamiana para estudiar la NS producida por la infección sinérgica entre el Virus X de la patata (PVX) y diversos potyvirus. Se han comparado los cambios producidos en el huésped a nivel genómico y fisiológico entre la infección doble con PVX y el Virus Y de la patata (PVY), y las infecciones simples con PVX o PVY. Además, los cambios transcriptómicos y hormonales asociados a la infección con la quimera viral PVX/HC‐Pro, que reproduce los síntomas del sinergismo entre PVX‐potyvirus, se han comparado con aquellos producidos por otros dos tipos de muerte celular, la PCD ligada a una interacción incompatible y la PCD producida por la disfunción del proteasoma. Por último, técnicas de genética reversa han permitido conocer la implicación de factores del huésped, como las oxilipinas, en el desarrollo de la NS asociada al sinergismo entre PVXpotyvirus. Los resultados revelan que, respecto a las infecciones con solo uno de los virus, la infección doble con PVX‐PVY produce en el huésped diferencias cualitativas además de cuantitativas en el perfil transcriptómico relacionado con el metabolismo primario. Otros cambios en la expresión génica, que reflejan la activación de mecanismos de defensa, correlacionan con un fuerte estrés oxidativo en las plantas doblemente infectadas que no se detecta en las infecciones simples. Además, medidas en la acumulación de determinados miRNAs implicados en diversos procesos celulares muestran como la infección doble altera de manera diferencial tanto la acumulación de estos miRNAs como su funcionalidad, lo cual podría estar relacionado con los cambios en el transcriptoma, así como con la sintomatología de la infección. La comparación a nivel transcriptómico y hormonal entre la NS producida por PVX/HC‐Pro y la interacción incompatible del Virus del mosaico del tabaco en plantas que expresan el gen N de resistencia (SHR), muestra que la respuesta en la interacción compatible es similar a la que se produce durante la SHR, si bien se presenta de manera retardada en el tiempo. Sin embargo, los perfiles de expresión de genes de defensa y de respuesta a hormonas, así como la acumulación relativa de ácido salicílico (SA), ácido jasmonico (JA) y ácido abscísico, en la interacción compatible son más semejantes a la respuesta PCD producida por la disfunción del proteasoma que a la interacción incompatible. Estos datos sugieren una contribución de la interferencia sobre la funcionalidad del proteasoma en el incremento de la patogenicidad, observado en el sinergismo PVX‐potyvirus. Por último, los resultados obtenidos al disminuir la expresión de 9‐LOX, α‐DOX1 y COI1, relacionados con la síntesis o con la señalización de oxilipinas, y mediante la aplicación exógena de JA y SA, muestran la implicación del metabolismo de las oxilipinas en el desarrollo de la NS producida por la infección sinérgica entre PVXpotyvirus en N. benthamiana. Además, estos resultados indican que la PCD asociada a esta infección, al igual que ocurre en interacciones incompatibles, no contiene necesariamente la acumulación viral, lo cual indica que necrosis e inhibición de la multiplicación viral son procesos independientes. ABSTRACT Plant viruses cause severe diseases that lead to serious economic losses worldwide. Moreover, simultaneous infections with several viruses are common in nature leading to exacerbation of the disease symptoms. This phenomenon is known as viral synergism. Systemic necrosis (SN) is one of the most severe symptoms caused by plant viruses in susceptible plants, even leading to death of the host. This phenotype has been compared with the hypersensitive response (HR) displayed by resistant plants, and some parallelisms have been found between both responses, which suggest that SN induced by compatible interactions could be the result of a systemic hypersensitive response (SHR). However, the molecular mechanisms involved in the development of SN, its relationship with antiviral defence processes and its biological relevance are still unknown. Furthermore, the changes produced in plants by mixed infections that cause synergistic pathological effects have not been studied in a genome‐wide scale. In this doctoral thesis different approaches have been used to analyse gene expression, together with other genetic and biochemical techniques, in the model plant Nicotiana benthamiana, in order to study the SN produced by the synergistic infection of Potato virus X (PVX) with several potyviruses. Genomic and physiological changes produced in the host by double infection with PVX and Potato virus Y (PVY), and by single infection with PVX or PVY have been compared. In addition, transcriptional and hormonal changes associated with infection by the chimeric virus PVX/HC‐Pro, which produces synergistic symptoms similar to those caused by PVX‐potyvirus, have been compared with those produced by other types of cell death. These types of cell death are: PCD associated with an incompatible interaction, and PCD produced by proteasome disruption. Finally, reverse genetic techniques have revealed the involvement of host factors, such as oxylipins, in the development of SN associated with PVX‐potyvirus synergism. The results revealed that compared with single infections, double infection with PVX‐PVY produced qualitative and quantitative differences in the transcriptome profile, mainly related to primary metabolism. Other changes in gene expression, which reflected the activation of defence mechanisms, correlated with a severe oxidative stress in doubly infected plants that was undetected in single infections. Additionally, accumulation levels of several miRNAs involved in different cellular processes were measured, and the results showed that double infection not only produced the greatest variations in miRNA accumulation levels but also in miRNA functionality. These variations could be related with transcriptomic changes and the symptomatology of the infection. Transcriptome and hormone level comparisons between SN induced by PVX/HCPro and the incompatible interaction produced by Tobacco mosaic virus in plants expressing the N resistance gene (SHR), showed some similarities between both responses, even though the compatible interaction appeared retarded in time. Nevertheless, the expression profiles of both defence‐related genes and hormoneresponsive genes, as well as the relative accumulation of salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) and abscisic acid in the compatible interaction are more similar to the PCD response produced by proteasome disruption. These data suggest that interference with proteasome functionality contributes to the increase in pathogenicity associated with PVX‐potyvirus synergism. Finally, the results obtained by reducing the expression of 9‐LOX, α‐DOX1 and COI1, related with synthesis or signalling of oxylipins, and by applying exogenously JA and SA, revealed that oxylipin metabolism is involved in the development of SN induced by PVX‐potyvirus synergistic infections in N. benthamiana. Moreover, these results also indicated that PVX‐potyvirus associated PCD does not necessarily restrict viral accumulation, as is also the case in incompatible interactions. This indicates that both necrosis and inhibition of viral multiplication are independent processes.

Ecological and genetic determinants of Pepino mosaic virus emergence

Virus emergence is a complex phenomenon, which generally involves spread to a new host from a wild host, followed by adaptation to the new host. Although viruses account for the largest fraction of emerging crop pathogens, knowledge about their emergence is incomplete. We address here the question of whether Pepino mosaic virus (PepMV) emergence as a major tomato pathogen worldwide could have involved spread from wild to cultivated plant species and host adaptation. For this, we surveyed natural populations of wild tomatoes in southern Peru for PepMV infection. PepMV incidence, genetic variation, population structure, and accumulation in various hosts were analyzed. PepMV incidence in wild tomatoes was high, and a strain not yet reported in domestic tomato was characterized. This strain had a wide host range within the Solanaceae, multiplying efficiently in most assayed Solanum species and being adapted to wild tomato hosts. Conversely, PepMV isolates from tomato crops showed evidence of adaptation to domestic tomato, possibly traded against adaptation to wild tomatoes. Phylogenetic reconstructions indicated that the most probable ancestral sequence came from a wild Solanum species. A high incidence of PepMV in wild tomato relatives would favor virus spread to crops and its efficient multiplication in different Solanum species, including tomato, allowing its establishment as an epidemic pathogen. Later, adaptation to tomato, traded off against adaptation to other Solanum species, would isolate tomato populations from those in other hosts.

Compromisos en la adaptación a distintos huéspedes en virus de plantas

Los patógenos han desarrollado estrategias para sobrevivir en su entorno, infectar a sus huéspedes, multiplicarse dentro de estos y posteriormente transmitirse a otros huéspedes. Todos estos componentes hacen parte de la eficacia biológica de los patógenos, y les permiten ser los causantes de enfermedades infecciosas tanto en hombres y animales, como en plantas. El proceso de infección produce efectos negativos en la eficacia biológica del huésped y la gravedad de los efectos, dependerá de la virulencia del patógeno. Por su parte, el huésped ha desarrollado mecanismos de respuesta en contra del patógeno, tales como la resistencia, por la que reduce la multiplicación del patógeno, o la tolerancia, por la que disminuye el efecto negativo de la infección. Estas respuestas del huésped a la infección producen efectos negativos en la eficacia biológica del patógeno, actuando como una presión selectiva sobre su población. Si la presión selectiva sobre el patógeno varía según el huésped, se predice que un mismo patógeno no podrá aumentar su eficacia biológica en distintos huéspedes y estará más adaptado a un huésped y menos a otro, disminuyendo su gama de huéspedes. Esto supone que la adaptación de un patógeno a distintos huéspedes estará a menudo dificultada por compromisos (trade-off) en diferentes componentes de la eficacia biológica del patógeno. Hasta el momento, la evidencia de compromisos de la adaptación del patógeno a distintos huéspedes no es muy abundante, en lo que se respecta a los virus de plantas. En las últimas décadas, se ha descrito un aumento en la incidencia de virus nuevos o previamente descritos que producen enfermedades infecciosas con mayor gravedad y/o diferente patogenicidad, como la infección de huéspedes previamente resistentes. Esto se conoce como la emergencia de enfermedades infecciosas y está causada por patógenos emergentes, que proceden de un huésped reservorio donde se encuentran adaptados. Los huéspedes que actúan como reservorios pueden ser plantas silvestres, que a menudo presentan pocos síntomas o muy leves a pesar de estar infectados con diferentes virus, y asimismo se encuentran en ecosistemas con ninguna o poca intervención humana. El estudio de los factores ecológicos y biológicos que actúan en el proceso de la emergencia de enfermedades infecciosas, ayudará a entender sus causas para crear estrategias de prevención y control. Los virus son los principales patógenos causales de la emergencia de enfermedades infecciosas en humanos, animales y plantas y un buen modelo para entender los procesos de la emergencia. Asimismo, las plantas a diferencia de los animales, son huéspedes fáciles de manipular y los virus que las afectan, más seguros para el trabajo en laboratorio que los virus de humanos y animales, otros modelos también usados en la investigación. Por lo tanto, la interacción virus – planta es un buen modelo experimental para el estudio de la emergencia de enfermedades infecciosas. El estudio de la emergencia de virus en plantas tiene también un interés particular, debido a que los virus pueden ocasionar pérdidas económicas en los cultivos agrícolas y poner en riesgo la durabilidad de la resistencia de plantas mejoradas, lo que supone un riesgo en la seguridad alimentaria con impactos importantes en la sociedad, comparables con las enfermedades infecciosas de humanos y animales domésticos. Para que un virus se convierta en un patógeno emergente debe primero saltar desde su huésped reservorio a un nuevo huésped, segundo adaptarse al nuevo huésped hasta que la infección dentro de la población de éste se vuelva independiente del reservorio y finalmente debe cambiar su epidemiología. En este estudio, se escogió la emergencia del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) en el tomate, como modelo experimental para estudiar la emergencia de un virus en una nueva especie de huésped, así como las infecciones de distintos genotipos del virus del moteado atenuado del pimiento (PMMoV) en pimiento, para estudiar la emergencia de un virus que aumenta su patogenicidad en un huésped previamente resistente. El estudio de ambos patosistemas nos permitió ampliar el conocimiento sobre los factores ecológicos y evolutivos en las dos primeras fases de la emergencia de enfermedades virales en plantas. El PepMV es un patógeno emergente en cultivos de tomate (Solanum lycopersicum) a nivel mundial, que se describió primero en 1980 infectando pepino dulce (Solanum muricatum L.) en Perú, y casi una década después causando una epidemia en cultivos de tomate en Holanda. La introducción a Europa posiblemente fue a través de semillas infectadas de tomate procedentes de Perú, y desde entonces se han descrito nuevos aislados que se agrupan en cuatro cepas (EU, LP, CH2, US1) que infectan a tomate. Sin embargo, el proceso de su emergencia desde pepino dulce hasta tomate es un interrogante de gran interés, porque es uno de los virus emergentes más recientes y de gran importancia económica. Para la emergencia de PepMV en tomate, se recolectaron muestras de tomate silvestre procedentes del sur de Perú, se analizó la presencia y diversidad de aislados de PepMV y se caracterizaron tanto biológicamente (gama de huéspedes), como genéticamente (secuencias genomicas). Se han descrito en diferentes regiones del mundo aislados de PMMoV que han adquirido la capacidad de infectar variedades previamente resistentes de pimiento (Capsicum spp), es decir, un típico caso de emergencia de virus que implica la ampliación de su gama de huéspedes y un aumento de patogenicidad. Esto tiene gran interés, ya que compromete el uso de variedades resistentes obtenidas por mejora genética, que es la forma de control de virus más eficaz que existe. Para estudiar la emergencia de genotipos altamente patogénicos de PMMoV, se analizaron clones biológicos de PMMoV procedentes de aislados de campo cuya patogenicidad era conocida (P1,2) y por mutagénesis se les aumentó la patogenicidad (P1,2,3 y P1,2,3,4), introduciendo las mutaciones descritas como responsables de estos fenotipos. Se analizó si el aumento de la patogenicidad conlleva un compromiso en la eficacia biológica de los genotipos de PMMoV. Para ello se evaluaron diferentes componentes de la eficacia biológica del virus en diferentes huéspedes con distintos alelos de resistencia. Los resultados de esta tesis demuestran: i). El potencial de las plantas silvestres como reservorios de virus emergentes, en este caso tomates silvestres del sur de Perú, así como la existencia en estas plantas de aislados de PepMV de una nueva cepa no descrita que llamamos PES. ii) El aumento de la gama de huéspedes no es una condición estricta para la emergencia de los virus de plantas. iii) La adaptación es el mecanismo más probable en la emergencia de PepMV en tomate cultivado. iv) El aumento de la patogenicidad tiene un efecto pleiotrópico en distintos componentes de la eficacia biológica, así mismo el signo y magnitud de este efecto dependerá del genotipo del virus, del huésped y de la interacción de estos factores. ABSTRACT host Pathogens have evolved strategies to survive in their environment, infecting their hosts, multiplying inside them and being transmitted to other hosts. All of these components form part of the pathogen fitness, and allow them to be the cause of infectious diseases in humans, animals, and plants. The infection process produces negative effects on the host fitness and the effects severity will depend on the pathogen virulence. On the other hand, hosts have developed response mechanisms against pathogens such as resistance, which reduces the growth of pathogens, or tolerance, which decreases the negative effects of infection. T he se responses of s to infection cause negative effects on the pathogen fitness, acting as a selective pressure on its population. If the selective pressures on pathogens va ry according to the host s , probably one pathogen cannot increase its fitness in different hosts and will be more adapted to one host and less to another, decreasing its host range. This means that the adaptation of one pathogen to different hosts , will be often limited by different trade - off components of biological effectiveness of pathogen. Nowadays , trade - off evidence of pathogen adaptation to different hosts is not extensive, in relation with plant viruses. In last decades, an increase in the incidence of new or previously detected viruses has been described, causing infectious diseases with increased severity and/or different pathogenicity, such as the hosts infection previously resistants. This is known as the emergence of infectious diseases and is caused by emerging pathogens that come from a reservoir host where they are adapted. The hosts which act as reservoirs can be wild plants, that often have few symptoms or very mild , despite of being infected with different viruses, and being found in ecosystems with little or any human intervention. The study of ecological and biological factors , acting in the process of the infectious diseases emergence will help to understand its causes to create strategies for its prevention and control. Viruses are the main causative pathogens of the infectious diseases emergence in humans, animals and plants, and a good model to understand the emergency processes. Likewise, plants in contrast to animals are easy host to handle and viruses that affect them, safer for laboratory work than viruses of humans and animals, another models used in research. Therefore, the interaction plant-virus is a good experimental model for the study of the infectious diseases emergence. The study of virus emergence in plants also has a particular interest, because the viruses can cause economic losses in agricultural crops and threaten the resistance durability of improved plants, it suppose a risk for food security with significant impacts on society, comparable with infectious diseases of humans and domestic animals. To become an emerging pathogen, a virus must jump first from its reservoir host to a new host, then adapt to a new host until the infection within the population becomes independent from the reservoir, and finally must change its epidemiology. In this study, the emergence of pepino mosaic virus (PepMV) in tomato, was selected as experimental model to study the emergence of a virus in a new host specie, as well as the infections of different genotypes of pepper mild mottle virus (PMMoV) in pepper, to study the emergence of a virus that increases its pathogenicity in a previously resistant host. The study of both Pathosystems increased our knowledge about the ecological and evolutionary factors in the two first phases of the emergence of viral diseases in plants. The PepMV is an emerging pathogen in tomato (Solanum lycopersicum L.) in the world, which was first described in 1980 by infecting pepino (Solanum muricatum L.) in Peru, and almost after a decade caused an epidemic in tomato crops in Netherlands. The introduction to Europe was possibly through infected tomato seeds from Peru, and from then have been described new isolates that are grouped in four strains (EU, LP, CH2, US1) that infect tomato. However, the process of its emergence from pepino up tomato is a very interesting question, because it is one of the newest emerging viruses and economically important. For the PepMV emergence in tomato, wild tomato samples from southern Peru were collected, and the presence and diversity of PepMV isolates were analyzed and characterized at biological (host range) and genetics (genomic sequences) levels. Isolates from PMMoV have been described in different world regions which have acquired the ability to infect pepper varieties that were previously resistants (Capsicum spp), it means, a typical case of virus emergence which involves the host range extension and an increased pathogenicity. This is of great interest due to involve the use of resistant varieties obtained by breeding, which is the most effective way to control virus. To study the emergence of highly pathogenic genotypes of PMMoV, biological clones from field isolates whose pathogenicity was known were analyzed (P1,2) and by mutagenesis we increased its pathogenicity (P1,2,3 and P1,2, 3,4), introducing the mutations described as responsible for these phenotypes. We analyzed whether the increased pathogenicity involves a trade-off in fitness of PMMoV genotypes. For this aim, different components of virus fitness in different hosts with several resistance alleles were evaluated. The results of this thesis show: i). The potential of wild plants as reservoirs of emerging viruses, in this case wild tomatoes in southern Peru, and the existence in these plants of PepMV isolates of a new undescribed strain that we call PES. ii) The host range expansion is not a strict condition for the plant virus emergence. iii) The adaptation is the most likely mechanism in the PepMV emergence in cultivated tomato. iv) The increased pathogenicity has a pleiotropic effect on several fitness components, besides the sign and magnitude of this effect depends on the virus genotype, the host and the interaction of both.