Evaluation of cover crops based on characteristics of nitrogen use, and aerial and root growth

La caracterización de los cultivos cubierta (cover crops) puede permitir comparar la idoneidad de diferentes especies para proporcionar servicios ecológicos como el control de la erosión, el reciclado de nutrientes o la producción de forrajes. En este trabajo se estudiaron bajo condiciones de campo diferentes técnicas para caracterizar el dosel vegetal con objeto de establecer una metodología para medir y comparar las arquitecturas de los cultivos cubierta más comunes. Se estableció un ensayo de campo en Madrid (España central) para determinar la relación entre el índice de área foliar (LAI) y la cobertura del suelo (GC) para un cultivo de gramínea, uno de leguminosa y uno de crucífera. Para ello se sembraron doce parcelas con cebada (Hordeum vulgare L.), veza (Vicia sativa L.), y colza (Brassica napus L.). En 10 fechas de muestreo se midieron el LAI (con estimaciones directas y del LAI-2000), la fracción interceptada de la radiación fotosintéticamente activa (FIPAR) y la GC. Un experimento de campo de dos años (Octubre-Abril) se estableció en la misma localización para evaluar diferentes especies (Hordeum vulgare L., Secale cereale L., x Triticosecale Whim, Sinapis alba L., Vicia sativa L.) y cultivares (20) en relación con su idoneidad para ser usadas como cultivos cubierta. La GC se monitorizó mediante análisis de imágenes digitales con 21 y 22 muestreos, y la biomasa se midió 8 y 10 veces, respectivamente para cada año. Un modelo de Gompertz caracterizó la cobertura del suelo hasta el decaimiento observado tras las heladas, mientras que la biomasa se ajustó a ecuaciones de Gompertz, logísticas y lineales-exponenciales. Al final del experimento se determinaron el C, el N y el contenido en fibra (neutrodetergente, ácidodetergente y lignina), así como el N fijado por las leguminosas. Se aplicó el análisis de decisión multicriterio (MCDA) con objeto de obtener un ranking de especies y cultivares de acuerdo con su idoneidad para actuar como cultivos cubierta en cuatro modalidades diferentes: cultivo de cobertura, cultivo captura, abono verde y forraje. Las asociaciones de cultivos leguminosas con no leguminosas pueden afectar al crecimiento radicular y a la absorción de N de ambos componentes de la mezcla. El conocimiento de cómo los sistemas radiculares específicos afectan al crecimiento individual de las especies es útil para entender las interacciones en las asociaciones, así como para planificar estrategias de cultivos cubierta. En un tercer ensayo se combinaron estudios en rhizotrones con extracción de raíces e identificación de especies por microscopía, así como con estudios de crecimiento, absorción de N y 15N en capas profundas del suelo. Las interacciones entre raíces en su crecimiento y en el aprovisionamiento de N se estudiaron para dos de los cultivares mejor valorados en el estudio previo: uno de cebada (Hordeum vulgare L. cv. Hispanic) y otro de veza (Vicia sativa L. cv. Aitana). Se añadió N en dosis de 0 (N0), 50 (N1) y 150 (N2) kg N ha-1. Como resultados del primer estudio, se ajustaron correctamente modelos lineales y cuadráticos a la relación entre la GC y el LAI para todos los cultivos, pero en la gramínea alcanzaron una meseta para un LAI>4. Antes de alcanzar la cobertura total, la pendiente de la relación lineal entre ambas variables se situó en un rango entre 0.025 y 0.030. Las lecturas del LAI-2000 estuvieron correlacionadas linealmente con el LAI, aunque con tendencia a la sobreestimación. Las correcciones basadas en el efecto de aglutinación redujeron el error cuadrático medio del LAI estimado por el LAI-2000 desde 1.2 hasta 0.5 para la crucífera y la leguminosa, no siendo efectivas para la cebada. Esto determinó que para los siguientes estudios se midieran únicamente la GC y la biomasa. En el segundo experimento, las gramíneas alcanzaron la mayor cobertura del suelo (83-99%) y la mayor biomasa (1226-1928 g m-2) al final del mismo. Con la mayor relación C/N (27-39) y contenido en fibra digestible (53-60%) y la menor calidad de residuo (~68%). La mostaza presentó elevadas GC, biomasa y absorción de N en el año más templado en similitud con las gramíneas, aunque escasa calidad como forraje en ambos años. La veza presentó la menor absorción de N (2.4-0.7 g N m-2) debido a la fijación de N (9.8-1.6 g N m-2) y escasa acumulación de N. El tiempo térmico hasta alcanzar el 30% de GC constituyó un buen indicador de especies de rápida cubrición. La cuantificación de las variables permitió hallar variabilidad entre las especies y proporcionó información para posteriores decisiones sobre la selección y manejo de los cultivos cubierta. La agregación de dichas variables a través de funciones de utilidad permitió confeccionar rankings de especies y cultivares para cada uso. Las gramíneas fueron las más indicadas para los usos de cultivo de cobertura, cultivo captura y forraje, mientras que las vezas fueron las mejor como abono verde. La mostaza alcanzó altos valores como cultivo de cobertura y captura en el primer año, pero el segundo decayó debido a su pobre actuación en los inviernos fríos. Hispanic fue el mejor cultivar de cebada como cultivo de cobertura y captura, mientras que Albacete como forraje. El triticale Titania alcanzó la posición más alta como cultiva de cobertura, captura y forraje. Las vezas Aitana y BGE014897 mostraron buenas aptitudes como abono verde y cultivo captura. El MCDA permitió la comparación entre especies y cultivares proporcionando información relevante para la selección y manejo de cultivos cubierta. En el estudio en rhizotrones tanto la mezcla de especies como la cebada alcanzaron mayor intensidad de raíces (RI) y profundidad (RD) que la veza, con valores alrededor de 150 cruces m-1 y 1.4 m respectivamente, comparados con 50 cruces m-1 y 0.9 m para la veza. En las capas más profundas del suelo, la asociación de cultivos mostró valores de RI ligeramente mayores que la cebada en monocultivo. La cebada y la asociación obtuvieron mayores valores de densidad de raíces (RLD) (200-600 m m-3) que la veza (25-130) entre 0.8 y 1.2 m de profundidad. Los niveles de N no mostraron efectos claros en RI, RD ó RLD, sin embargo, el incremento de N favoreció la proliferación de raíces de veza en la asociación en capas profundas del suelo, con un ratio cebada/veza situado entre 25 a N0 y 5 a N2. La absorción de N de la cebada se incrementó en la asociación a expensas de la veza (de ~100 a 200 mg planta-1). Las raíces de cebada en la asociación absorbieron también más nitrógeno marcado de las capas profundas del suelo (0.6 mg 15N planta-1) que en el monocultivo (0.3 mg 15N planta-1). ABSTRACT Cover crop characterization may allow comparing the suitability of different species to provide ecological services such as erosion control, nutrient recycling or fodder production. Different techniques to characterize plant canopy were studied under field conditions in order to establish a methodology for measuring and comparing cover crops canopies. A field trial was established in Madrid (central Spain) to determine the relationship between leaf area index (LAI) and ground cover (GC) in a grass, a legume and a crucifer crop. Twelve plots were sown with either barley (Hordeum vulgare L.), vetch (Vicia sativa L.), or rape (Brassica napus L.). On 10 sampling dates the LAI (both direct and LAI-2000 estimations), fraction intercepted of photosynthetically active radiation (FIPAR) and GC were measured. A two-year field experiment (October-April) was established in the same location to evaluate different species (Hordeum vulgare L., Secale cereale L., x Triticosecale Whim, Sinapis alba L., Vicia sativa L.) and cultivars (20) according to their suitability to be used as cover crops. GC was monitored through digital image analysis with 21 and 22 samples, and biomass measured 8 and 10 times, respectively for each season. A Gompertz model characterized ground cover until the decay observed after frosts, while biomass was fitted to Gompertz, logistic and linear-exponential equations. At the end of the experiment C, N, and fiber (neutral detergent, acid and lignin) contents, and the N fixed by the legumes were determined. Multicriteria decision analysis (MCDA) was applied in order to rank the species and cultivars according to their suitability to perform as cover crops in four different modalities: cover crop, catch crop, green manure and fodder. Intercropping legumes and non-legumes may affect the root growth and N uptake of both components in the mixture. The knowledge of how specific root systems affect the growth of the individual species is useful for understanding the interactions in intercrops as well as for planning cover cropping strategies. In a third trial rhizotron studies were combined with root extraction and species identification by microscopy and with studies of growth, N uptake and 15N uptake from deeper soil layers. The root interactions of root growth and N foraging were studied for two of the best ranked cultivars in the previous study: a barley (Hordeum vulgare L. cv. Hispanic) and a vetch (Vicia sativa L. cv. Aitana). N was added at 0 (N0), 50 (N1) and 150 (N2) kg N ha-1. As a result, linear and quadratic models fitted to the relationship between the GC and LAI for all of the crops, but they reached a plateau in the grass when the LAI > 4. Before reaching full cover, the slope of the linear relationship between both variables was within the range of 0.025 to 0.030. The LAI-2000 readings were linearly correlated with the LAI but they tended to overestimation. Corrections based on the clumping effect reduced the root mean square error of the estimated LAI from the LAI-2000 readings from 1.2 to less than 0.50 for the crucifer and the legume, but were not effective for barley. This determined that in the following studies only the GC and biomass were measured. In the second experiment, the grasses reached the highest ground cover (83- 99%) and biomass (1226-1928 g/m2) at the end of the experiment. The grasses had the highest C/N ratio (27-39) and dietary fiber (53-60%) and the lowest residue quality (~68%). The mustard presented high GC, biomass and N uptake in the warmer year with similarity to grasses, but low fodder capability in both years. The vetch presented the lowest N uptake (2.4-0.7 g N/m2) due to N fixation (9.8-1.6 g N/m2) and low biomass accumulation. The thermal time until reaching 30% ground cover was a good indicator of early coverage species. Variable quantification allowed finding variability among the species and provided information for further decisions involving cover crops selection and management. Aggregation of these variables through utility functions allowed ranking species and cultivars for each usage. Grasses were the most suitable for the cover crop, catch crop and fodder uses, while the vetches were the best as green manures. The mustard attained high ranks as cover and catch crop the first season, but the second decayed due to low performance in cold winters. Hispanic was the most suitable barley cultivar as cover and catch crop, and Albacete as fodder. The triticale Titania attained the highest rank as cover and catch crop and fodder. Vetches Aitana and BGE014897 showed good aptitudes as green manures and catch crops. MCDA allowed comparison among species and cultivars and might provide relevant information for cover crops selection and management. In the rhizotron study the intercrop and the barley attained slightly higher root intensity (RI) and root depth (RD) than the vetch, with values around 150 crosses m-1 and 1.4 m respectively, compared to 50 crosses m-1 and 0.9 m for the vetch. At deep soil layers, intercropping showed slightly larger RI values compared to the sole cropped barley. The barley and the intercropping had larger root length density (RLD) values (200-600 m m-3) than the vetch (25-130) at 0.8-1.2 m depth. The topsoil N supply did not show a clear effect on the RI, RD or RLD; however increasing topsoil N favored the proliferation of vetch roots in the intercropping at deep soil layers, with the barley/vetch root ratio ranging from 25 at N0 to 5 at N2. The N uptake of the barley was enhanced in the intercropping at the expense of the vetch (from ~100 mg plant-1 to 200). The intercropped barley roots took up more labeled nitrogen (0.6 mg 15N plant-1) than the sole-cropped barley roots (0.3 mg 15N plant-1) from deep layers.

Multimodal non-rigid image registration methods for therapy and surgery planning

La planificación pre-operatoria se ha convertido en una tarea esencial en cirugías y terapias de marcada complejidad, especialmente aquellas relacionadas con órgano blando. Un ejemplo donde la planificación preoperatoria tiene gran interés es la cirugía hepática. Dicha planificación comprende la detección e identificación precisa de las lesiones individuales y vasos así como la correcta segmentación y estimación volumétrica del hígado funcional. Este proceso es muy importante porque determina tanto si el paciente es un candidato adecuado para terapia quirúrgica como la definición del abordaje a seguir en el procedimiento. La radioterapia de órgano blando es un segundo ejemplo donde la planificación se requiere tanto para la radioterapia externa convencional como para la radioterapia intraoperatoria. La planificación comprende la segmentación de tumor y órganos vulnerables y la estimación de la dosimetría. La segmentación de hígado funcional y la estimación volumétrica para planificación de la cirugía se estiman habitualmente a partir de imágenes de tomografía computarizada (TC). De igual modo, en la planificación de radioterapia, los objetivos de la radiación se delinean normalmente sobre TC. Sin embargo, los avances en las tecnologías de imagen de resonancia magnética (RM) están ofreciendo progresivamente ventajas adicionales. Por ejemplo, se ha visto que el ratio de detección de metástasis hepáticas es significativamente superior en RM con contraste Gd–EOB–DTPA que en TC. Por tanto, recientes estudios han destacado la importancia de combinar la información de TC y RM para conseguir el mayor nivel posible de precisión en radioterapia y para facilitar una descripción precisa de las lesiones del hígado. Con el objetivo de mejorar la planificación preoperatoria en ambos escenarios se precisa claramente de un algoritmo de registro no rígido de imagen. Sin embargo, la gran mayoría de sistemas comerciales solo proporcionan métodos de registro rígido. Las medidas de intensidad de voxel han demostrado ser criterios de similitud de imágenes robustos, y, entre ellas, la Información Mutua (IM) es siempre la primera elegida en registros multimodales. Sin embargo, uno de los principales problemas de la IM es la ausencia de información espacial y la asunción de que las relaciones estadísticas entre las imágenes son homogéneas a lo largo de su domino completo. La hipótesis de esta tesis es que la incorporación de información espacial de órganos al proceso de registro puede mejorar la robustez y calidad del mismo, beneficiándose de la disponibilidad de las segmentaciones clínicas. En este trabajo, se propone y valida un esquema de registro multimodal no rígido 3D usando una nueva métrica llamada Información Mutua Centrada en el Órgano (Organ-Focused Mutual Information metric (OF-MI)) y se compara con la formulación clásica de la Información Mutua. Esto permite mejorar los resultados del registro en áreas problemáticas incorporando información regional al criterio de similitud, beneficiándose de la disponibilidad real de segmentaciones en protocolos estándares clínicos, y permitiendo que la dependencia estadística entre las dos modalidades de imagen difiera entre órganos o regiones. El método propuesto se ha aplicado al registro de TC y RM con contraste Gd–EOB–DTPA así como al registro de imágenes de TC y MR para planificación de radioterapia intraoperatoria rectal. Adicionalmente, se ha desarrollado un algoritmo de apoyo de segmentación 3D basado en Level-Sets para la incorporación de la información de órgano en el registro. El algoritmo de segmentación se ha diseñado específicamente para la estimación volumétrica de hígado sano funcional y ha demostrado un buen funcionamiento en un conjunto de imágenes de TC abdominales. Los resultados muestran una mejora estadísticamente significativa de OF-MI comparada con la Información Mutua clásica en las medidas de calidad de los registros; tanto con datos simulados (p<0.001) como con datos reales en registro hepático de TC y RM con contraste Gd– EOB–DTPA y en registro para planificación de radioterapia rectal usando OF-MI multi-órgano (p<0.05). Adicionalmente, OF-MI presenta resultados más estables con menor dispersión que la Información Mutua y un comportamiento más robusto con respecto a cambios en la relación señal-ruido y a la variación de parámetros. La métrica OF-MI propuesta en esta tesis presenta siempre igual o mayor precisión que la clásica Información Mutua y consecuentemente puede ser una muy buena alternativa en aplicaciones donde la robustez del método y la facilidad en la elección de parámetros sean particularmente importantes. Abstract Pre-operative planning has become an essential task in complex surgeries and therapies, especially for those affecting soft tissue. One example where soft tissue preoperative planning is of high interest is liver surgery. It involves the accurate detection and identification of individual liver lesions and vessels as well as the proper functional liver segmentation and volume estimation. This process is very important because it determines whether the patient is a suitable candidate for surgical therapy and the type of procedure. Soft tissue radiation therapy is a second example where planning is required for both conventional external and intraoperative radiotherapy. It involves the segmentation of the tumor target and vulnerable organs and the estimation of the planned dose. Functional liver segmentations and volume estimations for surgery planning are commonly estimated from computed tomography (CT) images. Similarly, in radiation therapy planning, targets to be irradiated and healthy and vulnerable tissues to be protected from irradiation are commonly delineated on CT scans. However, developments in magnetic resonance imaging (MRI) technology are progressively offering advantages. For instance, the hepatic metastasis detection rate has been found to be significantly higher in Gd–EOB–DTPAenhanced MRI than in CT. Therefore, recent studies highlight the importance of combining the information from CT and MRI to achieve the highest level of accuracy in radiotherapy and to facilitate accurate liver lesion description. In order to improve those two soft tissue pre operative planning scenarios, an accurate nonrigid image registration algorithm is clearly required. However, the vast majority of commercial systems only provide rigid registration. Voxel intensity measures have been shown to be robust measures of image similarity, and among them, Mutual Information (MI) is always the first candidate in multimodal registrations. However, one of the main drawbacks of Mutual Information is the absence of spatial information and the assumption that statistical relationships between images are the same over the whole domain of the image. The hypothesis of the present thesis is that incorporating spatial organ information into the registration process may improve the registration robustness and quality, taking advantage of the clinical segmentations availability. In this work, a multimodal nonrigid 3D registration framework using a new Organ- Focused Mutual Information metric (OF-MI) is proposed, validated and compared to the classical formulation of the Mutual Information (MI). It allows improving registration results in problematic areas by adding regional information into the similitude criterion taking advantage of actual segmentations availability in standard clinical protocols and allowing the statistical dependence between the two modalities differ among organs or regions. The proposed method is applied to CT and T1 weighted delayed Gd–EOB–DTPA-enhanced MRI registration as well as to register CT and MRI images in rectal intraoperative radiotherapy planning. Additionally, a 3D support segmentation algorithm based on Level-Sets has been developed for the incorporation of the organ information into the registration. The segmentation algorithm has been specifically designed for the healthy and functional liver volume estimation demonstrating good performance in a set of abdominal CT studies. Results show a statistical significant improvement of registration quality measures with OF-MI compared to MI with both simulated data (p<0.001) and real data in liver applications registering CT and Gd–EOB–DTPA-enhanced MRI and in registration for rectal radiotherapy planning using multi-organ OF-MI (p<0.05). Additionally, OF-MI presents more stable results with smaller dispersion than MI and a more robust behavior with respect to SNR changes and parameters variation. The proposed OF-MI always presents equal or better accuracy than the classical MI and consequently can be a very convenient alternative within applications where the robustness of the method and the facility to choose the parameters are particularly important.

Genomic analyses of flowering transition and inflorescence development in grapevine = Análisis genómicos de la transición floral y del desarrollo de la inflorescencia en la vid

The general objective of this work is to analyze the regulatory processes underlying flowering transition and inflorescence and flower development in grapevine. Most of these crucial developmental events take place within buds growing during two seasons in two consecutive years. During the first season, the shoot apical meristem within the bud differentiates all the basic elements of the shoot including flowering transition in lateral primordia and development of inflorescence primordia. These events practically end with bud dormancy. The second season, buds resume shoot growth associated to flower formation and development. In grapevine, the lateral meristems can give rise either to tendril or inflorescence primordia that are homologous organs. With this purpose, we performed global transcriptome analyses along the bud annual cycle and during inflorescence and tendril development. In addition, we approach the genomic analysis of the MIKC type MADS-box gene family in grapevine to identify all its members and assign them putative biological functions. Regarding buds developmental cycle, the results indicate that the main factors explaining the global gene expression differences were the processes of bud dormancy and active growth as well as stress responses. Non dormant buds exhibited up-regulation in functional categories typical of actively proliferating and growing cells (photosynthesis, cell cycle regulation, chromatin assembly) whereas in dormant ones the main functional categories up-regulated were associated to stress response pathways together with transcripts related to starch catabolism. Major transcriptional changes during the dormancy period were associated to the para/endodormancy, endo/ecodormancy and ecodormancy/bud break transitions. Global transcriptional analyses along tendril and inflorescence development suggested that these two homologous organs share a common transcriptional program related to cell proliferation functions. Both structures showed a progressive decrease in the expression of categories such as cell-cycle, auxin metabolism/signaling, DNA metabolism, chromatin assembly and a cluster of five transcripts belonging to the GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) transcription factor family, that are known to control cell proliferation in other species and determine the size of lateral organs. However, they also showed organ specific transcriptional programs that can be related to their differential organ structure and function. Tendrils showed higher transcription of genes related to photosynthesis, hormone signaling and secondary metabolism than inflorescences, while inflorescences have higher transcriptional activity for genes encoding transcription factors (especially those belonging to the MADS-box gene family). Further analysis along inflorescence development evidenced the relevance of additional functions likely related to processes of flower development such as fatty acid and lipid metabolism, jasmonate signaling and oxylipin biosynthesis. The transcriptional analyses performed highlighted the relevance of several groups of transcriptional regulators in the developmental processes studied. The expression profiles along bud development revealed significant differences for some MADS-box subfamilies in relation to other plant species, like the members of the FLC and SVP subfamilies suggesting new roles for these groups in grapevine. In this way, it was found that VvFLC2 and VvAGL15.1 could participate, together with some members of the SPL-L family, in dormancy regulation, as was shown for some of them in other woody plants. Similarly, the expression patterns of the VvFLC1, VvFUL, VvSOC1.1 (together with VvFT, VvMFT1 and VFL) genes could indicate that they play a role in flowering transition in grapevine, in parallel to their roles in other plant systems. The expression levels of VFL, the grapevine LEAFY homolog, could be crucial to specify the development of inflorescence and flower meristems instead of tendril meristems. MADS-box genes VvAP3.1 and 2, VvPI, VvAG1 and 3, VvSEP1-4, as well as VvBS1 and 2 are likely associated with the events of flower meristems and flower organs differentiation, while VvAP1 and VvFUL-L (together with VvSOC1.1, VvAGL6.2) could be involved on tendril development given their expression patterns. In addition, the biological function ofVvAP1 and VvTFL1A was analyzed using a gene silencing approach in transgenic grapevine plants. Our preliminary results suggested a possible role for both genes in the initiation and differentiation of tendrils. Finally, the genomic analysis of the MADS-box gene family in grapevine revealed differential features regarding number and expression pattern of genes putatively involved in the flowering transition process as compared to those involved in the specification of flower and fruit organ identity. Altogether, the results obtained allow identifying putative candidate genes and pathways regulating grapevine reproductive developmental processes paving the way to future experiments demonstrating specific gene biological functions. RESUMEN El objetivo general de este trabajo es analizar los procesos regulatorios subyacentes a la inducción floral así como al desarrollo de la inflorescencia y la flor en la vid. La mayor parte de estos eventos cruciales tienen lugar en las yemas a lo largo de dos estaciones de crecimiento consecutivas. Durante la primera estación, el meristemo apical contenido en la yema diferencia los elementos básicos del pámpano, lo cual incluye la inducción de la floración en los meristemos laterales y el subsiguiente desarrollo de primordios de inflorescencia. Estos procesos prácticamente cesan con la entrada en dormición de la yema. En la segunda estación, se reanuda el crecimiento del pámpano acompañado por la formación y desarrollo de las flores. En la vid, los meristemos laterales pueden dar lugar a primordios de inflorescencia o de zarcillo que son considerados órganos homólogos. Con este objetivo llevamos a cabo un estudio a nivel del transcriptoma de la yema a lo largo de su ciclo anual, así como a lo largo del desarrollo de la inflorescencia y del zarcillo. Además realizamos un análisis genómico de la familia MADS de factores transcripcionales (concretamente aquellos del tipo MIKC) para identificar todos sus miembros y tratar de asignarles posibles funciones biológicas. En cuanto al ciclo de desarrollo de la yema, los resultados indican que los principales factores que explican las diferencias globales en la expresión génica fueron los procesos de dormición de la yema y el crecimiento activo junto con las respuestas a diversos tipos de estrés. Las yemas no durmientes mostraron un incremento en la expresión de genes contenidos en categorías funcionales típicas de células en proliferación y crecimiento activo (como fotosíntesis, regulación del ciclo celular, ensamblaje de cromatina), mientras que en las yemas durmientes, las principales categorías funcionales activadas estaban asociadas a respuestas a estrés, así como con el catabolismo de almidón. Los mayores cambios observados a nivel de transcriptoma en la yema coincidieron con las transiciones de para/endodormición, endo/ecodormición y ecodormición/brotación. Los análisis transcripcionales globales a lo largo del desarrollo del zarcillo y de la inflorescencia sugirieron que estos dos órganos homólogos comparten un programa transcripcional común, relacionado con funciones de proliferación celular. Ambas estructuras mostraron un descenso progresivo en la expresión de genes pertenecientes a categorías funcionales como regulación del ciclo celular, metabolismo/señalización por auxinas, metabolismo de ADN, ensamblaje de cromatina y un grupo de cinco tránscritos pertenecientes a la familia de factores transcripcionales GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF), que han sido asociados con el control de la proliferación celular y en determinar el tamaño de los órganos laterales en otras especies. Sin embargo, también pusieron de manifiesto programas transcripcionales que podrían estar relacionados con la diferente estructura y función de dichos órganos. Los zarcillos mostraron mayor actividad transcripcional de genes relacionados con fotosíntesis, señalización hormonal y metabolismo secundario que las inflorescencias, mientras que éstas presentaron mayor actividad transcripcional de genes codificantes de factores de transcripción (especialmente los pertenecientes a la familia MADS-box). Análisis adicionales a lo largo del desarrollo de la inflorescencia evidenciaron la relevancia de otras funciones posiblemente relacionadas con el desarrollo floral, como el metabolismo de lípidos y ácidos grasos, la señalización mediada por jasmonato y la biosíntesis de oxilipinas. Los análisis transcripcionales llevados a cabo pusieron de manifiesto la relevancia de varios grupos de factores transcripcionales en los procesos estudiados. Los perfiles de expresión estudiados a lo largo del desarrollo de la yema mostraron diferencias significativas en algunas de las subfamilias de genes MADS con respecto a otras especies vegetales, como las observadas en los miembros de las subfamilias FLC y SVP, lo cual sugiere que podrían desempeñar nuevas funciones en la vid. En este sentido, se encontró que los genes VvFLC2 y VvAGL15.1 podrían participar, junto con algunos miembros de la familia SPL-L, en la regulación de la dormición. De un modo similar, los patrones de expresión de los genes VvFLC1, VvFUL, VvSOC1.1 (junto con VvFT, VvMFT1 y VFL) podría indicar que desempeñan un papel en la regulación de la inducción de la floración en la vid, como se ha observado en otros sistemas vegetales. Los niveles de expresión de VFL, el homólogo en vid del gen LEAFY de A. thaliana podrían ser cruciales para la especificación del desarrollo de meristemos de inflorescencia y flor en lugar de meristemos de zarcillo. Los genes VvAP3.1 y 2, VvPI, VvAG1 y 3, VvSEP1-4, así como VvBS1 y 2 parecen estar asociados con los eventos de diferenciación de meristemos y órganos florales, mientras que VvAP1 y VvFUL-L (junto con VvSOC1.1 y VvAGL6.2) podrían estar implicados en el desarrollo del zarcillo dados sus patrones de expresión. Adicionalmente, se analizó la función biológica de los genes VvAP1 y VvTFL1A por medio de una estrategia de silenciamiento génico. Los datos preliminares sugieren un posible papel para ambos genes en la iniciación y diferenciación de los zarcillos. Finalmente, el análisis genómico de la familia MADS en vid evidenció diferencias con respecto a otras especies vegetales en cuanto a número de miembros y patrón de expresión en genes supuestamente implicados en la inducción de la floración, en comparación con aquellos relacionados con la especificación de identidad de órganos florales y desarrollo del fruto. En conjunto, los resultados obtenidos han permitido identificar posibles rutas y genes candidatos a participar en la regulación de los procesos de desarrollo reproductivo de la vid, sentando las bases de futuros experimentos encaminados a conocer la funciones biológicas de genes específicos.

Resistance to malathion and lambda-cyhalothrin in Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)

La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), es una de las plagas de mayor incidencia económica en cítricos y otros frutales a nivel mundial. En España las medidas de control de esta plaga en cítricos, desde mediados de los 90 hasta 2009, se basaron principalmente en el monitoreo de las poblaciones y en la aplicación de tratamientos aéreos y terrestres con malatión cebo. Sin embargo, desde la retirada en la Unión Europea en 2009 de los productos fitosanitarios que contienen malatión, los insecticidas más utilizados para el control de esta plaga han sido lambda-cihalotrina y spinosad. En 2004-2005 se detectaron poblaciones españolas de C. capitata resistentes a malatión. Esta resistencia se ha asociado a una mutación (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE), a una duplicación del gen de la AChE (Ccace2) (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas (posiblemente aliesterasas). Sin embargo, cuando se secuenció la aliesterasa CcE7 en individuos de una línea resistente a malatión, no se encontró ninguna de las mutaciones (G137D y/o W251L/S/G) asociadas a resistencia en otras especies, si bien se encontraron otras mutaciones al compararlos con individuos de una línea susceptible. Asimismo, mediante la selección en laboratorio de una línea resistente a malatión (W-4Km) con lambda-cihalotrina, se ha podido obtener una línea resistente a lambda-cihalotrina (W-1K). Finalmente, se ha demostrado la capacidad de esta especie para desarrollar resistencia a spinosad mediante selección en laboratorio. Los múltiples mecanismos de resistencia identificados evidencian el potencial de esta especie para desarrollar resistencia a insecticidas con diferentes modos de acción. Los objetivos de esta tesis doctoral son: 1) evaluar la susceptibilidad de poblaciones españolas de campo de C. capitata a lambda-cihalotrina y dilucidar los mecanismos de resistencia en la línea W-1Kλ; 2) comparar la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A); y 3) investigar el papel de las mutaciones identificadas en la aliesterasa CcαE7 en la resistencia a malatión. Estos estudios son de utilidad para el desarrollo de estrategias de manejo de la resistencia que puedan prevenir o retrasar la aparición de resistencia y aumentar la sostenibilidad de los insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Nuestros resultados indican que las poblaciones españolas de C. capitata analizadas han desarrollado resistencia a lambda-cihalotrina. Los valores de CL50 estimados para las poblaciones recogidas en la Comunidad Valenciana, Cataluña y Andalucía oscilaron entre 129 ppm y 287 ppm, igualando o sobrepasando la concentración recomendada para los tratamientos de campo (125 ppm). Estos resultados contrastan con los obtenidos con tres poblaciones de campo recogidas en Túnez, cuya susceptibilidad fue similar a la de la línea control (C). La línea resistente a lambda-cihalotrina W-1K se continuó seleccionando en el laboratorio alcanzándose unos niveles de resistencia de 205 veces con respecto a la línea C, siendo su CL50 (4224 ppm) más de 30 veces superior a la concentración recomendada para los tratamientos de campo. Esta línea resistente mostró altos niveles de resistencia cruzada a deltametrina (150 veces) y a etofenprox (240 veces), lo que sugiere que el desarrollo de resistencia a lambda-cihalotrina podría comprometer la eficacia de otros piretroides para el control de esta plaga. Hemos demostrado que la resistencia de la línea W-1K a lambda-cihalotrina fue casi completamente suprimida por el sinergista PBO, lo que indica que las enzimas P450 desempeñan un papel muy importante en la resistencia a este insecticida. Sin embargo, tanto las moscas de la línea susceptible C como las de la línea resistente W-1K perdieron inmediatamente la capacidad de caminar (efecto “knock-down”) al ser tratadas tópicamente con lambda-cihalotrina, lo que sugiere que la resistencia no está mediada por alteraciones en la molécula diana (resistencia tipo “kdr”). La resistencia metabólica mediada por P450 fue analizada comparando la expresión de 53 genes CYP (codifican enzimas P450) de las familias CYP4, CYP6, CYP9 y CYP12 en adultos de la línea resistente W-1K y de la línea susceptible C. Nuestros resultados muestran que el gen CYP6A51 (número de acceso GenBank XM_004534804) fue sobreexpresado (13-18 veces) en la línea W-1K. Por otra parte, la expresión del gen CYP6A51 fue inducida tanto en adultos de la línea W-1K como de la línea C al ser tratados con lambda-cihalotrina. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre la línea susceptible C y la línea resistente W-1K al comparar la cantidad de P450 y la actividad NADPH-citocromo c reductasa presente en fracciones microsomales obtenidas a partir de abdómenes. Asimismo, no hemos podido correlacionar el metabolismo de deltametrina, estimado in vitro mediante la incubación de este insecticida con fracciones microsomales, con el nivel de resistencia a este piretroide observado en los bioensayos con la línea W-1K. Por otro lado, no se encontró ninguna alteración en la región promotora 5'UTR del gen CYP6A51 (-500 pb desde el inicio de la traducción) que pudiera explicar su sobreexpresión en la línea W-1K. Los datos obtenidos sugieren que la resistencia a lambda-cihalotrina en la línea W-1K está mediada por P450 y que la sobreexpresión de CYP6A51 puede desempeñar un papel importante, aunque se necesitan más evidencias para establecer una asociación directa de la resistencia con este gen. Hemos estudiado la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A). La línea susceptible C, donde no se encuentra la mutación G328A (genotipo S/S), se cruzó con dos isolíneas establecidas para representar genotipos únicos correspondientes a los dos mecanismos de resistencia asociados a la molécula diana: 1) la isolínea 267Y (genotipo R/R) establecida a partir de una pareja que portaba la mutación G328A en homocigosis; 2) la isolínea 306TY (genotipo RS/RS) establecida a partir de una pareja que portaba en homocigosis la duplicación del gen Ccace2. No se realizaron cruces recíprocos, ya que mediante experimentos de hibridación in situ en cromosomas politénicos se pudo comprobar que el locus de la AChE y la duplicación (probablemente en tándem) se localizan en el cromosoma autosómico 2L. La susceptibilidad al malatión de los parentales resistentes (R/R o RS/RS) y susceptibles (S/S), los cruces F1 (S/R, S/RS y R/RS) y los retrocruzamientos indican que la resistencia a malatión es semi-dominante en ambos casos. Sin embargo, nuestros resultados no fueron concluyentes con respecto a la naturaleza monogénica de la resistencia a malatión en estas isolíneas. Por lo tanto, no podemos descartar que otros genes que contribuyan a la resistencia, además de la mutación G328A (isolínea 267Y) y de la duplicación del gen Ccace2 (isolínea 306TY), puedan haber sido seleccionados durante el proceso de selección de 267Y y 306TY. Varios parámetros biológicos fueron evaluados para determinar si estos dos mecanismos de resistencia a malatión suponen un coste biológico para los genotipos resistentes. Individuos con genotipo R/R mostraron un retraso en el tiempo de desarrollo de huevo a pupa, un peso de pupa reducido y una menor longevidad de los adultos, en comparación con los individuos con genotipo S/S. Sin embargo, el peso de pupa de los individuos con genotipo RS/RS fue similar al de los individuos S/S, y su desarrollo de huevo a pupa intermedio entre S/S y R/R. Estas diferencias en el coste biológico pueden estar relacionadas con la reducción de la eficiencia catalítica de la AChE mutada en los individuos R/R, y al efecto compensatorio que la copia no mutada del gen tiene en los individuos RS/RS que portan la duplicación. La estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación se analizó mediante el seguimiento de los caracteres de resistencia en la progenie de retrocruzamientos S/R x R/R y S/RS x RS/RS a lo largo de varias generaciones en ausencia de presión de selección con insecticidas. Nuestros resultados muestran que la frecuencia del alelo que porta la mutación G328A disminuyó desde 67,5% en la primera generación del retrocruzamiento S/R x R/R (75% esperado, asumiendo segregación mendeliana y que sólo hay dos alelos: uno mutado y otro no mutado) a 12% después de 10 generaciones. Por el contrario, la frecuencia de la duplicación sólo disminuyó desde 75% en en la primera generación del retrocruzamiento S/RS x RS/RS (75% esperado, asumiendo segregación Mendeliana y que la duplicación segrega como un único alelo) a 50% en el mismo período, lo que indica que la duplicación es más estable que la mutación. Asimismo, se analizó la presencia de la mutación y de la duplicación en poblaciones de campo recogidas en seis localidades en 2004-2007, cuando todavía se usaba el malatión, y se comparó con poblaciones recogidas en los mismos campos en 2010, un año después de la prohibición del malatión en la Unión Europea. La frecuencia media del genotipo susceptible (S/S) aumentó del 55,9% en el período 2004-2007 a 70,8% en 2010, mientras que la frecuencia de los genotipos portadores de la mutación en homocigosis o heterocigosis (R/R y S/R) disminuyó del 30,4 al 9,2%, los que llevan la duplicación en homocigosis o heterocigosis (RS/RS y S/RS) aumentaron levemente desde 12,8 hasta 13,3%, y los que llevan a la vez la mutación y la duplicación (R/RS) también aumentaron del 1 al 6,7%. Estos resultados son consistentes con que la duplicación del gen Ccace2 (con una copia con la mutación G328A y la otra copia no mutada) es más ventajosa que la mutación G328A por si sola, ya que la duplicación mantiene los niveles de resistencia a la vez que limita el coste biológico. Para investigar la asociación entre la resistencia a malatión y las mutaciones encontradas previamente en CcE7, hemos generado isolíneas con mutaciones específicas seleccionadas por su ubicación próxima a la entrada al centro activo de la enzima. La isolínea Sm2 (procedente de una hembra heterocigota para la mutación V96L y un macho homocigoto para el alelo no mutado) mantuvo altos niveles de resistencia a malatión, incluso después de 30 generaciones sin presión de selección. Por el contrario, la isolínea 267Y (compuesta por individuos homocigotos para la mutación L267Y) y la línea 306TY (compuesta por individuos homocigotos para la doble mutación R306T-N307Y) mostraron una reducción significativa en los niveles de resistencia. También hemos encontrado que la resistencia a malatión de la línea Sm2 fue parcialmente revertida por DEF y TPP, y que Sm2 mostró una reducción significativa en la actividad MTB, como se ha descrito en otras especies que muestran resistencia específica a malatión mediada por aliesterases. Además, fue posible asociar la presencia de la mutación V96L en individuos de la línea Sm2 con supervivencia a una concentración discriminante de malatión (5,000 ppm) y con una baja actividad MTB. Estos resultados sugieren una posible relación entre la mutación V96L en la aliesterasa CcE7 y la resistencia a malatión, aunque todavía no se puede concluir que la resistencia es causada por esta mutación, siendo necesarios más estudios para comprobar su contribución a la resistencia. En conclusión, se ha encontrado por primera vez resistencia a lambda-cihalotrina en poblaciones de campo de C. capitata, y nuestros resultados indican que las P450 son el principal mecanismo de resistencia en la línea W-1K. Esta situación se suma al caso previamente descrito de resistencia en campo a malatión asociada a la mutación G328A, a la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas. Nuestros resultados también indican que la alteración de la molécula diana AChE parece ser responsable de un cierto nivel de resistencia a malatión en C. capitata, que puede ser estimada como aproximadamente 25-40 veces para la mutación G328A y 40-60 veces para la duplicación; mientras que la resistencia mediada por esterasas y que ha sido asociada en este estudio con la mutación V96L en CcE7 puede conferir un efecto multiplicativo (por un factor de 5 a 10) aumentando la resistencia a malatión a 200-400 veces. Por otra parte, hemos demostrado que los insectos resistentes que llevan la duplicación tienen un coste biológico menor y muestran una estabilidad mayor que aquellos con la mutación G328A en ausencia de presión de selección con insecticidas. Esto representa un escenario en el que los genotipos con la duplicación permanecerán en el campo en frecuencias bajas a moderadas, pero podrían ser seleccionados rápidamente si se utilizan malatión u otros insecticidas que muestren resistencia cruzada. Estos resultados tienen importantes implicaciones para los programas de manejo de la resistencia, ya que el repertorio de insecticidas eficaces para el control de C. capitata es cada vez más limitado. Además, la coexistencia de múltiples mecanismos de resistencia en poblaciones de campo ofrece el potencial para desarrollar resistencia frente a otros insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Estrategias para de manejo de la resistencia basadas en la alternancia de insecticidas con diferentes modos de acción, y su combinación con otros métodos de control, deben ser implementadas para evitar el desarrollo de resistencia en campo. ABSTRACT The Mediterranean fruit fly (Medfly), Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), is one of the most economically damaging pests of citrus and other fruit crops worldwide. Control measures in citrus crops in Spain from the mid 90's to 2009 were mainly based on field monitoring of population levels and aerial and ground treatments with malathion bait sprays. However, since the withdrawal of phytosanitary products containing malathion in the European Union in 2009, lambda-cyhalothrin and spinosad have become the most widely used insecticides for the control of this pest. Resistance to malathion was found in Spanish field populations of C. capitata in 2004-2005. This resistance has been associated with a mutation G328A in the acetylcholinesterase (AChE), a duplication of the AChE gene (Ccace2) (one of the copies bearing the mutation G328A), and metabolic resistance mediated by esterases (probably aliesterases). However, when the gene of the aliesterase CcE7 was sequenced in individuals from a malathion resistant strain of C. capitata, none of the known G137D and/or W251L/S/G mutations associated to resistance in other species were found, though other mutations were detected when compared with individuals from a susceptible strain. Noteworthy, a lambda-cyhalothrin resistant strain (W-1K) was obtained by selecting a field-derived malathion resistant strain (W-4Km) with lambda-cyhalothrin. Moreover, it has also been demonstrated the capacity of this species to develop resistance to spinosad by laboratory selection. The multiple resistance mechanisms identified highlight the potential of this species to develop resistance to insecticides with different modes of action. The objectives of this PhD Thesis are: 1) to assess the susceptibility of Spanish field populations of C. capitata to lambda-cyhalothrin and to elucidate the resistance mechanisms in the W-1Kλ strain; 2) to compare the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A); and 3) to investigate the role of the aliesterase CcαE7 mutations in malathion resistance. All these studies will be of use for devising proactive resistance management strategies that could prevent or delay resistance development and would increase the sustainability of the insecticides available for Medfly control. Our results indicate that Spanish field populations of C. capitata have developed resistance to lambda-cyhalothrin. The LC50 values estimated for populations collected at Comunidad Valenciana, Cataluña and Andalucía ranged from 129 ppm to 287 ppm, equaling or overpassing the recommended concentration for field treatments (125 ppm). These results contrast with those obtained with three different Tunisian field populations, whose susceptibility was similar to that of the control (C) strain. The lambda-cyhalothrin resistant W-1K strain has been further selected to achieve a 205-fold resistance compared to the C strain, being its LC50 (4,224 ppm) more than 30 times higher than the recommended concentration for field applications. This resistant strain showed high levels of cross-resistance to deltamethrin (150-fold) and etofenprox (240-fold), suggesting that the development of resistance to lambda-cyhalothrin may compromise the effectiveness of other pyrethroids for the control of this species. We have shown that the resistance of the W-1K strain to lambda-cyhalothrin was almost completely suppressed by the synergist PBO, indicating that P450 enzymes play a very important role in resistance to this insecticide. However, both susceptible C and resistant W-1K flies were knocked down after topical treatment with lambda-cyhalothrin, suggesting that kdr resistance mediated by alterations of the target site is not playing a major role. Metabolic resistance mediated by P450 was further analyzed by comparing the expression of 53 genes of the families CYP4, CYP6, CYP9 and CYP12 in adults flies from the resistant W-1K and the susceptible C strains. We found that the gene CYP6A51 (GenBank accession number XM_004534804) was overexpressed (13-18-fold) in the W-1K strain. Moreover, the expression of the CYP6A51 gene was induced when adults of the W-1K and C strains were treated with lambda-cyhalothrin. However, no significant differences were obtained between susceptible C and resistant W-1K strains for the quantity of P450 and for the activity of NADPH- cytochrome c reductase measured in microsomal fractions obtained from abdomens. Moreover, we failed to correlate the metabolism of deltamethrin, analyzed in vitro by incubating this insecticide with microsomal fractions, with the resistance level against this pyrethroid observed in bioassays with W-1K. The sequencing of the 5´UTR region of the CYP6A51 gene failed in finding an alteration in the promoter region (-500 bp from translation start site) that could explain overexpression in the W-1K strain. All data obtained suggest that resistance to lambda-cyhalothrin in the W- 1K strain is mediated by P450 and that overexpression of CYP6A51 may play a major role, although further evidences are needed to establish a direct association of resistance with this gene. We have studied the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A). The malathion-susceptible C strain where the G328A mutation is not found (S/S genotype) was crossed with two isolines established to represent unique genotypes corresponding to the two target-site resistance mechanisms: 1) the 267Y isoline (genotype R/R) was established from a couple bearing the mutation G328A in homozygosis; and 2) the 306TY isoline (genotype RS/RS) was established from a couple being homozygous for the duplication of the Ccace2 gene. Reciprocal crosses have not been performed, since in situ hybridization on polythene chromosomes showed that the AChE locus and the duplication (most probably in tandem) are placed at the autosomal chromosome 2L. Mortality responses to malathion of resistant isolines (R/R or RS/RS) and susceptible (S/S) genotypes, F1 crosses (S/R, S/RS, and R/RS), and the back-crosses indicated that resistance to malathion is inherited as a semi-dominant trait in both cases. However, our results were not conclusive about the monogenic nature of the resistance to malathion in these isolines. Thus, we can not discard that other genes contributing to resistance, in addition to the mutation G328A (isoline 267Y) and the duplication of the Ccace2 gene (isoline 306TY), may have been selected during the selection process of 267Y and 306TY. Several biological parameters were evaluated to determine if these two malathion resistance mechanisms impose a fitness cost for resistant genotypes. Individuals with genotype R/R have a reduced fitness in terms of developmental time from egg to pupa, pupal weight and adult longevity, when compared to susceptible individuals (genotype S/S). Interestingly, the fitness cost was substantially diminished in individuals with genotype RS/RS. These differences in fitness may be related to the reduction of the catalytic efficiency of mutated AChE in individuals R/R, and the compensatory effect that the non-mutated copy of the gene has on individuals RS/RS bearing the duplication. The stability of malathion reistance associated with the mutation G328A or the duplication was analyzed by following these resistant traits in the progeny of the back-crosses S/RS x RS/RS and S/R x R/R over consecutive generations in the absence of insecticide selection pressure. Our results show that the frequency of the allele bearing the mutation G328A decreased from 67.5% at the first generation of the back-cross S/R x R/R (75% expected, assuming Mendelian segregation and that there are only two alleles: one mutated and the other non-mutated) to 12% after 10 generations. By contrast, the frequency of the duplication only declined from 75% at the first generation of the back-cross S/RS x RS/RS (75% expected, assuming Mendelian segregation and that the duplication segregates as an unique allele) to 50% in the same period, indicating that the duplication is more stable than the mutation. The presence of the mutation and the duplication was analyzed in field populations collected in six localities in 2004-2007, when malathion was still used, and compared to populations collected in the same fields in 2010, one year after the prohibition of malathion in the European Union. The average frequency of the susceptible genotype (S/S) increased from 55.9% in the period 2004-2007 to 70.8% in 2010, whereas the frequency of those genotypes carrying the mutation in homozygosis or heterozygosis (R/R and S/R) declined from 30.4 to 9.2%, those carrying the duplication in homozygosis or heterozygosis (RS/RS and S/RS) increased slightly from 12.8 to 13.3%, and those carrying both the mutation and the duplication (R/RS) also increased from 1 to 6.7%. These results are consistent with the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A and the other copy non-mutated) being more advantageous than the G328A mutation alone by maintaining resistance while restoring part of the fitness. In order to investigate the association of malathion resistance with mutations previously found in the aliesterase CcE7, we have generated isolines bearing specific mutations selected by their putative location near the upper part of the active site gorge of the enzyme. The isoline Sm2 (originating from a female heterozygous for the mutation V96L and a male homozygous for the non-mutated allele) kept high levels of resistance to malathion, even after 30 generations without selection pressure. On the contrary, the isoline 267Y (composed by individuals homozygous for the mutation L267Y) and the strain 306TY (composed by homozygous for the double mutation R306T-N307Y) showed a significant reduction in the levels of resistance. We have found also that resistance to malathion in the Sm2 isoline was partially reverted by DEF and TPP, and that Sm2 showed a significant reduction in MTB activity, as reported for other species showing malathion-specific resistance mediated by aliesterases. Besides, it was possible to associate the presence of the mutation V96L in individuals from the Sm2 isoline with both survival to a discriminating concentration of malathion (5,000 ppm) and low MTB activity. Our results point out to a possible connection betwen the mutation V96L in the aliesterase CcE7 and resistance to malathion, though we can not yet conclude that the resistance is caused by the mutation, being needed further work to understand its contribution to resistance. In conclusion, resistance to lambda-cyhalothrin has been found for the first time in field populations of C. capitata, and metabolic resistance mediated by P450 appears to be the main resistance mechanism in the resistant strain W-1K. These findings add to the previously reported case of field resistance to malathion, associated to the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A) and to metabolic resistance mediated by esterases. Our results also indicate that altered target site AChE appears to be responsible for a certain level of resistance to malathion in C. capitata, that can be estimated as about 25-40-fold for the mutation G328A and 40-60-fold for the duplication; whereas metabolic resistance mediated by esterases and associated in this study with the mutation V96L in CcE7 may confer a multiplicative effect (by a factor of 5 to10) increasing malathion resistance to 200-400-fold. Moreover, we have shown that resistant insects carrying the duplication have better fitness and exhibit a higher stability than those with the mutation G328A in the absence of insecticide pressure. This represents a scenario where genotypes with the duplication will remain in the field at low to moderate frequencies, but could be rapidly selected if malathion or other insecticides showing cross-resistance are used. These findings have important implications for resistance management programs, as the repertoire of effective insecticides for C. capitata control is becoming very limited. Besides, multiple resistance mechanisms coexisting in field populations provide the potential to develop resistance to other available insecticides for the control of this pest. Appropriate resistance management strategies based on the alternation of insecticides with different modes of action, and their combination with other control methods, must then be implemented to avoid the evolution of resistance in the field.

Aerial Coverage Path Planning applied to Mapping

In the last decade we have seen how small and light weight aerial platforms - aka, Mini Unmanned Aerial Vehicles (MUAV) - shipped with heterogeneous sensors have become a 'most wanted' Remote Sensing (RS) tool. Most of the off-the-shelf aerial systems found in the market provide way-point navigation. However, they do not rely on a tool that compute the aerial trajectories considering all the aspects that allow optimizing the aerial missions. One of the most demanded RS applications of MUAV is image surveying. The images acquired are typically used to build a high-resolution image, i.e., a mosaic of the workspace surface. Although, it may be applied to any other application where a sensor-based map must be computed. This thesis provides a study of this application and a set of solutions and methods to address this kind of aerial mission by using a fleet of MUAVs. In particular, a set of algorithms are proposed for map-based sampling, and aerial coverage path planning (ACPP). Regarding to map-based sampling, the approaches proposed consider workspaces with different shapes and surface characteristics. The workspace is sampled considering the sensor characteristics and a set of mission requirements. The algorithm applies different computational geometry approaches, providing a unique way to deal with workspaces with different shape and surface characteristics in order to be surveyed by one or more MUAVs. This feature introduces a previous optimization step before path planning. After that, the ACPP problem is theorized and a set of ACPP algorithms to compute the MUAVs trajectories are proposed. The problem addressed herein is the problem to coverage a wide area by using MUAVs with limited autonomy. Therefore, the mission must be accomplished in the shortest amount of time. The aerial survey is usually subject to a set of workspace restrictions, such as the take-off and landing positions as well as a safety distance between elements of the fleet. Moreover, it has to avoid forbidden zones to y. Three different algorithms have been studied to address this problem. The approaches studied are based on graph searching, heuristic and meta-heuristic approaches, e.g., mimic, evolutionary. Finally, an extended survey of field experiments applying the previous methods, as well as the materials and methods adopted in outdoor missions is presented. The reported outcomes demonstrate that the findings attained from this thesis improve ACPP mission for mapping purpose in an efficient and safe manner.

Aerial Coverage Path Planning applied to Mapping

In the last decade we have seen how small and light weight aerial platforms - aka, Mini Unmanned Aerial Vehicles (MUAV) - shipped with heterogeneous sensors have become a 'most wanted' Remote Sensing (RS) tool. Most of the off-the-shelf aerial systems found in the market provide way-point navigation. However, they do not rely on a tool that compute the aerial trajectories considering all the aspects that allow optimizing the aerial missions. One of the most demanded RS applications of MUAV is image surveying. The images acquired are typically used to build a high-resolution image, i.e., a mosaic of the workspace surface. Although, it may be applied to any other application where a sensor-based map must be computed. This thesis provides a study of this application and a set of solutions and methods to address this kind of aerial mission by using a fleet of MUAVs. In particular, a set of algorithms are proposed for map-based sampling, and aerial coverage path planning (ACPP). Regarding to map-based sampling, the approaches proposed consider workspaces with different shapes and surface characteristics. The workspace is sampled considering the sensor characteristics and a set of mission requirements. The algorithm applies different computational geometry approaches, providing a unique way to deal with workspaces with different shape and surface characteristics in order to be surveyed by one or more MUAVs. This feature introduces a previous optimization step before path planning. After that, the ACPP problem is theorized and a set of ACPP algorithms to compute the MUAVs trajectories are proposed. The problem addressed herein is the problem to coverage a wide area by using MUAVs with limited autonomy. Therefore, the mission must be accomplished in the shortest amount of time. The aerial survey is usually subject to a set of workspace restrictions, such as the take-off and landing positions as well as a safety distance between elements of the fleet. Moreover, it has to avoid forbidden zones to y. Three different algorithms have been studied to address this problem. The approaches studied are based on graph searching, heuristic and meta-heuristic approaches, e.g., mimic, evolutionary. Finally, an extended survey of field experiments applying the previous methods, as well as the materials and methods adopted in outdoor missions is presented. The reported outcomes demonstrate that the findings attained from this thesis improve ACPP mission for mapping purpose in an efficient and safe manner.

Contribute to the Study of Vertical Distribution of Conventional No-Till Seeders and Spatial Variability of Seed Depth Placement of Maize in Alentejo, Portugal

Entre os vários fatores que contribuem para a produção de uma cultura de milho, a distribuição vertical dos semeadores avaliada através da localização da semente em profundidade é um fator-chave, especialmente na técnica de sementeira direta. Simultaneamente, dada a complexidade dos ecossistemas naturais e agrícolas em sistemas de agricultura de conservação, a gestão diferenciada e localizada das parcelas assume um importante papel na análise e gestão da variabilidade das propriedades do solo e estabelecimento das culturas, nomeadamente utilizando informação geo referenciada e tecnologia expedita. Assim, o principal objetivo desta Tese foi a avaliação em culturas de milho da variabilidade espacial da localização de semente em profundidade e estabelecimento da cultura em sementeira direta usando sistemas convencionais de controlo de profundidade, tendo-se comparado com diferentes sistemas de mobilização e recorrendo a tecnologias de agricultura de precisão. Os ensaios decorreram na região Mediterrânea do Alentejo, em propriedades agrícolas no decorrer das campanhas de 2010, 2011, 2012 e 2015 em 6 diferentes campos experimentais. O trabalho experimental consistiu em ensaios com avaliações in loco do solo e cultura, consumo de combustível das operações e deteção remota. Os resultados obtidos indicam que não só o sistema de mobilização afetou a localização da semente em profundidade, como em sementeira direta a profundidade de sementeira foi afetada pelo teor de humidade do solo, resistência do solo à profundidade e velocidade da operação de sementeira. Adicionalmente observaram-se condições heterogéneas de emergência e estabelecimento da cultura afetadas por condições físicas de compactação do solo. Comparando os diferentes sistemas de mobilização, obteve-se uma significativa redução de combustível para a técnica de sementeira direta, apesar de se terem observado diferenças estatísticas significativas considerando diferentes calibrações de profundidade de sementeira Do trabalho realizado nesta Tese ressalva-se a importância que as tecnologias de agricultura de precisão podem ter no acompanhamento e avaliação de culturas em sementeira direta, bem como a necessidade de melhores procedimentos no controlo de profundidade dos semeadores pelo respetivos operadores ou ao invés, a adoção de semeadores com mecanismos ativos de controlo de profundidade. ABSTRACT Among the various factors that contribute towards producing a successful maize crop, seeders vertical distribution evaluated through seed depth placement is a key determinant, especially under a no-tillage technique. At the same time in conservation agriculture systems due to the complexity of natural and agricultural ecosystems site specific management became an important approach to understand and manage the variability of soil properties and crop establishment, especially when using geo spatial information and affording readily technology Thus, the main objective of this Thesis was to evaluate the spatial variability of seed depth placement and crop establishment in maize crops under no-tillage conditions compared to different tillage systems, using conventional seed depth control no till seeders and precision farming technologies. Trials were carried out in the Mediterranean region of Alentejo, in private farms along the sowing operations season over the years 2010, 2011, 2012 and 2015 in 6 different experimental fields. Experimental work covered field tests with in loco soil and crop evaluations, fuel operation evaluations and aerial sensing. The results obtained indicate that not only tillage system affected seed depth placement but under no till conditions seed depth was affected by soil moisture content, soil resistance to penetration and seeders forward speed. In addition uneven crop seedling and establishment depended on seed depth placement and could be affected by physical problems of compaction layers. Significant reduction in fuel consumption was observed for no till operations although significant differences observed according to different setting calibrations of seed depth control. According to the results, precision agriculture is an important tool to evaluate crops under no till conditions and seed depth mechanisms should be more accurate by the operators or is determinant the adoption of new active depth control technology to improve seeders performance.

Coleópteros Saproxílicos de los Bosques de Montaña en el Norte de la Comunidad de Madrid

La fauna saproxílica ha cobrado mucha relevancia en los últimos años. Por una parte, debido a los múltiples papeles que juega en la ecología de los bosques y por otra, por encontrarse muchas especies de ese grupo amenazadas como consecuencia de la intensificación de las actividades forestales. Se supone que los bosques de Europa meridional albergan una fauna saproxílica rica y variada. Sin embargo apenas se han realizado estudios que permitan conocer la composición de las biocenosis saproxílicas, así como el estatus y grado de amenaza a que está sometida cada especie. En esta tesis se han muestreado de forma sistemática las comunidades de coleópteros saproxílicos de cuatro montes del norte de la Comunidad de Madrid, muy diferentes a pesar de su cercanía: Dehesa Bonita de Somosierra, Hayedo de Montejo, Dehesa de Madarcos y Pinar de La Maleza. Para llevar a cabo la recogida de muestras se definió una estación de muestreo tipo, compuesta por cuatro trampas aéreas con cebo oloroso, dos trampas de ventana y una trampa de embudos. En los dos primeros montes mencionados se desplegaron seis estaciones de muestreo, por sólo tres en los otros dos. El primer objetivo de esta tesis fue conocer las especies de coleópteros que constituyen la fauna de los cuatro montes estudiados. Los muestreos sistemáticos reportaron la presencia de un total de 357 especies de coleópteros saproxílicos, siendo el Hayedo de Montejo el bosque con la diversidad más alta, 220 especies; le siguen la Dehesa de Madarcos con 116; el pinar de La Maleza con 115; y la Dehesa de Somosierra con 109, si bien la fauna de este ultimo bosque podría ser mucho más variada dado que la interferencia del ganado con algunos dispositivos de captura hizo que se perdiera parte del material allí recolectado. Se han encontrado nueve especies nuevas para la fauna de la Península Ibérica, y otras muchas desconocidas previamente en el centro peninsular. Un total de 50 especies se encuentran incluidas en la Lista Roja Europea de coleópteros saproxílicos. El segundo objetivo fue estimar la riqueza de fauna de coleópteros saproxílicos en cada bosque. Partiendo de los datos de los respectivo muestreos se calcularon diferentes estimadores, paramétricos y no paramétricos, y se elaboraron las curvas de rarefacción para cada bosque y para el conjunto. El bosque con más biodiversidad ha resultado ser el Hayedo de Montejo, que albergaría entre 254 y 332 especies. En el Pinar de la Maleza se encontrarían de 132 a 223; de 128 a 205 en la Dehesa de Somosierra; y entre 134 y 188 en la Dehesa de Madarcos. Para el conjunto del área se estimó la presencia de entre 411 y 512 especies. El tercer objetivo fue evaluar la influencia de algunos factores como la especie arbórea dominante y la cantidad de madera muerta en la riqueza y diversidad de coleópteros saproxílicos. El estudio se realizó en el Hayedo de Montejo, encontrando una alta correlación positiva entre cantidad y calidad de madera muerta, y diversidad y riqueza de especies de coleópteros saproxílicos. El cuarto objetivo fue evaluar la eficacia y complementariedad de los diferentes tipos de dispositivos de captura empleados en los muestreos. El más eficaz resultó ser la trampa de ventana, seguido por la trampa aérea con cebo oloroso, y finalmente la trampa de embudos. La mayor complementariedad se encontró entre trampas de ventana y aéreas con cebo oloroso. No obstante, si se quiere optimizar la exhaustividad del inventario no se debe prescindir de ninguno de los sistemas. En cualquier caso, puede afirmarse que la efectividad de los tres tipos de dispositivos de captura utilizados en los muestreos fue baja, pues para la gran mayoría de especies presentes se capturó un número de ejemplares realmente bajo. El bajo rendimiento de captura implica un bajo impacto sobre las poblaciones de las especies muestreadas, y esto supone una importante ventaja desde el punto de vista de la conservación. Finalmente, se dejan algunas recomendaciones de manejo a aplicar en cada uno de los montes con el fin de preservar o mejorar los hábitats utilizables por la fauna saproxílica que garanticen el mantenimiento y mejora de dichas comunidades. ABSTRACT The saproxylic fauna has become increasingly important in recent years. It has been due, on the one hand, to the multiple roles they play in the forest ecosystems and, on the other, because of the large proportion of endangered saproxylic species as a result of the intensification of forestry. It is generally assumed that southern Europe forests are home to a rich and diverse saproxylic fauna. However, there are hardly any studies leading to reveal the composition of saproxylic biocenosis, or the stage and extent of the threat each species is suffering. For the purpose of this thesis the communities of saproxylic beetles of four mountain forests in northern Comunidad de Madrid have been systematically sampled: Dehesa Bonita de Somosierra, Hayedo de Montejo, Dehesa de Madarcos and Pinar de La Maleza. They are very different from each other in spite of not being too far apart. In order to carry out sample collection, a standard sampling station was defined as follows: four smelly bait aerial traps, two window traps and one funnel trap. Six sampling stations were deployed in each of the first two forests mentioned above; put only three in each of the other two. The first aim of this thesis was to determine the composition of saproxylic beetles fauna inhabiting each of the four forests studied. Systematic sampling reported the presence of a total of 357 species of saproxylic beetles. Hayedo de Montejo, with 220 species, is the forest with the highest diversity, followed by Dehesa de Madarcos, 116; Pinar de La Maleza, 115, and Dehesa de Somosierra, 109. The fauna of the latter forest, however, could be much more varied, since cattle interference with some capture devices caused the loss of part of the material collected there. Nine new species in the fauna of the Iberian Peninsula were found, and many others previously unknown in the center of the Peninsula. A total of 41 of those species are included in the European Red List of saproxylic beetles. The second aim was to estimate the richness of saproxylic (beetle) fauna in each forest. From the data of the respective sampling, different parametric and nonparametric estimators were calculated, and rarefaction curves for each forest, as well as for the four of them together, were drawn. The most biodiverse forest turned out to be Hayedo de Montejo, which houses between 254 and 332 species. In Pinar de La Maleza, between 132 and 223 species were found; between 128 and 205 in Dehesa de Somosierra, and between 134 and 188 in Dehesa de Madarcos. The estimated diversity of species for the whole area ranges from 411 to 512. The third aim was to evaluate the influence of such factors as the dominant tree species and the amount of dead wood in the richness and diversity of saproxylic beetles. The study was conducted at Hayedo de Montejo, finding a high positive correlation between quantity and quality of coarse woody debris and diversity and richness of saproxylic beetle species. The fourth aim was to evaluate the effectiveness and complementarity of the different sampling methods used in this research work. The most effective proved to be the window trap, followed by the smelly bait aerial trap and the funnel trap, in that order. The greater complementarity was found between window and aerial traps. However, in order to optimize the completeness of the inventory, neither of the systems should be discarded. Nevertheless, the effectiveness of the three types of capture devices used in this piece of research was on the whole rather low, since for the vast majority of species, a significant low number of specimens were captured. Poor trapping performance implies a low impact on the populations of the sampled species, and this is an important advantage in terms of conservation. Finally, this thesis gives some recommendations with regard to the management of each of those four forests, leading to preserve and improve the habitats of the saproxylic wildlife and so ensure the maintenance and growth of their communities.

Unravelling past flash flood activity in a forested mountain catchment of the Spanish Central System

Flash floods represent one of the most common natural hazards in mountain catchments, and are frequent in Mediterranean environments. As a result of the widespread lack of reliable data on past events, the understanding of their spatio-temporal occurrence and their climatic triggers remains rather limited. Here, we present a dendrogeomorphic reconstruction of past flash flood activity in the Arroyo de los Puentes stream (Sierra de Guadarrama, Spanish Central System). We analyze a total of 287 increment cores from 178 disturbed Scots pine trees (Pinus sylvestris L.) which yielded indications on 212 growth disturbances related to past flash flood impact. In combination with local archives, meteorological data, annual forest management records and highly-resolved terrestrial data (i.e., LiDAR data and aerial imagery), the dendrogeomorphic time series allowed dating 25 flash floods over the last three centuries, with a major event leaving an intense geomorphic footprint throughout the catchment in 1936. The analysis of meteorological records suggests that the rainfall thresholds of flash floods vary with the seasonality of events. Dated flash floods in the 20th century were primarily related with synoptic troughs owing to the arrival of air masses from north and west on the Iberian Peninsula during negative indices of the North Atlantic Oscillation. The results of this study contribute considerably to a better understanding of hazards related with hydrogeomorphic processes in central Spain in general and in the Sierra de Guadarrama National Park in particular.

Methods for the analysis of multi-scale cell dynamics from fluorescence microscopy images

La embriogénesis es el proceso mediante el cual una célula se convierte en un ser un vivo. A lo largo de diferentes etapas de desarrollo, la población de células va proliferando a la vez que el embrión va tomando forma y se configura. Esto es posible gracias a la acción de varios procesos genéticos, bioquímicos y mecánicos que interaccionan y se regulan entre ellos formando un sistema complejo que se organiza a diferentes escalas espaciales y temporales. Este proceso ocurre de manera robusta y reproducible, pero también con cierta variabilidad que permite la diversidad de individuos de una misma especie. La aparición de la microscopía de fluorescencia, posible gracias a proteínas fluorescentes que pueden ser adheridas a las cadenas de expresión de las células, y los avances en la física óptica de los microscopios han permitido observar este proceso de embriogénesis in-vivo y generar secuencias de imágenes tridimensionales de alta resolución espacio-temporal. Estas imágenes permiten el estudio de los procesos de desarrollo embrionario con técnicas de análisis de imagen y de datos, reconstruyendo dichos procesos para crear la representación de un embrión digital. Una de las más actuales problemáticas en este campo es entender los procesos mecánicos, de manera aislada y en interacción con otros factores como la expresión genética, para que el embrión se desarrolle. Debido a la complejidad de estos procesos, estos problemas se afrontan mediante diferentes técnicas y escalas específicas donde, a través de experimentos, pueden hacerse y confrontarse hipótesis, obteniendo conclusiones sobre el funcionamiento de los mecanismos estudiados. Esta tesis doctoral se ha enfocado sobre esta problemática intentando mejorar las metodologías del estado del arte y con un objetivo específico: estudiar patrones de deformación que emergen del movimiento organizado de las células durante diferentes estados del desarrollo del embrión, de manera global o en tejidos concretos. Estudios se han centrado en la mecánica en relación con procesos de señalización o interacciones a nivel celular o de tejido. En este trabajo, se propone un esquema para generalizar el estudio del movimiento y las interacciones mecánicas que se desprenden del mismo a diferentes escalas espaciales y temporales. Esto permitiría no sólo estudios locales, si no estudios sistemáticos de las escalas de interacción mecánica dentro de un embrión. Por tanto, el esquema propuesto obvia las causas de generación de movimiento (fuerzas) y se centra en la cuantificación de la cinemática (deformación y esfuerzos) a partir de imágenes de forma no invasiva. Hoy en día las dificultades experimentales y metodológicas y la complejidad de los sistemas biológicos impiden una descripción mecánica completa de manera sistemática. Sin embargo, patrones de deformación muestran el resultado de diferentes factores mecánicos en interacción con otros elementos dando lugar a una organización mecánica, necesaria para el desarrollo, que puede ser cuantificado a partir de la metodología propuesta en esta tesis. La metodología asume un medio continuo descrito de forma Lagrangiana (en función de las trayectorias de puntos materiales que se mueven en el sistema en lugar de puntos espaciales) de la dinámica del movimiento, estimado a partir de las imágenes mediante métodos de seguimiento de células o de técnicas de registro de imagen. Gracias a este esquema es posible describir la deformación instantánea y acumulada respecto a un estado inicial para cualquier dominio del embrión. La aplicación de esta metodología a imágenes 3D + t del pez zebra sirvió para desvelar estructuras mecánicas que tienden a estabilizarse a lo largo del tiempo en dicho embrión, y que se organizan a una escala semejante al del mapa de diferenciación celular y con indicios de correlación con patrones de expresión genética. También se aplicó la metodología al estudio del tejido amnioserosa de la Drosophila (mosca de la fruta) durante el cierre dorsal, obteniendo indicios de un acoplamiento entre escalas subcelulares, celulares y supracelulares, que genera patrones complejos en respuesta a la fuerza generada por los esqueletos de acto-myosina. En definitiva, esta tesis doctoral propone una estrategia novedosa de análisis de la dinámica celular multi-escala que permite cuantificar patrones de manera inmediata y que además ofrece una representación que reconstruye la evolución de los procesos como los ven las células, en lugar de como son observados desde el microscopio. Esta metodología por tanto permite nuevas formas de análisis y comparación de embriones y tejidos durante la embriogénesis a partir de imágenes in-vivo. ABSTRACT The embryogenesis is the process from which a single cell turns into a living organism. Through several stages of development, the cell population proliferates at the same time the embryo shapes and the organs develop gaining their functionality. This is possible through genetic, biochemical and mechanical factors that are involved in a complex interaction of processes organized in different levels and in different spatio-temporal scales. The embryogenesis, through this complexity, develops in a robust and reproducible way, but allowing variability that makes possible the diversity of living specimens. The advances in physics of microscopes and the appearance of fluorescent proteins that can be attached to expression chains, reporting about structural and functional elements of the cell, have enabled for the in-vivo observation of embryogenesis. The imaging process results in sequences of high spatio-temporal resolution 3D+time data of the embryogenesis as a digital representation of the embryos that can be further analyzed, provided new image processing and data analysis techniques are developed. One of the most relevant and challenging lines of research in the field is the quantification of the mechanical factors and processes involved in the shaping process of the embryo and their interactions with other embryogenesis factors such as genetics. Due to the complexity of the processes, studies have focused on specific problems and scales controlled in the experiments, posing and testing hypothesis to gain new biological insight. However, methodologies are often difficult to be exported to study other biological phenomena or specimens. This PhD Thesis is framed within this paradigm of research and tries to propose a systematic methodology to quantify the emergent deformation patterns from the motion estimated in in-vivo images of embryogenesis. Thanks to this strategy it would be possible to quantify not only local mechanisms, but to discover and characterize the scales of mechanical organization within the embryo. The framework focuses on the quantification of the motion kinematics (deformation and strains), neglecting the causes of the motion (forces), from images in a non-invasive way. Experimental and methodological challenges hamper the quantification of exerted forces and the mechanical properties of tissues. However, a descriptive framework of deformation patterns provides valuable insight about the organization and scales of the mechanical interactions, along the embryo development. Such a characterization would help to improve mechanical models and progressively understand the complexity of embryogenesis. This framework relies on a Lagrangian representation of the cell dynamics system based on the trajectories of points moving along the deformation. This approach of analysis enables the reconstruction of the mechanical patterning as experienced by the cells and tissues. Thus, we can build temporal profiles of deformation along stages of development, comprising both the instantaneous events and the cumulative deformation history. The application of this framework to 3D + time data of zebrafish embryogenesis allowed us to discover mechanical profiles that stabilized through time forming structures that organize in a scale comparable to the map of cell differentiation (fate map), and also suggesting correlation with genetic patterns. The framework was also applied to the analysis of the amnioserosa tissue in the drosophila’s dorsal closure, revealing that the oscillatory contraction triggered by the acto-myosin network organized complexly coupling different scales: local force generation foci, cellular morphology control mechanisms and tissue geometrical constraints. In summary, this PhD Thesis proposes a theoretical framework for the analysis of multi-scale cell dynamics that enables to quantify automatically mechanical patterns and also offers a new representation of the embryo dynamics as experienced by cells instead of how the microscope captures instantaneously the processes. Therefore, this framework enables for new strategies of quantitative analysis and comparison between embryos and tissues during embryogenesis from in-vivo images.

Control por modos deslizantes como estrategia de navegación en una flota de robots

En esta tesis se presenta el desarrollo de un esquema de cooperación entre vehículos terrestres (UGV) y aéreos (UAV) no tripulados, que sirve de base para conformar dos flotas de robots autónomos (denominadas FRACTAL y RoMA). Con el fin de comprobar, en diferentes escenarios y con diferente tareas, la validez de las estrategias de coordinación y cooperación propuestas en la tesis se utilizan los robots de la flota FRACTAL, que sirven como plataforma de prueba para tareas como el uso de vehículos aéreos y terrestres para apoyar labores de búsqueda y rescate en zonas de emergencia y la cooperación de una flota de robots para labores agrícolas. Se demuestra además, que el uso de la técnica de control no lineal conocida como Control por Modos Deslizantes puede ser aplicada no solo para conseguir la navegación autónoma individual de un robot aéreo o terrestre, sino también en tareas que requieren la navegación coordinada y sin colisiones de varios robots en un ambiente compartido. Para esto, se conceptualiza teóricamente el uso de la técnica de Control por Modos Deslizantes como estrategia de coordinación entre robots, extendiendo su aplicación a robots no-holonómicos en R2 y a robots aéreos en el espacio tridimensional. Después de dicha contextualización teórica, se analizan las condiciones necesarias para determinar la estabilidad del sistema multi-robot controlado y, finalmente, se comprueban las características de estabilidad y robustez ofrecidas por esta técnica de control. Tales comprobaciones se hacen simulando la navegación segura y eficiente de un grupo de UGVs para la detección de posibles riesgos ambientales, aprovechando la información aportada por un UAV. Para estas simulaciones se utilizan los modelos matemáticos de robots de la flota RoMA. Estas tareas coordinadas entre los robots se hacen posibles gracias a la efectividad, estabilidad y robustez de las estrategias de control que se desarrollan como núcleo fundamental de este trabajo de investigación. ABSTRACT This thesis presents the development of a cooperation scheme between unmanned ground (UGV) and aerial (UAV) vehicles. This scheme is the basis for forming two fleets of autonomous robots (called FRACTAL and RoMA). In order to assess, in different settings and on different tasks, the validity of the coordination and cooperation strategies proposed in the thesis, the FRACTAL fleet robots serves as a test bed for tasks like using coordinated aerial and ground vehicles to support search and rescue work in emergency scenarios or cooperation of a fleet of robots for agriculture. It is also shown that using the technique of nonlinear control known as Sliding Modes Control (SMC) can be applied not only for individual autonomous navigation of an aircraft or land robot, but also in tasks requiring the coordinated navigation of several robots, without collisions, in a shared environment. To this purpose, a strategy of coordination between robots using Sliding Mode Control technique is theoretically conceptualized, extending its application to non-holonomic robots in R2 and aerial robots in three-dimensional space. After this theoretical contextualization, the stability conditions of multi-robot system are analyzed, and finally, the stability and robustness characteristics are validated. Such validations are made with simulated experiments about the safe and efficient navigation of a group of UGV for the detection of possible environmental hazards, taking advantage of the information provided by a UAV. This simulations are made using mathematical models of RoMA fleet robots. These coordinated tasks of robots fleet are made possible thanks to the effectiveness, stability and robustness of the control strategies developed as core of this research.

El concurso “Berlin Hauptstadt” 1957-1958 : aproximaciones al proyecto de espacio público europeo de posguerra

1. INTRODUCCION 2. LA ORGANIZACIÓN DEL CONCURSO 3. MONUMENTALIDAD Y ESCALAS CERCANAS Los CIAM de Bridgewater y Hoddesdon. El carácter institucional del urbanismo moderno Las propuestas premiadas 4. PLANTA LIBRE Y PREEXISTENCIAS El CIAM 7 de Bérgamo. El debate sobre la reconstrucción Nada que conservar. La propuesta de Le Corbusier Desde el interior. La propuesta de Luiggi Piccinato 5. LA VIDA EN LA CALLE. SUPERPOSICION DE USOS EN EL ESPACIO PÚBLICO De Hoddesdon al manifiesto de Doorn y Dubrovnic. Usos compartidos. La propuesta de Van der Broeck y Bakema Una calle en alto. La propuesta de Alison y Peter Smithson “The charged void”. Dos sillas y el rastro de una acción 6. EL PAISAJE COMO PUNTO DE PARTIDA El CIAM de la Sarraz. Hacia una definición de “Urbanismo” De la “Grosstadt” al “StadtLandschaft”. La propuesta de Korn y Rosemberg Infraestructuras para un paisaje de mesetas. La propuesta de Abben, Anderson y Utzon 7. OTRAS HUELLAS PARA OTRA SOCIEDAD Forma y contenido de Berlín-Mitte. La propuesta de Scharoun. El paisaje chino propuesto por Ebert y Scharoun 8. CONCLUSIONES Cambios de contexto y búsqueda pragmática De la necesidad de humanizar. Momentos de conciencia INTRODUCCION El espacio público siendo quizás uno de los campos en que con más frecuencia se trabaja en los últimos años, carece sin embargo de episodios suficientemente alejados en el tiempo que nos permitan reconocer su historia reciente. La irrupción del pensamiento organicista y más tarde existencialista tras el final de la 2ª Guerra Mundial cambiaron el modo de pensar en todas las áreas del conocimiento, también en aquellas relativas al urbanismo y el proyecto de ciudad. El cambio de contexto encontrado en las capitales europeas tras los bombardeos de la Guerra (figura1) cristalizó en la necesidad de una ciudad “humanizada”. Esta necesidad se reconoce en algunas propuestas aisladas de aquellos años que se han estudiado usualmente como precursoras de otras mas actuales , pero son cuestiones que también fueron transformando la forma de pensar el espacio público en los diferentes debates de urbanismo llevados a cabo en los Congresos Internacionales de Arquitectura Moderna, influyendo de manera determinante en la continua revisión de las prerrogativas de la “Carta de Atenas” y llegando a estar en la base de su disolución final escenificada por el Team X en Oterloo en 1959. A pesar de las continuas revisiones que se habían llevado a cabo en el periodo de postguerra, la distancia entre los presupuestos teóricos y las realidades urbanas que se encontraban los participantes en los CIAM de aquella época, llevó a un cierto escepticismo y a un desplazamiento de intereses desde la teoría urbanística a la práctica proyectiva, tratando de resolver cuestiones concretas para posteriormente extraer conclusiones. LA ORGANIZACIÓN DEL CONCURSO El concurso: “Berlin Hauptstadt”, un ambicioso Plan para la Capital de una Alemania unida convocado en 1957 por la “Internationalles Bauaustellung” berlinesa, fue un último episodio en los debates de urbanismo moderno de aquel periodo de disolución que nos muestra las incertidumbres y contradicciones de algunos participantes al enfrentarse al proyecto de espacio público desde la desconfianza en las bases teóricas. Si bien en cuanto a los proyectos de edificación, apenas se percibieron cambios en las propuestas presentadas al concurso, en algunos casos, el proyecto de espacio público si presentó ciertas variaciones respecto a las pautas urbanísticas presentadas por los CIAM de aquellos años. Se plantea el estudio de Berlin Hauptstadt como un último registro de estas reacciones pragmáticas ante el cambio de contexto, que nos permita encontrar matices y diferencias de interpretación entre algunas de las propuestas para desvelar a través de ellas las condiciones latentes en el proyecto de espacio público de posguerra europeo. La batalla propagandística derivada de la tensión existente entre los dos bloques que gobernaban la capital alemana en aquellos años, protagonizó la mayor parte de las decisiones sobre la ciudad y sus espacios públicos. En Berlín occidental se realizaron múltiples exposiciones sobre los diversos planes urbanísticos propuestos divulgando un modelo de ciudad moderna abierta y de planta libre, que equilibraría las carencias de soleamiento y espacios verdes existentes hasta el estallido de la Guerra. Entre otras, se impulsó la “Internationalles Bauaustellung” en 1957 conocida como IBA´57, en la que se llevaron a cabo actuaciones como la reconstrucción del nuevo “Hansaviertel” además de otros eventos entre los que destacaba el concurso “Berlin Hauptstadt”. Berlín se presentaba en la convocatoria como la futura capital de una Alemania unificada, que le llevaba a asumir un programa muy extenso y segregado, basado en una nueva red de autopistas y ferrocarriles común para toda la ciudad. Esta utópica premisa fue sin embargo acogida con cierta esperanza de viabilidad real por parte de los participantes, quienes en su mayoría mostraron una preocupación común por lo que coincidieron en llamar “humanizierung der Stadt” la humanización de la ciudad en las memorias presentadas. La humanización era sin embargo algo difícil de lograr en el Berlín de aquellos años. La ciudad o mejor dicho las dos ciudades estaban una vez más sumidas en su propia idea de reconstrucción, como la capital “permanentemente a medio hacer” que ya describía Karl Scheffer a principios de siglo XX. De este modo mientras Berlín era proyectado desde estudios provenientes de países lejanos, para unas autoridades militares afanadas en ganar su particular batalla propagandística con el urbanismo como mejor arma, la necesidad de humanizar el espacio público se fue haciendo cada vez más presente con el paso de los años. Una ciudad real, habitada desde el espacio necesario para las acciones cotidianas, se iba consolidando silenciosamente sobre los descampados y vacíos urbanos de la capital. Las fotografías de Fritz Tiedemann y Arno Fischer (figuras 4,5,6,7) realizadas durante los primeros años tras el final de la guerra, nos muestran un paisaje de ruinas y escombros en las que quedaban registradas los rastros de una escondida cotidianeidad. En estas fotografías las ausencias se hacían mas presentes que las ruinas de la ciudad anterior, enfocando las imágenes en los ejes de las interminables avenidas, la antigua capital prusiana se percibe como un descampado continuo . MONUMENTALIDAD Y ESCALAS CERCANAS Los CIAM de Bridgewater y Hoddesdon. El carácter institucional del urbanismo moderno La mayoría de las propuestas presentadas al Concurso Berlin Hauptstadt, se desarrollaron por tanto desde unas premisas modernas que ya entonces llevaban más de una década en crisis continua. La eclosión de nuevos países en todo el mundo, que inauguraban sus recién instauradas democracias con nuevas capitales que las representasen, había alimentado durante aquellos años las discusiones teóricas llevadas a cabo en el seno de los CIAM actualizando en ciertos aspectos una “Carta de Atenas” que sin embargo se mostraban incompatibles con la recuperación de las ciudades europeas tras los bombardeos de la 2ª Guerra mundial. Estos desencuentros habían ido cambiando la forma de pensar el espacio público e intensificando su debate en los últimos Congresos Internacionales de Arquitectura Moderna. Las críticas a las actas del primer CIAM celebrado tras el final de la contienda en Bridgewater (Reino Unido) en 1947, recogidas en escritos como “Monumentalist, Symbolism and Style” por Lewis Mumford y repetidas en distintas ocasiones desde que declinó la invitación de José Luis Sert para redactar el prólogo de “Can our cities survive?” en 1940, empezaron a desestabilizar las hasta entonces férreas convicciones de los participantes. La búsqueda de una ciudad más humanizada apareció como preocupación común en las actas redactadas por Giedion, donde se entendía además logro suficiente la reanudación de los encuentros, emplazándose a proponer los temas a debatir en el próximo Congreso . Esta cualidad humana era la base del “corazón de la ciudad” que José Luis Sert propondría como tema repetidamente hasta que finalmente fue recogido como título del CIAM 8 celebrado en Hoddesdon (Inglaterra) en 1951. También sería en Hoddesdon, donde como expone Eric P. Mumford , donde se confirmó una cierta conciencia de globalización de los preceptos modernos que ya aceptados como lugar común por los poderes políticos de los distintos gobiernos no podrían volver a jugar el papel de vanguardia que se le suponía. Las propuestas premiadas Pocos años después en 1967 en su monografía editada por W. Boesiger y H. Girsberger44: Le Corbusier dejaba constancia del airado desacuerdo con que recibió el fallo del jurado, en un escrito publicado “El hecho de pensar en urbanismo en 3 dimensiones fue considerado como un crimen. De 86 proyectos se admitieron 13, pero el decimotercero era el de Le Corbusier. Fue eliminado.” Criticando así una referencia que hacían las actas a los enormes rascacielos de planta triangular que el maestro suizo superponía sobre la vieja trama berlinesa. A pesar de las enormes dificultades existentes en las Alemanias de después de la Guerra, el espíritu con que se había propuesto el concurso Berlin Hauptstadt desde la organización del IBA´57, era muy próximo al de las nuevas capitales democráticas recién fundadas profusamente expuestas en 1951 en el CIAM de Hoddesdon. Se hacía mas hincapié en lograr estos aspectos representativos y de escala monumental que debían tener las áreas institucionales que en atender a las condiciones de entendimiento con el centro histórico que tanto preocupaban ya en otras capitales europeas aquellos años. Pero si bien las bases del Concurso se habían establecido sobre estos criterios, la resolución del jurado tuvo sin embargo muy en cuenta ciertas consideraciones en cuanto a la escala de las nuevas edificaciones propuestas y al encuentro con la estructura de la ciudad existente. PLANTA LIBRE Y PREEXISTENCIAS El CIAM 7 de Bérgamo. Intervenir sobre lo existente Los principios del urbanismo moderno descritos en los CIAM de los años 1920 y 1930, desde las primeras ciudades ideales propuestas hasta la redacción de la más tarde conocida como “Carta de Atenas”, estaban pensados generalmente sobre una naturaleza teórica más o menos fértil y habitable que obviaba aquellas particularidades del lugar en el que se producían. Tras la guerra, los desoladores paisajes de retazos urbanos en que se habían convertido las capitales europeas, hacían difícil ignorar las nuevas condiciones del terreno con las ruinas de unas ciudades que poco antes estaban allí. La propuesta para la reconstrucción de Milán, fue presentada por Ernst N. Rogers en la primera sesión del CIAM de Bérgamo, como un trabajo acorde con los preceptos urbanísticos de la Carta de Atenas y capaz de incorporar la restauración de los centros históricos como parte de un plan urbanístico moderno. Se reabría así un debate en el seno de los CIAM, después de que hubiese sido ya puesto sobre la mesa por los arquitectos polacos de origen judío Helena y Syzmon Syrkus en las reuniones preparativas para el CIAM 7 llevadas a cabo un año antes en Paris. El Plan “Varsovia Socialista” incorporaba la reconstrucción del centro histórico de las ciudades a otras actuaciones basadas en la Carta de Atenas, como una reivindicación de identidad cultural ante la barbarie nazi. Helena Syrkus, a quien Giedion reservó una hora en la rueda de conferencias de la sesión inaugural del CIAM de Bérgamo, reclamaba este tipo de actuaciones como parte de una revolución “socialista-realista” que suponía un cambio cultural en la vida de los ciudadanos. Estas intervenciones, llevaron a un debate más amplio que el de la reconstrucción y conservación de centros históricos, planteándose asuntos que eran debatidos por la ciudadanía en otros ámbitos. Nada que conservar. La propuesta de Le Corbusier Le Corbusier (figura1), llevó a cabo Berlin Hauptstadt en paralelo a otros trabajos que ya en aquella época prestaban mas atención a las condiciones particulares del lugar como Chandigarh, trabajó en Berlin partiendo desde un plano teórico con el que superponía con toda libertad una versión reeditada de la “Ville Radieuse”, apenas adaptada al entramado aún presente de la antigua ciudad. Así describía la situación de partida: ”No había duda, no se habrían de destruir obras maestras del pasado para reconstruir. La demolición se debió a los aviones y no quedaba nada de todo el centro de Berlín.” Desde el interior. La propuesta de Luiggi Piccinato El final caótico del Congreso de Bérgamo, tuvo aún una última crítica quizás una de las más difíciles de salvar meses después de la clausura. El crítico italiano formado en Harvard Bruno Zevi dirigía una carta a los participantes: “De´lla cultura architettonica: Messagio al Congrés International d´Architecture Moderne”. poniendo de relieve cómo los CIAM habían perdido la batalla para liderar el debate arquitectónico al no contar con algunos de los arquitectos de la escena internacional que habían desarrollado sobre los principios de Frank Lloyd Wright, una arquitectura llamada orgánica. Con estos principios se trasladaba la idea de construir desde el interior hacia el exterior tanto la arquitectura como la propia ciudad, heredando las estructuras existentes y desarrollándolas como el crecimiento continuo de los organismos vivos. Este principio hacía necesario alejarse de los planteamientos más teóricos del urbanismo moderno, en favor de una práctica proyectiva concreta que asumiera las vicisitudes concretas del lugar en el que se trabaja. Bruno Zevi fundó la A.P.A.O. en Italia, junto con otros arquitectos y urbanistas entre quienes estaban Pier Luiggi Nervi y Mario Ridolfi además del urbanista Luiggi Piccinato. Tras el final de la Guerra, Piccinato lleva a cabo diversos Planes de Reconstrucción de ciudades históricas como Nápoles Roma o Siena y en los años 1950 de las principales capitales turcas, como Estambul y Bursa. El valor patrimonial que detecta en estas capitales de la historia arquitectónica lo asociaba a las cualidades constructivas más básicas, aquellas que realizadas sin arquitectos representaban la herencia de una cultura propia. La propuesta que presentó Luiggi Piccinato al concurso Berlin Hauptstadt (figura2), bien puede considerarse como una mas de las actuacicones realizadas hasta entonces, no había en ella una sola estructura basada en datos socioeconómicos que determine el orden general. sino que su propuesta se basaba en la suma de distintos proyectos concretos que resuelven espacios urbanos de características particulares. El plan General propuesto es consecuencia directa de estas pequeñas actuaciones con las que va re-describiendo la trama urbana de todo el área central. Un entramado de plazas interiores se incorporaban a las manzanas aún existentes, ordenando así los vacíos tan característicos de la ciudad para volver a coser las estructuras que aún quedaban en pie. Re-describir las trazas de una ciudad tan denostada por aquel entonces. LA VIDA EN LA CALLE. SUPERPOSICION DE USOS EN EL ESPACIO PÚBLICO De Hoddesdon al manifiesto de Doorn y el CIAM de Dubrovnic. El “Corazón de la Ciudad” siendo uno de los pocos temas de debate claros en el CIAM de Hoddesdon llevó sin embargo a varias críticas. Una de las más interesantes fue la protagonizada por Jacob B. Bakema y Sigfried Giedion por la posterior repercusión que tendría en las ideas que forjarían el Team X años más tarde. Giedion defendía los antecedentes históricos que daban soporte al corazón de la ciudad como hecho único, mientras que Bakema, tomando como ejemplo los parques infantiles llevadas a cabo por Aldo Van Eyck en los vacíos de Ámsterdam, abogaba por romper el aislamiento del hombre en la ciudad y poner en valor las relaciones entre las personas y objetos, a escala de barrio llevando distintos centros a todos ellos. Una de las primeras consecuencias de esta afirmación, fue la obsolescencia del criterio de segregación por áreas funcionales de la ciudad, una de las piedras angulares del urbanismo hasta entonces. La cuestión del uso. superposiciones en el espacio público En búsqueda de esa ciudad de siempre la propuesta presentada por Van Der Broeck y Bakema para Berlin Hauptstadt, trataban de llevar a cabo una disgregación del exhaustivo programa de usos propuesto en las bases para generar una serie de espacios públicos centrales. La relación entre programa y ciudad se fraguaba así como un esquema multi-centros en el que los usos, lejos de presentarse segregados se superponían por capas en un mismo espacio. La vida de los pueblos y aldeas antes de la llegada de la planificación urbana se concentraba en su espacio público, en su origen las primeras poblaciones carecían de edificios de un solo uso específico como mercados, teatros, etc, estas acciones tenían cabida de forma más o menos espontánea en el suelo libre disponible entre las casas. “The charged void” . El vacío cargado en la propuesta de los Smithson In calling our collected works The Charged Void we are thinking of architecture’s capacity to charge the space around it with an energy which can join up with other energies, influence the nature of things that might come, anticipate happenings… a capacity we can feel and act upon, but cannot necessarily describe or record. Con este escueto pero intenso párrafo, Alison y Peter Smithson hacían una aproximación un tanto indeterminada, a la idea de charged void como espacio público lleno de vida, invitándonos quizá a preguntarnos sobre esa necesidad de espacio vacío para respirar, cada vez más acuciante en la arquitectura de nuestras ciudades. La propuesta para “Berlin Hauptstadt” de Alison y Peter Smithson, ganadora de un 3er premio, se basaba en un entramado de calles en alto que se extendía sobre la antigua ciudad superponiéndose como una nueva trama. Este tejido de calles, con unas dimensiones suficientemente amplias para redefinir Berlín pero a la vez suficientemente cercanas para participar de la vida cotidiana de la ciudad, se presentaba con independencia de las edificaciones existentes y propuestas como el gran protagonista de la intervención. Proponían un entramado más o menos coincidente con el trazado de la ciudad, dejando que pequeñas torres de esquinas achaflanadas albergaran las oficinas, las viviendas y los espacios comerciales, adosándose tan sólo en una de sus caras al entramado peatonal propuesto. Las calles tenían dimensiones sobradas para la mera conexión de barrios y sin embargo tampoco tenían un uso específico, estaban pensadas para albergar todos los eventos cotidianos que se superponían en los barrios y pequeñas poblaciones de la época. EL PAISAJE COMO PUNTO DE PARTIDA El CIAM de la Sarraz. Hacia una definición de “Urbanismo”. En los congresos CIAM, desde el primer encuentro celebrado en La Sarraz en 1928, la necesidad de definir el término “urbanismo” como método objetivo de proyectar la ciudad, había llevado a excluir aquellas otras consideraciones relativas al paisaje que no eran fácilmente analizables. Las consideraciones entorno al uso, al soleamiento, a la facilidad de acceso, de edificación o a las óptimas densidades de ocupación de un territorio, debían estudiarse sin más distracciones con un análisis objetivo que regiría posteriormente todo planteamiento urbanístico. Así, en el primer punto del acta redactada en francés, del CIAM I de La Sarraz, se definía: “1. Urbanismo es la organización de todas las funciones de la vida colectiva. Se extiende sobre las aglomeraciones urbanas y el campo. La urbanización no puede estar condicionada por las pretensiones de un esteticismo preexistente, su esencia es la de un orden funcional” … De la “Grosstadt” al “StadtLandschaft”. La propuesta de Korn y Rosenberg. En 1957, algunas de las propuestas presentadas al concurso Berlín Hauptstadt, como la de Arthur Korn y Stephen Rosenberg, tuvieron el paisaje como punto de partida del proyecto. La propuesta presentada 15 años después para Berlín Hauptstadt, formando equipo con Stephen Rosenberg, con quien se asociaría poco después en Londres, planteaba un paisaje fluvial generado directamente por una gran placa plana. La placa, como aquellas de origen sedimentario que bordean los cauces de los ríos, fluctuaba ampliando y disminuyendo su ancho y se deshacía incrustándose en la trama urbana existente, ahuecando su interior para dar cabida a los distintos espacios públicos del programa. Como apunta Keneth Frampton , la propuesta presentada por Korn y Rosenberg evolucionaban desde el concepto de Grosstadt (gran ciudad) a la idea de Stadtlandschaft (ciudad-paisaje), ya que si bien en el plan propuesto para la reconstrucción de Londres eran las trazas del viario y la parcelación las que respondían a las prerrogativas del paisaje, en Berlín se daba un paso más, confiando en una superestructura de carácter orgánico la resolución de todos los aspectos tanto institucionales como terciarios que se proponían en el programa, que eran posteriormente incluidos en el proyecto. Los primeros esbozos del paisaje lineal entorno al rio Spree a su paso por Berlín, posibilitaron a los autores reconocer cierta unidad en lo que se presentaba como una amalgama de retazos fragmentados y dispersos en el que la Capital no era reconocible. Pero si bien estos apuntes, habían logrado cierta ilusión de cohesión y continuidad en torno al paisaje fluvial del Spree, al desarrollarse con precisión, los autores trasladaban directamente a las plantas generales y axonometrías de la propuesta los sinuosos contornos, haciendo ciertamente complicado el encuentro con la trama existente (figuras 26 y 27). La gran determinación con que trataban sus autores de no perder las virtudes intuidas en sus primeros apuntes, les llevaba a abandonar las pautas de zonificación y separación por unidades funcionales que se establecían en los CIAM para aproximarse a su realidad constructiva desde una utópica confianza en sus valores plásticos como solución de los problemas urbanos encontrados. Un paisaje de mesetas. La propuesta de Abben, Anderson y Utzon. Si bien por un lado, la adopción de criterios paisajísticos como punto de partida liberaba de las rígidas pautas de zonificación determinadas en las “Grilla CIAM”, a otra escala suponía distanciarse de las condiciones sociales en las que se asentaba la población berlinesa. La mayor parte de los proyectos de paisaje presentados, compartieron una prerrogativa: El espacio verde en torno al Rio Spree, fue propuesto como elemento estructurador de la nueva capital. La propuesta presentada por el equipo de Jorn Utzon, mostraba con radicalidad esta doble condición del paisaje poniendo a prueba las experiencias vividas sobre las plataformas del Yucatán en México. Unas plataformas vinculadas a la nueva red de autopistas berlinesas, que albergaban aparcamientos en su interior y daban soporte a los distintos edificios de usos institucionales. Mientras la cota superior a la masa arbórea pertenecía a una visión limpia de horizonte nítido desde el que se podía divisar el valle del Spree y las infraestructuras que lo atravesaban, el nivel inferior quedaba vinculado a las trazas de la ciudad, ocupado generalmente por las viviendas. NUEVAS HUELLAS PARA OTRA SOCIEDAD Forma y contenido de Berlín-Mitte.La propuesta de Hans Scharoun Al presentar Hans Scharoun el “Kollektiv Plan” para la reconstrucción de la ciudad en 1946, proponía una trama flexible de autopistas o vías de circulación superpuesta a los campos de ruinas y escombros de la Berlín de aquellos años. El área central de la antigua ciudad, se incorporaba a una enorme banda verde que atravesaba todas las áreas urbanas discurriendo en paralelo a las márgenes del rio Spree. Se negaba la cuidad radio concéntrica, para proponer una trama o red flexible paralela y perpendicular al rio. Quedaban sin embargo en el plan muy pocos detalles de lo que podría ocurrir bajo esa trama en el interior de la retícula, tan sólo quedaba esbozado un gran área libre de edificación que cruzaba como una gran banda verde la ciudad continuando la márgenes naturales del rio Spree hacia el Tiergarten. Aunque la definición de las áreas interiores al entramado quedaba quizá fuera del ámbito de estudio que por aquel entonces les estaba encomendado, la idea de superposición de la trama viaria sobre el valle de ruinas del Spree originaba una nueva conciencia que abría la puerta a trabajar con una doble materialidad. Aquella propia de las ciudades antiguas que por aquel entonces describía en diversos textos. La propuesta logró un 2º premio siendo quizás una de las que menos relación mantenía con las anteriores trazas urbanas berlinesas. En el acta del jurado, se reconocía el acierto de desarrollar el área verde atravesando la ciudad en cuanto a “acogida para el que llega de fuera”. En la memoria que presentó Scharoun junto con Wills Ebert al Concurso Berlin Hauptstadt, se analizaba el área de actuación recordando cómo fueron originados los barrios sobre las poblaciones medievales de Friedrichstadt y Luisenstadt anteriores a las grandes obras urbanizadoras de la corte prusiana y al desarrollo de la metrópoli del s. XX: “Características y de identificable naturaleza son las estructuras de los barrios medievales de Luisenstadt y Friedrichstadt. En estas partes de la ciudad la forma y el contenido aún eran idénticos”… …”convivimos con ellas entendiéndolas como parte de nuestro patrimonio, sin ser muy conscientes de sus contenidos y sus transformaciones a lo largo del tiempo. La pérdida en general de sus principios ordenadores lleva a dejar expuesta la ciudad. Estamos en todos los ámbitos de la planificación urbana ante la dificultad de gestionar con eficacia nuestras tensiones y establecer una nueva transición en las relaciones sujeto-objeto. De ahí que el moderno sistema de circulación yuxtapuesto nos lleve a la indecisión y por tanto a la confusión, en lugar de ordenar las diferencias y clarificar.”80 La memoria para Berlín Hauptstadt, presentaba la estructura medieval del área de intervención como una necesidad para no dejar “expuesta a la ciudad”, sin embargo en las planos presentados al concurso no resulta fácil reconocer este cuidado con las trazas históricas en la ciudad, más bien parecía haberse borrado toda huella de otro tiempo en un gran vacío verde. Es posible que las trazas a las que hacían referencia Scharoun y Ebert, fueran aquellas anteriores a las urbanizaciones de la corte prusiana en 1780, cuando los caminos agrícolas y los arrabales extramuros trazaban las primeras huellas de la ciudad sobre las que más tarde se trazarían los barrios de la capital de Prusia. Estas primeras huellas berlinesas recogidas en publicaciones como “Die Dörfer in Berlín” por Hans Jürgen Rach 81muestran un campo ya humanizado, surcado por caminos y huertas, que hacía reconocible la vida de la sociedad que los habitaba. El paisaje chino propuesto por Ebert y Scharoun Un texto titulado “Urbanismo Chino” escrito en Berlín durante los últimos años de guerra y publicado dos años después de su fallecimiento en 1972, ilustrado con algunas de sus acuarelas realizadas en la misma época74, en la monografía sobre su obra de la Akademie der Kunste de Berlin, desvelaba algunas de las preocupaciones urbanas y paisajísticas del arquitecto en el periodo de postguerra. En el texto Scharoun dejaba constancia de su admiración por las formaciones o Gestalt75 con que nacían las ciudades chinas, tomándolas como posible ideal o modelo de un urbanismo organicista. Este otro urbanismo se exponía como consecuencia de las acciones de una cultura y una sociedad determinada, suficientemente humanas como para cristalizar en estructuras capaces de convocar a sus semejantes, y de ordenar entorno a ellas la vida de toda la población. “El arte de proyectar con buen gusto el cielo, la tierra, los árboles y los ríos como parte vinculante de sus creencias, condujo a la cultura china a una sólida tradición del diseño que permitió el perfeccionamiento y desarrollo de la continuidad urbana. …la formulación de una estructura alveolar sociológica y espiri tual del cuerpo político como un organismo vivo que deja espacio para construir con natural continuidad las transformaciones… Ordenando por temas posteriormente, las distintas continuidades urbanas: “…1. Muros. Están en todo el país, en la ciudad, en los distritos sagrados y los palacios, de los barrios familiares a los muros que los rodean. Limitan y comparten el uso del suelo por una parte y por otra, proveen de una escala moderada a las células habitacionales, que les permitía variar de forma ordenada desde la escala cercana a la gran escala espiritual de la ciudad… Los muros trabajan como elementos constructivos creadores de espacio, hacia el interior, con un cierto límite, ya que es este un espacio determinante. 2. Ejes. Se construyen - como ejes ópticos - llevando a las ya mencionadas células hacia su correspondiente significado espiritual... 3. La luz. Su estudio es especialmente importante. Los frentes uniformes de numerosos edificios públicos con los barrios al sur, tienen las personas una relación cotidiana con la luz, cuya claridad y fuerza apenas se puede experimentar en las azarosas ciudades occidentales. 4. Construcción. Con la misma actitud espiritual tan impregnada en su cultura, se ordenan también las células más importantes de la ciudad, las salas y espacios principales de los templos, palacios y edificios públicos de los barrios residenciales. Cual bosquecillos en un paisaje construyen condensaciones, sin delimitar estas células urbanas. 5. Tejados. (Exagerando) Sí, flotan cual nubes sobre la tierra sobre las construcciones realizadas con esa actitud espiritual. Tienden sobre esas construcciones la capa probablemente más simbólica de todas. Con ligeros matices, los chinos logran agrandar el pequeño espectáculo de la protección de la techumbre. 6. Las terrazas elevadas. El terreno se prepara con moderación y con cuidada moderación se distancian del suelo, porque la vida no se separa de la esclavitud de la tierra. Sin embargo está enriqueciendo y transformando el mundo a su escala, sin hacer ruido.… 7. Calles. Las vías representativas como la que lleva en Pekín hasta la puerta de entrada al palacio de la ciudad prohibida, contrastan con las interiores que son meros carriles de descongestión de los densos distritos residenciales. Estas calles son franjas de arcilla que discurren entre las altas tapias de las casas donde tan solo tiene lugar el juego de la vida, en familia. De este modo las pequeñas calles con su forma cambiante, son también parte de un único orden espiritual, formadas por la expansión sustancial de las construcciones adyacentes… 8. El Paisaje. Se tienen así paisajes a distintas escalas, realizados o desarrollados desde tamaños inminentes a escalas cercanas a la mano del hombre. También cuando los paisajes están fuera de los ámbitos urbanos son ordenados y utilizados, quedando en ellos bellos retazos asilvestrados, porciones vivas y muertas, y refugios de los demonios. Naturalezas ocupadas y libremente vividas en un rico intercambio. Ya sean partes de paisajes grandes o pequeñas, fuera o dentro de las ciudades, son ciertamente de distintos escalas pero no por ello distintos. No hay (como en los jardines occidentales) naturalezas desarmadas. …” Estos aspectos del urbanismo chino revelaban una gran preocupación por aquellos temas relativos a las características de las condiciones públicas de las ciudades y de sus paisajes, al tiempo que un cierto distanciamiento del problema de la vivienda, aún con las acusadas carencias que en este sentido presentaban las ciudades del periodo de postguerra y a pesar de haber sido tantas veces el centro de los intereses de los CIAM. Dejaban entrever la necesidad de encontrar la ciudad como cristalización de una cultura y sociedad. Las instituciones públicas debían ser capaces de convocar a la población mientras que las casas tenían su propia existencia más o menos espontánea y ligada a la tierra, con un mayor grado de libertad e independencia respecto a los planes de los urbanistas. Pero muchas de estas condiciones que Scharoun encontraba en las ciudades chinas, estaban también presentes en la mayoría de las ciudades medievales centroeuropeas, incluyendo a la propia Berlín. La ciudad medieval de Praga, con su característico skyline de cúpulas, cubiertas y torres ABSTRACT Hypothesis Working method Study state 1. BERLIN HAUPTSTADT: 1945 – 1958 1945. Governments and divisions in post-war Berlin 1946. The “KollektivPlan” 1948. The Bonatz Plan 1957. The IBA´57 2. THE SET-UP Planning a Capital. “Berlin Hauptstadt” The working area The jury and the competition programme The refute of Walter Gropius The Berlin Capital requirements 3. MONUMENTALITY AND CLOSER SCALES The C.I.A.M. at Bridgewater and Hoddesdon. Modern urbanism as institutional urban planning thinking Finalists and Shortlisted proposals 4. OPEN FLOOR PLAN AND PREEXISTENCES AFTER WAR “The as found” The C.I.A.M. 7 in Bergamo. About the rebuild of old cities “Nothing to conserve.” Le Corbusier´s Plan for Berlin. From Inside. The plan proposed by Luiggi Piccinato. 5. LIFE IN THE STREET. OVERLAYED USES ON ANCIENT PUBLIC SPACES Form Hoddesdon to Dubrovnic, and the Doorn manifesto. Shared uses. The Plan proposed by Van der Broeck and Bakema Streets in the air. The Plan proposed by Alison and Peter Smithson “The charged void”. Two chairs and an action trail. 6. LANDSCAPE AS A URBAN PRINCIPLE 1957. The irruption of urban motorways Plan Towards a definition for “Urbanism.” The C.I.A.M. in LaSarraz. From “Grosstadt” to “StadtLandschaft.” The proposal by Korn and Rosemberg Chinese landscapes. The proposal by Ebert and Scharoun 7. FOOTPRINTS OF A NEW SOCIETY The influence of other avant-gardes Paths and trails in Albert H. Steiner proposal Berlín-Mitte Form and contains. References to medieval city in the proposal by Scharoun From Friedrichshein to Berlin Hauptstadt. 8. CONCLUSIONS Changing context and pragmatism Human city necessity after war BIBLIOGRAPHY Essential Bibliography Specific publications Specific publications contemporary to “Berlin Hauptstadt” competition General Bibliography APPENDIX Documents Specific publications ABSTRACT Public space, being perhaps one of the urbanism most studied topics on last years, however lacks events sufficiently distant in time to recognize its recent history. The emergence of organic and later existentialism philosophies after Second World War changed the way of thinking in those areas of knowledge relating to urbanism and city planning. The switched context found in European capitals after the War crystallized the need for a "humanized" city. This need is recognized in some isolated proposals of those years , but these questions were also present in the way public space was thought in different debates and urban planning discussions hold at the International Congresses of Modern Architecture, where the decisive influence of the "Athens Charter" prerogatives and its several reviews was on the basis of its final dissolution staged by Team X in Oterloo in 1959. Despite the on going revisions conducted in the post-war period, the gap between theoretical assumptions and urban realities that CIAM participants found at that time, led to some skepticism and a loss of interest in urban theories and aimed them to set on a projective practice, solving specific issues for further general conclusions. The "Berlin Hauptstadt" Competition, an ambitious Plan for the capital of a united Germany convened in Berlin 1957 by the "Internationalles Bauaustellung" was a last episode in this period of discussions and dissolution of modern urbanism that shows uncertainties and contradictions of some participants when were faced to the public space projects distrusting their theoretical bases. While building projects regarded more or less as they were in pre-war period, in some cases, the public space projects presented in the submitted proposals, are perceived with some important variations comparing to the planning guidelines defended by the CIAM urbanism at that time. Thus, the study of Berlin Hauptstadt competition is here presented as a compilation of these pragmatic responses to the switched context, which will allow us to find nuances and differences of interpretation between some of the presented proposals to reveal through them latent conditions in the public space projects at European post-war. CONCLUSIONS Changing context and pragmatism After having a view of the different concepts used by the participants in their proposals presented to the competition, there is a first conclusion we can drop out. The postwar in Berlin, from the Postdam conference until the Wall erection in august 1961, revealed a frozen period in its recent history on which no urban plan was developed under urban arguments nor theories. Most of the urban changes occurred where done by political decisions. Somehow the global urbanism promoted by the postwar CIAMs helped to this situation, the City planning as a standardized method allowed politicians to use it as a tool for propaganda and so to fight for their own interests. Although the specific situation of Berlin, the use of urbanism as a tool for propaganda has been also a usual problem after second world war in some European cities. But meanwhile modern urbanism became an institutional tool and architects and urban planners refuted it beginning then their own research on city planning from a projective practice by solving concrete questions they found in the given context. Thus, we have the proposal of Piccinato in Berlin Hauptstadt working with the existing to develop a non conclude city, far away from previous works like the one of Villa Sabaudia (1934) organized as an axial and well oriented, shaped city. We find in the Smithson proposal a complex city centre with a “charged void” conception, much more picturesque and aerial than the one projected for Golden Lane, four years before. Their concept “area of quietude” proposed at the Berlin competition was used once again a year after, in the elevated plaza that support the Economist buildings. At last we find that Landscape was again used to city planning and thus many proposals were not based on such concepts as transport main lines or building zonings, but in imagined landscapes, which were after filled up with the program. The proposal presented by Arthur Korn and Stephen Rosenberg was quite a renounce of the CIAM principles, which Korn drew up with the “Ernst May Brigade” in the soviet cities between 1930 and 1933 and ten years later in London with the MARS group. Utzon with Abben and Anderson, also settled up another landscape concept which he import from distant cultures to Berlin. He used the Mayas platforms from the Yucatan half island, and the oriental ones as well, in different projects during those years when he was fling constantly from Denmark to Sidney. But he used it not only to project specific buildings like the one of Sidney Concert Hall, in Berlin and later in other places of a smaller scale such concepts were used for urban planning as well. Landscape was also the final solution for a concept, which Hans Scharoun was working on during all these postwar years in Berlin. The Spree-band he already proposed inspired by Peter Friedrich in the Kollektivplan (1946) as a consequence of the traffic main lines and as a logic separation of functions of the city, was presented in Berlin Hauptstadt as a liberated build mass which disposed at the Leipzigerstrasse permitted Tiergarten Park to be continuously expanded all over the Spree valley. The enormous build mass shaped with gold roofs, presented a high level of public spaces that were able to convoke and bring up citizens for having a view of their entire inhabited landscape. The necessity of a human city after war Despite of their different approaches to the Berlin Hauptstadt solitudes, most of the presented proposals showed up a concerning about what was named: “Humanizierung der Stadt” (Humanization of the city), that was a exposed necessity in their submitted texts. But humanizing was a extremely difficult goal at that time in Berlin, a city immerse at the epicenter of the “Cold War” After so many decades isolated and frozen by the “Wall”, Berlin or better the Berliners have developed its own way for city planning. The restricted life they could overlay to the city voids, have leave specific footprints and shaped the ground showing up their own the daily uses of the city. After the “Wall fallen” the great efforts token to unify the divided city by both governments revealed another, thus softly, division. The one established between a real city sculpted by the citizens daily life and other one planned by the council occupying most of these charged voids with a new remake of the Wagner Plan (1925) or the reconstruction of the 19th century city. Even now having a walk by the city void grounds that once were planned in the Berlin Hauptstadt competition, is possible to see the great value they still have for preserving a sort of places with a closer scale, in such a great City. Sometimes, the footprints confirm some of the ideas that were appointed in the competitors proposals. The inner city proposed by Piccinato is present now in very different places like “PrizessinGarten” or “Pfefferberg” which with their own specific character made from their inside uses, influence the whole neighborhood where they are sited. The ground beside the Reichstag, contrary to the idea of an open-air parliament presented by the Smithson, is today marked with the footprints of the rows of the visitors who want to climb up the new dome and take a view. Meanwhile footprints in other places such as the Mauerpark at Prenzlauerberg show us a rich and with various uses place, where citizens find them selves. Also the landscape is present in some public spaces of the city freely occupied as observatories. The intense relation with the river proposed by Korn and Rosenberg can be lived in the bridge Admiralbrücke where the spring solstice is in alignment with the Landwehrkanal and so people meet this day to presence the sunset. Footprints on both sides of the canal bring the observers to the meeting point. One of the few elevations existing in the city grounds, hosts footprints from the Grossbeerenstrasse and Tempelhofstrasse avenues that are self concentrated in the National Monument projected by Schinkel in 1822, in memoriam of the Independence war fallen. The observatory an octagonal base which crowns the ViktoriaPark, give to citizens a place to sit down all over the hill skirts and watch the city landscape and its skylines. This kind of city recognition was also the basis of the landscape proposed by Hans Scharoun for the competition.

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