Conservación de plantas regeneradas in vitro y análisis de la variación somaclonal de Cinchona officinalis, Linneo

Cinchona officinalis (Rubiaceae), especie endémica del Valle de Loja, ubicado en la región sur del Ecuador, es un recurso forestal de importancia medicinal y ecológica, además la especie ha sido catalogada como planta nacional y es un ícono de la región sur por su aporte a la farmacopea mundial. Esta especie, entre los siglos XVII-XIX sufrió una gran presión en sus poblaciones debido a la extracción masiva de la corteza para la cura del paludismo. Aunque la actividad extractiva generó grandes ingresos a la Corona Española y a la región Sur del Ecuador, ésta fue poco o nada sustentable ecológicamente, provocando la desaparición de la especie en muchos sitios de la provincia, pues, en su momento, no se consideraron alternativas de recuperación de las poblaciones naturales. Actualmente la extracción y consumo de la corteza en la zona de origen es baja o nula, sin embargo esta zona enfrenta nuevas amenazas. La deforestación a causa de proyectos de desarrollo en infraestructuras, la práctica de actividades agrícolas y de ganadería, y los efectos del cambio climático han ocasionado, en estos últimos años, la fragmentación de los ecosistemas. La mayoría de los bosques del sur del Ecuador se han convertido en parches aislados (los bosques en los que se distribuye C. officinalis no son la excepción) siendo esta la principal causa para que la especie se encuentre en estado de amenaza. Los individuos de la especie tienen una alta capacidad de rebrote y producen semillas durante todo el año; sin embargo la capacidad germinativa y la tasa de sobrevivencia son bajas, además de estas dificultades la especie requiere de la asociación con otras especies vegetales para su desarrollo, lo cual ha limitado su distribución en pequeños parches aislados. Con esta problemática, la recuperación natural de las poblaciones es una necesidad evidente. Varios trabajos y esfuerzos previos se han realizado a nivel local: i. Identificación de la distribución actual y potencial; ii. Determinación de la fenología y fructificación iii. Programas de educación ambiental, iv. Análisis moleculares para determinar la diversidad genética. v. Ensayos de propagación vegetativa; y otras acciones de tipo cultural. No obstante, el estado de conservación y manejo de las poblaciones naturales no ha mejorado significativamente, siendo necesaria la aplicación de estrategias integradas de conservación in situ y ex situ, que permitan la recuperación y permanencia de las poblaciones naturales a largo plazo. El presente trabajo tiene como fin dar alternativas para el cultivo de tejidos in vitro de Cinchona officinalis centrados en la propagación masiva a partir de semillas, análisis de la fidelidad genética y alternativas de conservación de tejidos. Los objetivos específicos que se plantean son: i. Analizar el proceso de germinación y proliferación in vitro. ii. Evaluar la estabilidad genética en explantes cultivados in vitro, mediante marcadores ISSR. iii. Establecer protocolos de conservación in vitro mediante limitación del crecimiento y criopreservación de segmentos nodales y yemas. Los resultados más significativos de esta investigación fueron: i. El desarrollo de protocolos eficientes para mejorar los porcentajes de germinación y la proliferación de brotes en explantos cultivados in vitro. Para evaluar el efecto de los fenoles sobre la germinación, se determinó el contenido total de fenoles y el porcentaje de germinación en semillas de C. officinalis comparados con una especie de control, C. pubescens. Para inducir a proliferación, se utilizaron segmentos nodales de plántulas germinadas in vitro en medio Gamborg (1968) suplementado con diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas). Los resultados obtenidos sugieren que el contenido de compuestos fenólicos es alto en las semillas de C. officinalis en comparación con las semillas de C. pubescens. Estos fenoles pueden eliminarse con peróxido de hidrógeno o con lavados de agua para estimular la germinación. La formación de nuevos brotes y callos en la mayoría de las combinaciones de reguladores de crecimiento se observó en un período de 45 días. El mayor porcentaje de proliferación de brotes, formación de callos y presencia de brotes adventicios se obtuvo en medio Gamborg (B5) suplementado con 5.0 mg/l 6-bencil-aminopurina y 3.0 mg/l de ácido indol-3-butírico. ii. La evaluación de la fidelidad genética de los explantes obtenidos con distintas combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal y diversos subcultivos. Se realizó el seguimiento a los explantes obtenidos de la fase anterior, determinando el índice de multiplicación y analizando la fidelidad genética de los tejidos obtenidos por las dos vías regenerativas: brotación directa y regeneración de brotes a partir de callos. Este análisis se realizó por amplificación mediante PCR de las secuencias ubicadas entre microsatélites-ISSR (Inter simple sequence repeat). El medio Gamborg (B5) con 3.0 mg/l de AIB y 5.0 mg/l de BAP usado como medio de inducción en la primera etapa de cultivo generó el mayor índice de proliferación (11.5). Un total de 13 marcadores ISSR fueron analizados, 6 de éstos fueron polimórficos. El mayor porcentaje de variación somaclonal fue inducido en presencia de 1.0 mg/l 2,4-D combinado con 0.2 mg/l Kin con un 1.8% en el segundo sub-cultivo de regeneración, la cual incrementó a 3.6% en el tercer sub-cultivo. Todas las combinaciones con presencia de 2,4-D produjeron la formación de callos y presentaron variación genética. Por su parte la fidelidad genética se mantuvo en los sistemas de propagación directa a través de la formación de brotes a partir de meristemos preformados. iii. El establecimiento de protocolos de conservación in vitro y crioconservación de segmentos nodales y yemas. Para la conservación limitando el crecimiento, se cultivaron segmentos nodales en los medios MS y B5 en tres concentraciones de sus componentes (25, 50 y 100%); y en medio B5 más agentes osmóticos como el manitol, sorbitol y sacarosa en diferentes concentraciones (2, 4 y 8%); los cultivos se mantuvieron por 12 meses sin subcultivos. Para el establecimiento de protocolos para la crioconservación (paralización del metabolismo) se usaron yemas axilares y apicales a las cuales se les aplicaron los métodos de encapsulación-deshidratación y vitrificación. La efectividad de los protocolos usados se determinó en función de la sobrevivencia, reducción del crecimiento y regeneración. Los resultados obtenidos en este apartado reflejan que un crecimiento limitado puede mantener tejidos durante 12 meses de almacenamiento, usando medio B5 más manitol entre 2 y 8%. En los protocolos de crioconservación, se obtuvo el mayor porcentaje de recuperación tras la congelación en NL en el tratamiento control seguido por el método crioprotector de encapsulación-deshidratación. Este trabajo brinda alternativas para la propagación de C. officinalis bajo condiciones in vitro, partiendo de material vegetal con alta diversidad genética. El material propagado puede ser fuente de germoplasma para la recuperación y reforzamiento de las poblaciones naturales as�� como una alternativa de producción para las comunidades locales debido a la demanda actual de corteza de la zona de origen para la elaboración de agua tónica. ABSTRACT Cinchona officinalis (Rubiaceae) is endemic to the Loja Valley, located in the southern area of Ecuador. The importance of this plant as medical and ecological resource is so great that it has been designated as the national flower and is an icon of the southern region for its contribution to the world pharmacopoeia. Between XVII-XIX centuries its population suffered great reduction due to massive harvesting of the bark to cure malaria. Although extraction activity generated large revenues to the Spanish Crown and the southern region of Ecuador, this was not ecologically sustainable, causing the disappearance of the species in many areas of the province, because during that time alternatives to prevent extinction and recover natural populations were not taken in account. Currently the extraction and consumption of bark in the area of origin is almost absent, but this species faces new threats. Deforestation due to infrastructure development, the practice of farming and ranching, and the effects of climate change had led to the fragmentation of ecosystems during the recent years. Most of the forests of southern Ecuador have become isolated patches, including those where C. officinalis is diffused. The lack of suitable habitat is today the main threat for the species. The species has a high capacity for regeneration and produces seeds throughout the year, but the germination rate is low and the growth is slow. In addition, the species requires the association with other plant species to develop. All these factors had limited its distribution to small isolated patches. The natural recovery of populations is essential to face this problem. Several studies and previous efforts had been made at local level: i. Identification of current and potential distribution; ii. Phenology determination. iii. Environmental education programs, iv. Molecular analisis to determine the genetic diversity. v. Testing of vegetative propagation; and other actions of cultural nature. Despite these efforts, the state of conservation and management of natural populations has not improved significantly. Implementation of integrated in situ and ex situ conservation strategies for the recovery and permanence of long-term natural populations is still needed. This work aims to provide alternatives for in vitro culture of tissue of Cinchona officinalis focused on mass propagation from seeds, genetic fidelity analysis and tissue conservation alternatives. The specific aims are: i. Analyze the process of germination and proliferation in vitro. ii. To evaluate the genetic stability of the explants cultured in vitro by ISSR markers. iii. Establish protocols for in vitro conservation by limiting growth and cryopreservation of nodal segments and buds. The most significant results of this research were: i. The development of efficient protocols to improve germination rates and proliferation of buds in explants cultured in vitro. To study the effect of phenols on germination, the total phenolic content and percentage germination was measured in C. officinalis and in a control species, C. pubescens, for comparison. The content of phenolic compounds in C. officinalis seeds is higher than in C. pubescens. These phenols can be removed with hydrogen peroxide or water washes to stimulate germination. To analyze the regeneration, we used nodal explants from seedlings germinated in vitro on Gamborg medium (1968) supplemented with different combinations of growth regulators (auxins and cytokinins) to induce proliferation. The formation of new shoots and calluses was observed within a period of 45 days in most combinations of growth regulators. The highest percentage of shoot proliferation, callus formation and adventitious buds were obtained in B5 medium supplemented with 5.0 mg/l 6-benzyl-aminopurine and 3.0 mg/l indole-3-butyric acid. ii. Evaluating genetic fidelity explants obtained with various combinations of plant growth regulators and different subcultures. The genetic fidelity was analyzed in tissues obtained by the two regenerative pathways: direct sprouting and shoot regeneration from callus. This analysis was performed by PCR amplification of the sequences located between microsatellite-ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Among a total of 13 ISSR markers analyzed, 6 were polymorphic. The highest percentage of somaclonal variation was induced in the presence of 1.0 mg/l 2,4-D combined with 0.2 mg/l Kin with 1.8% in the second round of regeneration, and increased to 3.6% in the third round. The presence of 2,4-D induced genetic variation in all the combinations of growth regulators. Meanwhile genetic fidelity remained systems propagation through direct shoot formation from meristems preformed. iii. Establishing conservation protocols in vitro and cryoconservation of nodal segments and buds. For medium-term conservation (limited growth) nodal segments were cultured in MS and B5 media at three concentrations (25, 50 and 100%); we tested B5 medium with different concentrations of osmotic agents such as mannitol, sorbitol and sucrose (2, 4 and 8%); cultures were maintained for 12 months with regular subculturing. To establish protocols for cryoconservation (cessation of metabolism) different methods of encapsulation-dehydration and vitrification were applied to axillary and apical buds. The effectiveness of the used protocols is determined based on the survival, growth and regeneration success. The results show that these tissues can be maintained in storage for 12 months, using B5 medium plus mannitol between 2 and 8%. The cryoconservation protocol with highest percentage of recovery was obtained by contral treatment, followed by freezing in NL with encapsulation-dehydration method. This work provides alternatives for the propagation in vitro of C. officinalis, starting from plant material with high genetic diversity. The obtained material represents a source of germplasm to support the recovery and strengthening of natural populations as well as a creation of alternative sources for local communities due to the current demand of bark for the preparation of tonic water.

Repertorios bibliográficos (XVII) Ensayo de una bibliográfia comentada de manuales de artes, ciencias, oficios, costumbres públicas y privadas de España (Siglos XVI al XIX)

Estudio del “Ensayo de una bibliografía comentada de manuales …” realizado por Vicente Castañeda y publicado en el año 1955 por la Real Academia de la Historia. El ensayo recoge las obras que coleccionaba el autor de libros de divulgación, tratados y manuales de todo tipo sobre conocimientos populares en materia científica, artística, costumbres, diversiones y oficios manuales que se publicaban en 8º principalmente.

La bóveda tabicada en España en el siglo XIX: la transformación de un sistema constructivo

Las bóvedas tabicadas experimentan una importante evolución, casi una transformación, en España a lo largo del s. XIX. Al inicio, son un sistema constructivo tradicional y codificado durante al menos 3 siglos, con usos, formas y tamaños limitados. 100 años después se emplean de manera generalizada en nuevos tipos edificatorios, con soluciones constructivas novedosas, tamaños mucho mayores y una gran libertad formal. Esta tesis doctoral indaga en el porqué de esta transformación, desde el punto de vista de la técnica, as�� como en sus consecuencias, que llegan hasta la actualidad. El texto agrupa en tres partes: La primera, a la que he llamado «La construcción tabicada tradicional» sirve de punto de partida. En ella se ponen en contexto las bóvedas tabicadas antes del s. XIX, como aparecen en España y cual es su desarrollo y distribución territorial hasta finalizar el s. XVIII. En esta parte se ha estudiado: -la aparición de las bóvedas tabicadas en España, en los últimos años del s. XIV, y como se convierten en un sistema constructivo cada vez más frecuente y consolidado, empezando por el territorio de la Corona de Aragón (actuales Valencia, Cataluña y Aragón) y extendiéndose desde ahí a Castilla y Andalucía. -la difusión del sistema tabicado en los tratados de arquitectura españoles de los siglos XVII y XVIII: Fray Lorenzo de San Nicolás, Tosca, Briguz y Brú, García Berruguilla, Plo y Camín; también a través de documentos más prácticos: contratos de obra y pleitos. -la expansión de la construcción tabicada por Francia desde España. Como allí es aceptada por académicos y tratadistas; como vuelve a España influenciada por esos tratadistas, los más importantes de la época. Y como los tratadistas españoles reproducen las ideas francesas sobre la construcción tabicada en sus escritos. Este aspecto es importante ya que, a pesar de que la construcción tabicada tenía una tradición mucho mayor aquí, las ideas francesas sobre su comportamiento se imponen a las españolas incluso en España y esto influye en su desarrollo posterior. La segunda parte indaga en los aspectos constructivos del desarrollo de las bóvedas tabicadas a lo largo del siglo XIX. Dentro de ella se describe: -como se mantiene la construcción tabicada tradicional a lo largo del siglo XIX, conviviendo con una línea que avanza en la búsqueda de una nueva forma de construir, separándose cada vez más de la inicial. Para mostrar esta pervivencia, se estudian en esta parte tres documentos que se mueven en la línea tradicional, uno de principio de siglo, otro de los años centrales y otro de final del XIX. -la aparición de dos nuevos materiales: el cemento y el hierro, que en pocos años pasan de tener un uso accesorio en la construcción a fabricarse y utilizarse masivamente. La unión de estos dos materiales con los tradicionales en la construcción de bóvedas tabicadas, yeso y ladrillo, será decisiva en su evolución. -la creación de dos tipos arquitectónicos nuevos: los edificios industriales y la vivienda masiva. En ambos tipos tiene aplicación la construcción tabicada. Además, estos nuevos tipos son muy importantes en su evolución, ya que sus condicionantes específicos: rapidez de ejecución en ambos casos y búsqueda de luces cada vez mayores y de estructuras incombustibles en el segundo fuerzan al uso de los nuevos materiales disponibles (cemento, hierro) y al proyecto de nuevas formas y soluciones. En este aspecto me he centrado en Cataluña, la primera región industrializada de España y en la que se aplica la bóveda tabicada a los nuevos tipos, especialmente a la arquitectura industrial. Y la tercera parte estudia los aspectos estructurales del desarrollo de las bóvedas tabicadas a lo largo del siglo XIX. Se estudia aquí: -la aplicación a las estructuras tabicadas de las teorías de arcos y bóvedas que se desarrollan desde el siglo XVIII. Las bóvedas tabicadas, cuyas dimensiones se obtenian mediante reglas de proporción, se calculan sucesivamente mediante lineas de empuje, análisis de membrana y también se les intenta aplicar la teoría elástica, sin llegar a conseguir resultados válidos. Siguiendo el marco teórico del moderno análisis límite de fábrica, se concluye que es el más adecuado para estudiar estas bóvedas, como cualquier otras construidas con fábrica. -un estudio exhaustivo de los ensayos de resistencia que se realizan sobre estructuras tabicadas a lo largo de los siglos XIX y la primera mitad del XX. La razón de estos ensayos es la nueva necesidad, aparecida con la mentalidad científica, de ofrecer garantías técnicas y numéricas sobre los sistemas constructivos y estructurales. La tesis concluye que las bóvedas tabicadas aparecen en España en el siglo XIV en la zona de Levante; que se extienden por casi todo el territorio siendo un sistema codificado en los últimos años del siglo XVI y que empiezan a ser recogidas en los tratados ya en el siglo XVII; hasta la mitad del siglo XIX la forma en que se construyen y los edificios para los que se utiliza permanecen invariables, sin más novedad que la exportación del sistema constructivo a Francia y la reintroducción en España a través de los influyentes tratados franceses. En el siglo XIX confluyen varios motivos por los que las bóvedas tabicadas se transforman: la generalización del uso del hierro y el cemento; la construcción de grandes edificios industriales y la aparición de la mentalidad científica, con el desarrollo de la teoría de estructuras. Los nuevos edificios industriales requieren grandes luces y nuevas formas; los nuevos materiales (especialmente el hierro) permiten estos avances. La teoría de estructuras se aplicará a estas nuevas bóvedas; en conjunto con los datos recogidos en los ensayos realizados dará seguridad a arquitectos y constructores para construir mayores tamaños y formas novedosas. A pesar de esta transformación, la mejor manera de enfrentarse al cálculo de una bóveda tabicada, bien sea para diseñarla en un edificio nuevo como para comprobar su validez en uno ya construido, es englobarla, como cualquier otra fábrica, dentro del análisis límite. Es el método más seguro y a la vez, el más sencillo de todos los disponibles actualmente.