Functional characterization of YODA, a mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) that regulates a novel innate immunity pathway in Arabidopsis thaliana

Las cascadas de señalización mediadas por proteína quinasas activadas por mitógeno (MAP quinasas) son capaces de integrar y transducir señales ambientales en respuestas celulares. Entre estas señales se encuentran los PAMPs/MAMPs (Pathogen/Microbe-Associated Molecular Patterns), que son moléculas de patógenos o microorganismos, o los DAMPs (Damaged-Associated Molecular Patterns), que son moléculas derivadas de las plantas producidas en respuesta a daño celular. Tras el reconocimiento de los PAMPs/DAMPs por receptores de membrana denominados PRRs (Pattern Recognition Receptors), como los receptores con dominio quinasa (RLKs) o los receptores sin dominio quinasa (RLPs), se activan respuestas moleculares, incluidas cascadas de MAP quinasas, que regulan la puesta en marcha de la inmunidad activada por PAMPs (PTI). Esta Tesis describe la caracterización funcional de la MAP quinasa quinasa quinasa (MAP3K) YODA (YDA), que actúa como un regulador clave de la PTI en Arabidopsis. Se ha descrito previamente que YDA controla varios procesos de desarrollo, como la regulación del patrón estomático, la elongación del zigoto y la arquitectura floral. Hemos caracterizado un alelo mutante hipomórfico de YDA (elk2 o yda11) que presenta una elevada susceptibilidad a patógenos biótrofos y necrótrofos. Notablemente, plantas que expresan una forma constitutivamente activa de YDA (CA-YDA), con una deleción en el dominio N-terminal, presentan una resistencia de amplio espectro frente a diferentes tipos de patógenos, incluyendo hongos, oomicetos y bacterias, lo que indica que YDA juega un papel importante en la regulación de la resistencia de las plantas a patógenos. Nuestros datos indican que esta función es independiente de las respuestas inmunes mediadas por los receptores previamente caracterizados FLS2 y CERK1, que reconocen los PAMPs flg22 y quitina, respectivamente, y que están implicados en la resistencia de Arabidopsis frente a bacterias y hongos. Hemos demostrado que YDA controla la resistencia frente al hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina y el patrón estomático mediante su interacción genética con la RLK ERECTA (ER), un PRR implicado en la regulación de estos procesos. Por el contrario, la interacción genética entre ER y YDA en la regulación de otros procesos de desarrollo es aditiva en lugar de epistática. Análisis genéticos indicaron que MPK3, una MAP quinasa que funciona aguas abajo de YDA en el desarrollo estomático, es un componente de la ruta de señalización mediada por YDA para la resistencia frente a P. cucumerina, lo que sugiere que el desarrollo de las plantas y la PTI comparten el módulo de transducción de MAP quinasas asociado a YDA. Nuestros experimentos han revelado que la resistencia mediada por YDA es independiente de las rutas de señalización reguladas por las hormonas de defensa ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido abscísico o etileno, y también es independiente de la ruta de metabolitos secundarios derivados del triptófano, que están implicados en inmunidad vegetal. Además, hemos demostrado que respuestas asociadas a PTI, como el aumento en la concentración de calcio citoplásmico, la producción de especies reactivas de oxígeno, la fosforilación de MAP quinasas y la expresión de genes de defensa, no están afectadas en el mutante yda11. La expresión constitutiva de la proteína CA-YDA en plantas de Arabidopsis no provoca un aumento de las respuestas PTI, lo que sugiere la existencia de mecanismos de resistencia adicionales regulados por YDA que son diferentes de los regulados por FLS2 y CERK1. En línea con estos resultados, nuestros datos transcriptómicos revelan una sobre-representación en plantas CA-YDA de genes de defensa que codifican, por ejemplo, péptidos antimicrobianos o reguladores de muerte celular, o proteínas implicadas en la biogénesis de la pared celular, lo que sugiere una conexión potencial entre la composición e integridad de la pared celular y la resistencia de amplio espectro mediada por YDA. Además, análisis de fosfoproteómica indican la fosforilación diferencial de proteínas relacionadas con la pared celular en plantas CA-YDA en comparación con plantas silvestres. El posible papel de la ruta ER-YDA en la regulación de la integridad de la pared celular está apoyado por análisis bioquímicos y glicómicos de las paredes celulares de plantas er, yda11 y CA-YDA, que revelaron cambios significativos en la composición de la pared celular de estos genotipos en comparación con la de plantas silvestres. En resumen, nuestros datos indican que ER y YDA forman parte de una nueva ruta de inmunidad que regula la integridad de la pared celular y respuestas defensivas, confiriendo una resistencia de amplio espectro frente a patógenos. ABSTRACT Plant mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades transduce environmental signals and developmental cues into cellular responses. Among these signals are the pathogen- or microbe-associated molecular patterns (PAMPs or MAMPs) and the damage-associated molecular patterns (DAMPs). These PAMPs/DAMPs, upon recognition by plant pattern recognition receptors (PRRs), such as Receptor-Like Kinases (RLKs) and Receptor-Like Proteins (RLPs), activate molecular responses, including MAPK cascades, which regulate the onset of PAMP-triggered immunity (PTI). This Thesis describes the functional characterization of the MAPK kinase kinase (MAP3K) YODA (YDA) as a key regulator of Arabidopsis PTI. YDA has been previously described to control several developmental processes, such as stomatal patterning, zygote elongation and inflorescence architecture. We characterized a hypomorphic, non-embryo lethal mutant allele of YDA (elk2 or yda11) that was found to be highly susceptible to biotrophic and necrotrophic pathogens. Remarkably, plants expressing a constitutive active form of YDA (CA-YDA), with a deletion in the N-terminal domain, showed broad-spectrum resistance to different types of pathogens, including fungi, oomycetes and bacteria, indicating that YDA plays a relevant function in plant resistance to pathogens. Our data indicated that this function is independent of the immune responses regulated by the well characterized FLS2 and CERK1 RLKs, which are the PRRs recognizing flg22 and chitin PAMPs, respectively, and are required for Arabidopsis resistance to bacteria and fungi. We demonstrate that YDA controls resistance to the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina and stomatal patterning by genetically interacting with ERECTA (ER) RLK, a PRR involved in regulating these processes. In contrast, the genetic interaction between ER and YDA in the regulation of other ER-associated developmental processes was additive, rather than epistatic. Genetic analyses indicated that MPK3, a MAP kinase that functions downstream of YDA in stomatal development, also regulates plant resistance to P. cucumerina in a YDA-dependent manner, suggesting that the YDA-associated MAPK transduction module is shared in plant development and PTI. Our experiments revealed that YDA-mediated resistance was independent of signalling pathways regulated by defensive hormones like salicylic acid, jasmonic acid, abscisic acid or ethylene, and of the tryptophan-derived metabolites pathway, which are involved in plant immunity. In addition, we showed that PAMP-mediated PTI responses, such as the increase of cytoplasmic Ca2+ concentration, reactive oxygen species (ROS) burst, MAPK phosphorylation, and expression of defense-related genes are not impaired in the yda11 mutant. Furthermore, the expression of CA-YDA protein does not result in enhanced PTI responses, further suggesting the existence of additional mechanisms of resistance regulated by YDA that differ from those regulated by the PTI receptors FLS2 and CERK1. In line with these observations, our transcriptomic data revealed the over-representation in CA-YDA plants of defensive genes, such as those encoding antimicrobial peptides and cell death regulators, and genes encoding cell wall-related proteins, suggesting a potential link between plant cell wall composition and integrity and broad spectrum resistance mediated by YDA. In addition, phosphoproteomic data revealed an over-representation of genes encoding wall-related proteins in CA-YDA plants in comparison with wild-type plants. The putative role of the ER-YDA pathway in regulating cell wall integrity was further supported by biochemical and glycomics analyses of er, yda11 and CA-YDA cell walls, which revealed significant changes in the cell wall composition of these genotypes compared with that of wild-type plants. In summary, our data indicate that ER and YDA are components of a novel immune pathway that regulates cell wall integrity and defensive responses, which confer broad-spectrum resistance to pathogens.

Efecto del nivel de la proteína bruta del pienso y del peso inicial de las pollitas sobre los parámetros productivos y la calidad del huevo en gallinas ponedoras rubias

Las aves, al igual que el resto de animales monogástricos no precisan de un nivel de proteína bruta (PB) en el pienso sino de niveles adecuados de aminoácidos (AA) indispensables (Keshavarz and Austic, 2004; Junqueira et al., 2006; Novak et al., 2006). Sin embargo, en la práctica es frecuente que los nutricionistas soliciten niveles de PB en exceso de lo recomendado por el NRC (1999) o FEDNA (2008). De hecho, muchos nutricionistas formulan piensos para inicio de puesta en gallinas rubias con más de 18.5% PB, cuando niveles de 16.5% PB podrían ser adecuados. La razón de utilizar niveles altos de PB es desconocido pero podría estar relacionado con el mayor margen de seguridad lo que evitaría que un aminoácido (AA) indispensable no contemplado afecte al tamaño del huevo y a la productividad. Por contra, un nivel alto de PB aumenta el precio del pienso cuando el coste de las fuentes proteicas es elevado. La inclusión de grasa en el pienso mejora el tamaño del mismo y puede mejorar el peso vivo de las aves (FEDNA, 2008). Un problema de la industria productora de huevos es el relacionado con el peso inicial de las pollitas y su influencia sobre las diversas variables productivas. El PV de las aves podría verse afectado por las características del pienso. El objetivo de este ensayo fue estudiar la influencia del nivel proteico de piensos isonutritivos en relación con la EMAn y los aminoácidos indispensables, sobre la productividad en gallinas rubias.

Identificación y caracterización de la ruta mediada por la proteína G heterotrimérica de Arabidopsis thaliana en la respuesta inmune

La resistencia de las plantas a los hongos necrótrofos como Plectosphaerella cucumerina es genéticamente compleja y depende de la activación coordinada de distintas rutas de señalización (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Entre éstas se encuentran las mediadas por la proteína G heterotrimérica, un complejo formado por tres subunidades (Gα, Gβ y Gγ) que regula tanto la respuesta de inmunidad a diferentes patógenos como distintos procesos de desarrollo (Temple and Jones, 2007). En esta Tesis hemos demostrado que, en Arabidopsis, el monómero funcional formado por las subunidades Gβ y Gγ1/Gγ2 es el responsable de la regulación de la respuesta de defensa, ya que mutantes nulos en estas subunidades (agb1 y agg1 agg2) presentan una alta susceptibilidad al hongo P. cucumerina. Además, hemos identificado varios aminoácidos (Q102, T188 y R235) de la proteína AGB1 esenciales en la interacción con los efectores correspondientes para la regulación de la respuesta inmune (Jiang et al, enviado). Para determinar las bases moleculares de la resistencia mediada por la proteína G heterotrimérica, llevamos a cabo un análisis transcriptómico comparativo entre los genotipos agb1 y Col-0, el cual reveló que la resistencia mediada por AGB1 no depende de rutas defensivas implicadas en la resistencia a hongos necrotrofos, como las mediadas por el ácido salicílico (SA), etileno (ET), jasmónico (JA) o ácido abscísico (ABA), o la ruta de biosíntesis de metabolitos derivados del triptófano. Este estudio mostró que un número significativo de los genes desregulados en respuesta a P. cucumerina en el genotipo agb1 respecto a las plantas silvestres codificaban proteínas con funciones relacionadas con la pared celular. La evaluación de la composición y estructura de la pared de los mutantes de las subunidades de la proteína G heterotrimérica reveló que los genotipos agb1 y agg1 agg2 presentaban alteraciones similares diferentes de las observadas en plantas silvestres Col-0, como una reducción significativa en el contenido de xilosa en la pared. Estos datos sugieren que la proteína G heterotrimérica puede modular la composición/estructura de la pared celular y contribuir, de esta manera, en la regulación de la respuesta inmune (Delgado- Cerezo et al, 2011). La caracterización del interactoma de la proteína G heterotrimérica corroboró la relevancia funcional que presenta en la regulación de la pared celular, ya que un número significativo de las interacciones identificadas estaban comprendidas por proteínas relacionadas directa o indirectamente con la biogénesis y remodelación de la pared celular (Klopffleisch et al, 2011). El papel en inmunidad de algunos de estos potenciales efectores ha sido validado mediante el análisis de la resistencia a P. cucumerina de los mutantes de pérdida de función correspondientes. Con el objetivo de caracterizar las rutas de señalización mediadas por AGB1 e identificar efectores implicados en esta señalización, llevamos a cabo una búsqueda de mutantes supresores de la susceptibilidad de agb1 a P. cucumerina, identificándose varios mutantes sgb (supressor of Gbeta). En esta Tesis hemos caracterizado en detalle el mutante sgb10, que presenta una activación constitutiva de las rutas de señalización mediadas por SA y JA+ET y suprime el fenotipo de susceptibilidad de agb1. SGB10 y AGB1 forman parte de rutas independientes en la regulación de la respuesta inmune, mientras que interaccionan de forma compleja en el control de determinados procesos de desarrollo. La mutación sgb10 ha sido cartografiada entre los genes At3g55010 y At3g56408, que incluye una región con 160 genes. ABSTRACT Plant resistance to necrotrophic fungi Plectosphaerella cucumerina is genetically complex and depends on the interplay of different signalling pathways (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Among others, the heterotrimeric G protein complex has a relevant role. The G protein that is formed by three subunits (Gα, Gβ and Gγ) is a pleiotropic regulator of immune responses to different types of pathogens and developmental issues (Temple and Jones, 2007). Throughout the Thesis, we have demonstrated that Arabidopsis’ functional monomer formed by the Gβ and Gγ1/Gγ2 subunits is a key regulator of defense response, as null mutants (agb1 and agg1 agg2) are equally hypersusceptible to P. cucumerina infection. In addition we have identified several AGB1 aminoacids (Q102, T188 y R235) essentials to interact with specific effectors during the regulation of immune response (Jiang et al, sent).To determine the molecular basis of heterotrimeric G protein mediated resistance we have performed a microarray analysis with agb1-1 and wild type Col-0 plants before and after P. cucumerina challenge. A deep and exhaustive comparative transcriptomical analysis of these plants revealed that AGB1 mediated resistance does not rely on salicilic acid (SA), ethylene (ET), jasmonates (JA), abscisic acid (ABA) or triptophan derived metabolites biosynthesis. However the analysis revealed that a significant number of cell wall related genes are misregulated in the agb1 mutant after pathogen challenge when compared to wild-type plants. The analysis of cell wall composition and structure showed similar cell wall alterations between agb1 and agg1 agg2 mutants that are different from those of wild-type plants, so far the mutants present a significant reduction in xylose levels. All these results suggest that heterotrimeric G protein may regulate immune response through modifications in the cell wall composition/structure (Delgado-Cerezo et al, 2011). The characterization of Heterotrimeric G protein interactome revealed highly connected interactions between the G-protein core and proteins involved in cell wall composition or structure (Klopffleisch et al, 2011). To test the role in immunity of several effectors identified above, we have performed resistance analysis of corresponding null mutants against P. cucumerina. In order to characterize AGB1 mediated signalling pathway and identify additional effectors involved in AGB1-mediated immune response against P. cucumerina, we have performed a screening to isolate mutants with suppression of agb1 phenotype. One of the mutants, named sgb10, has been characterized during the Thesis. The mutant shows constitutive expression of SA, JA+ET-mediated defense signaling pathways to suppres agb1 hypersusceptibility. SGB10 and AGB1 proteins seem to be part of independent pathways in immunity, however its function during development remains unclear. At present, we have mapped the sgb10 mutation between At3g55010 and At3g56408 genes. This region contains 160 genes.

Inducción de la muda de gallinas ponedoras mediante el uso de alimentos bajos en energía y proteína: efectos en la producción y en la calidad del huevo postmuda

La inducción de la muda en gallinas ponedoras mediante la supresión total del alimento sólido está prohibida en la UE por perjudicar el bienestar de la gallina y su sistema inmunitario. Por ello, es necesario estudiar alternativas (sin ayuno) que logren una adecuada pérdida de peso vivo para que la puesta cese rápidamente, su tract o reproductor se “rejuvenezca”, y la producción de huevos se reanude rápida y satisfactoriamente, con una mínima mortalidad. El objetivo del trabajo fue determinar la eficacia con que tres alimentos (salvado de trigo, cebada y un pienso comercial suministrado en cantidad restringida) podían inducir la muda en ponedoras de dos estirpes genéticas, y analizar comparativamente los resultados cuantitativos y cualitativos obtenidos, tanto por estirpe como por tratamiento. La muda se indujo a 216 gallinas de una estirpe ligera y a 216 gallinas de estirpe semipesada. Las gallinas se alojaron en bloques de 3 jaulas con 4 aves por jaula, con 18 réplicas por estirpe y 12 réplicas por tratamiento. El salvado y la cebada causaron el cese de la puesta más rápidamente (dí as 7 y 9 desde el inicio de la muda; respectivamente) que el pienso restringido (día14) (P<0,001). La producción de huevos durante la muda fue mayor con pienso restringido ( P < 0,001) y también mayor en las semipesadas (28,1%) que en las ligeras ( 18,9%). Tras la muda, las gallinas ligeras tuvieron mayor producción (73,1%) que las semipesadas (70,8%) , aunque un peso medio del huevo inferior (69,8 vs 70,7 g). El salvado dio lugar a una mayor IP (74,6%) pero el peso del huevo fue inferior (69,7 g). Todos los parámetros cualitativos analizados presentaron diferencias significativas entre gallinas ligeras y semipesadas, de uno u otro signo. En cambio, el alimento utilizado para inducir la muda no influyó en la calidad del huevo tras la muda.

Diferencias en composición química y relaciones con la calidad de la proteína de las harinas de soja según origen.

La harina de soja (HS) es la principal fuente de proteína utilizada en la fabricación de piensos. En Europa, la mayor parte de las HS procede de uno de los tres principales países productores: Estados Unidos (USA), Brasil (BRA) y Argentina (ARG). La composición y valor nutricional de las HS varía entre países de origen en función de las variedades cultivadas, las condiciones agronómicas y las condiciones de procesado (Grieshop et al., 2003; De Coca et al., 2008, 2010; Frikha et al., 2012). En un trabajo anterior Mateos et al. (2011) presentaron los resultados obtenidos de una colección de 385 muestras de HS recogidas entre los años 2007 y 2010 procedentes de estos tres países. El presente trabajo tiene como objetivo complementar los resultados anteriores con nuevas muestras procedentes de las cosechas de los años 2011 y 2012. Asimismo se presentarán las correlaciones más destacadas entre componentes analíticos y las variables de calidad de la proteína habitualmente utilizadas por la industria.

Diferencias en composición química y relaciones con la calidad de la proteína de las harinas de soja según origen

La harina de soja (HS) es la principal fuente de proteína utilizada en la fabricación de piensos. En Europa, la mayor parte de las HS procede de uno de los tres principales países productores: Estados Unidos (USA), Brasil (BRA) y Argentina (ARG). La composición y valor nutricional de las HS varía entre países de origen en función de las variedades cultivadas, las condiciones agronómicas y las condiciones de procesado (Grieshop et al., 2003; De Coca et al., 2008, 2010; Frikha et al., 2012). En un trabajo anterior Mateos et al. (2011) presentaron los resultados obtenidos de una colección de 385 muestras de HS recogidas entre los años 2007 y 2010 procedentes de estos tres países. El presente trabajo tiene como objetivo complementar los resultados anteriores con nuevas muestras procedentes de las cosechas de los años 2011 y 2012. Asimismo se presentarán las correlaciones más destacadas entre componentes analíticos y las variables de calidad de la proteína habitualmente utilizadas por la industria.

Efecto de la sustitución de N no proteico por proteína de soja sobre la producción de metano in vitro

Incubations were carried out with batch cultures to study the effects of different nitrogen (N) sources on in vitro fermentation by ruminal micro-organisms of two substrates of variable fermentation rate. The substrates were composed by starch and cellulose in proportions of 75:25 (starch) or 25:75 (cellulose). Three treatments were made by replacing ammonia-N (NH4Cl) with purified soyabean protein (SP) at levels of 0 (NNP), 50% (S50) and 100% (S100) of total N. Compared with NNP, S50 and S100 treatments increased CH4 production by 51.0 and 50.6% for starch and by 7.7 and 29.7% for cellulose substrates, respectively. The increases in volatile fatty acids (VFA) production were 4.4 and 6.3% for starch and 33.1 and 58.9% for cellulose substrates, respectively. These results indicate that the influence of N source on CH4 and VFA production are influenced by the characteristics of the incubated substrate.