Mejora de la eficacia de Penicillium oxalicum como agente de biocontrol en enfermedades de plantas hortícolas

Actualmente, la reducción de materias activas (UE) y la implantación de la nueva Directiva comunitaria 2009/128/ que establece el marco de actuación para conseguir un uso sostenible de los plaguicidas químicos y la preferencia de uso de métodos biológicos, físicos y otros no químicos, obliga a buscar métodos de control menos perjudiciales para el medio ambiente. El control biológico (CB) de enfermedades vegetales empleando agentes de control biológico (ACB) se percibe como una alternativa más segura y con menor impacto ambiental, bien solos o bien como parte de una estrategia de control integrado. El aislado 212 de Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) fue aislado originalmente de la micoflora del suelo en España y ha demostrado ser un eficaz ACB frente a la marchitez vascular del tomate. Una vez identificado y caracterizado el ACB se inició el periodo de desarrollo del mismo poniendo a punto un método de producción en masa de sus conidias. Tras lo cual se inició el proceso de formulación del ACB deshidratando las conidias para su preservación durante un período de tiempo mayor mediante lecho fluido. Finalmente, se han desarrollado algunos formulados que contienen de forma individual diferentes aditivos que han alargado su viabilidad, estabilidad y facilitado su manejo y aplicación. Sin embargo, es necesario seguir trabajando en la mejora de su eficacia de biocontrol. El primer objetivo de esta Tesis se ha centrado en el estudio de la interacción ACB-patógeno-huésped que permita la actuación de P.oxalicum en diferentes patosistemas. Uno de los primeros puntos que se abordan dentro de este objetivo es el desarrollo de nuevas FORMULACIONES del ACB que incrementen su eficacia frente a la marchitez vascular del tomate. Las conidias formuladas de PO212 se obtuvieron por la adición conjunta de distintos aditivos (mojantes, adherentes o estabilizantes) en dos momentos diferentes del proceso de producción/secado: i) antes del proceso de producción (en la bolsa de fermentación) en el momento de la inoculación de las bolsas de fermentación con conidias de PO212 o ii) antes del secado en el momento de la resuspensión de las conidias tras su centrifugación. De las 22 nuevas formulaciones desarrolladas y evaluadas en plantas de tomate en ensayos en invernadero, seis de ellas (FOR22, FOR25, FOR32, FOR35, FOR36 y FOR37) mejoran significativamente (P=0,05) el control de la marchitez vascular del tomate con respecto al obtenido con las conidias secas de P.oxalicum sin aditivos (CSPO) o con el fungicida Bavistin. Los formulados que mejoran la eficacia de las conidias secas sin aditivos son aquellos que contienen como humectantes alginato sódico en fermentación, seguido de aquellos que contienen glicerol como estabilizante en fermentación, y metil celulosa y leche desnatada como adherentes antes del secado. Además, el control de la marchitez vascular del tomate por parte de los formulados de P. oxalicum está relacionado con la fecha de inicio de la enfermedad. Otra forma de continuar mejorando la eficacia de biocontrol es mejorar la materia activa mediante la SELECCIÓN DE NUEVAS CEPAS de P. oxalicum, las cuales podrían tener diferentes niveles de eficacia. De entre las 28 nuevas cepas de P. oxalicum ensayadas en cámara de cultivo, sólo el aislado PO15 muestra el mismo nivel de eficacia que PO212 (62-67% de control) frente a la marchitez vascular del tomate en casos de alta presión de enfermedad. Mientras que, en casos de baja presión de enfermedad todas las cepas de P. oxalicum y sus mezclas demuestran ser eficaces. Finalmente, se estudia ampliar el rango de actuación de este ACB a OTROS HUÉSPEDES Y OTROS PATÓGENOS Y DIFERENTES GRADOS DE VIRULENCIA. En ensayos de eficacia de P. oxalicum frente a aislados de diferente agresividad de Verticillium spp. y Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en plantas de tomate en cámaras de cultivo, se demuestra que la eficacia de PO212 está negativamente correlacionada con el nivel de enfermedad causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici pero que no hay ningún efecto diferencial en la reducción de la incidencia ni de la gravedad según la virulencia de los aislados. Sin embargo, en los ensayos realizados con V. dahliae, PO212 causa una mayor reducción de la enfermedad en las plantas inoculadas con aislados de virulencia media. La eficacia de PO212 también era mayor frente a aislados de virulencia media alta de F. oxysporum f. sp. melonis y F. oxysporum f. sp. niveum, en plantas de melón y sandía, respectivamente. En ambos huéspedes se demuestra que la dosis óptima de aplicación del ACB es de 107 conidias de PO212 g-1 de suelo de semillero, aplicada 7 días antes del trasplante. Además, entre 2 y 4 nuevas aplicaciones de PO212 a la raíces de las plantas mediante un riego al terreno de asiento mejoran la eficacia de biocontrol. La eficacia de PO212 no se limita a hongos patógenos vasculares como los citados anteriormente, sino también a otros patógenos como: Phytophthora cactorum, Globodera pallida y G. rostochiensis. PO212 reduce significativamente los síntomas (50%) causados por P. cactorum en plantas de vivero de fresa, tras la aplicación del ACB por inmersión de las raíces antes de su trasplante al suelo de viveros comerciales. Por otra parte, la exposición de los quistes de Globodera pallida y G. rostochiensis (nematodos del quiste de la patata) a las conidias de P. oxalicum, en ensayos in vitro o en microcosmos de suelo, reduce significativamente la capacidad de eclosión de los huevos. Para G. pallida esta reducción es mayor cuando se emplean exudados de raíz de patata del cv. 'Monalisa', que exudados de raíz del cv. 'Desirée'. No hay una reducción significativa en la tasa de eclosión con exudados de raíz de tomate del cv. 'San Pedro'. Para G. rostochiensis la reducción en la tasa de eclosión de los huevos se obtiene con exudados de la raíz de patata del cv. 'Desirée'. El tratamiento con P. oxalicum reduce también significativamente el número de quistes de G. pallida en macetas. Con el fin de optimizar la aplicación práctica de P. oxalicum cepa 212 como tratamiento biológico del suelo, es esencial entender cómo el entorno físico influye en la capacidad de colonización, crecimiento y supervivencia del mismo, así como el posible riesgo que puede suponer su aplicación sobre el resto de los microorganismos del ecosistema. Por ello en este segundo objetivo de esta tesis se estudia la interacción del ACB con el medio ambiente en el cual se aplica. Dentro de este objetivo se evalúa la INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA, DISPONIBILIDAD DE AGUA Y PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS SUELOS (POROSIDAD, TEXTURA, DENSIDAD...) SOBRE LA SUPERVIVENCIA Y EL CRECIMIENTO DE PO212 en condiciones controladas elaborando modelos que permitan predecir el impacto de cada factor ambiental en la supervivencia y crecimiento de P. oxalicum y conocer su capacidad para crecer y sobrevivir en diferentes ambientes. En las muestras de suelo se cuantifica: i) la supervivencia de Penicillium spp. usando el recuento del número de unidades formadoras de colonias en un medio de cultivo semi-selectivo y ii) el crecimiento (biomasa) de PO212 mediante PCR en tiempo real. En los resultados obtenidos se demuestra que P. oxalicum crece y sobrevive mejor en condiciones de sequía independientemente de la temperatura y del tipo de suelo. Si comparamos tipos de suelo P. oxalicum crece y sobrevive en mayor medida en suelos areno-arcillosos con un bajo contenido en materia orgánica, un mayor pH y una menor disponibilidad de fósforo y nitrógeno. La supervivencia y el crecimiento de P. oxalicum se correlaciona de forma negativa con la disponibilidad de agua y de forma positiva con el contenido de materia orgánica. Sólo la supervivencia se correlaciona también positivamente con el pH. Por otro lado se realizan ensayos en suelos de huertos comerciales con diferentes propiedades físico-químicas y diferentes condiciones ambientales para ESTUDIAR EL ESTABLECIMIENTO, SUPERVIVENCIA Y DISPERSIÓN VERTICAL Y MOVILIDAD HORIZONTAL DE PO212. P. oxalicum 212 puede persistir y sobrevivir en esos suelos al menos un año después de su liberación pero a niveles similares a los de otras especies de Penicillium indígenas presentes en los mismos suelos naturales. Además, P. oxalicum 212 muestra una dispersión vertical y movilidad horizontal muy limitada en los diferentes tipos de suelo evaluados. La introducción de P. oxalicum en un ambiente natural no sólo implica su actuación sobre el microorganismo diana, el patógeno, si no también sobre otros microorganismos indígenas. Para EVALUAR EL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE P. oxalicum SOBRE LAS POBLACIONES FÚNGICAS INDIGENAS PRESENTES EN EL SUELO de dos huertos comerciales, se analizan mediante electroforesis en gradiente desnaturalizante de poliacrilamida (DGGE) muestras de dichos suelos a dos profundidades (5 y 10 cm) y a cuatro fechas desde la aplicación de P. oxalicum 212 (0, 75, 180 y 365 días). El análisis de la DGGE muestra que las diferencias entre las poblaciones fúngicas se deben significativamente a la fecha de muestreo y son independientes del tratamiento aplicado y de la profundidad a la que se tomen las muestras. Luego, la aplicación del ACB no afecta a la población fúngica de los dos suelos analizados. El análisis de las secuencias de la DGGE confirma los resultados anteriores y permiten identificar la presencia del ACB en los suelos. La presencia de P. oxalicum en el suelo se encuentra especialmente relacionada con factores ambientales como la humedad. Por tanto, podemos concluir que Penicillium oxalicum cepa 212 puede considerarse un óptimo Agente de Control Biológico (ACB), puesto que es ecológicamente competitivo, eficaz para combatir un amplio espectro de enfermedades y no supone un riesgo para el resto de microorganismos fúngicos no diana presentes en el lugar de aplicación. ABSTRACT Currently, reduction of active (EU) and the implementation of the new EU Directive 2009/128 which establishing the framework for action to achieve the sustainable use of chemical pesticides and preference of use of biological, physical and other non-chemical methods, forces to look for control methods less harmful to the environment. Biological control (CB) of plant diseases using biological control agents (BCA) is perceived as a safer alternative and with less environmental impact, either alone or as part of an integrated control strategy. The isolate 212 of Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) was originally isolated from the soil mycoflora in Spain. P. oxalicum is a promising biological control agent for Fusarium wilt and other tomato diseases. Once identified and characterized the BCA, was developed a mass production method of conidia by solid-state fermentation. After determined the process of obtaining a formulated product of the BCA by drying of product by fluid-bed drying, it enables the preservation of the inoculum over a long period of time. Finally, some formulations of dried P. oxalicum conidia have been developed which contain one different additive that have improved their viability, stability and facilitated its handling and application. However, further work is needed to improve biocontrol efficacy. The first objective of this thesis has focused on the study of the interaction BCA- pathogen-host, to allow P.oxalicum to work in different pathosystems. The first point to be addressed in this objective is the development of new FORMULATIONS of BCA which increase their effectiveness against vascular wilt of tomato. PO212 conidial formulations were obtained by the joint addition of various additives (wetting agents, adhesives or stabilizers) at two different points of the production-drying process: i) to substrate in the fermentation bags before the production process, and (ii) to conidial paste obtained after production but before drying. Of the 22 new formulations developed and evaluated in tomato plants in greenhouse tests, six of them (FOR22 , FOR25 , FOR32 , FOR35 , FOR36 and FOR3) improved significantly (P = 0.05) the biocontrol efficacy against tomato wilt with respect to that obtained with dried P.oxalicum conidia without additives (CSPO) or the fungicide Bavistin. The formulations that improve the efficiency of dried conidia without additives are those containing as humectants sodium alginate in the fermentation bags, followed by those containing glycerol as a stabilizer in the fermentation bags, and methylcellulose and skimmed milk as adherents before drying. Moreover, control of vascular wilt of tomatoes by PO212 conidial formulations is related to the date of disease onset. Another way to further improve the effectiveness of biocontrol is to improve the active substance by SELECTION OF NEW STRAINS of P. oxalicum, which may have different levels of effectiveness. Of the 28 new strains of P. oxalicum tested in a culture chamber, only PO15 isolate shows the same effectiveness that PO212 (62-67 % of control) against tomato vascular wilt in cases of high disease pressure. Whereas in cases of low disease pressure all strains of P. oxalicum and its mixtures effective. Finally, we study extend the range of action of this BCA TO OTHER GUESTS AND OTHER PATHOGENS AND DIFFERENT DEGREES OF VIRULENCE. In efficacy trials of P. oxalicum against isolates of different aggressiveness of Verticillium spp. and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in tomato plants in growth chambers, shows that the efficiency of PO212 is negatively correlated with the level of disease caused by F. oxysporum f. sp. lycopersici. There is not differential effect in reducing the incidence or severity depending on the virulence of isolates. However, PO212 cause a greater reduction of disease in plants inoculated with virulent isolates media of V. dahlia. PO212 efficacy was also higher against isolates of high and average virulence of F. oxysporum f. sp. melonis and F. oxysporum f. sp. niveum in melon and watermelon plants, respectively. In both hosts the optimum dose of the BCA application is 107 conidia PO212 g-1 soil, applied on seedlings 7 days before transplantation into the field. Moreover, the reapplication of PO212 (2-4 times) to the roots by irrigation into the field improve efficiency of biocontrol. The efficacy of PO212 is not limited to vascular pathogens as those mentioned above, but also other pathogens such as Oomycetes (Phytophthora cactorum) and nematodes (Globodera pallida and G. rostochiensis). PO212 significantly reduces symptoms (50 %) caused by P. cactorum in strawberry nursery plants after application of BCA by dipping the roots before transplanting to soil in commercial nurseries. Moreover, the exposure of G. pallida and G. rostochiensis cysts to the conidia of P. oxalicum, in in vitro assays or in soil microcosms significantly reduces hatchability of eggs. The reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was greatest when root diffusates from the `Monalisa´ potato cultivar were used, followed by root diffusates from the `Désirée´ potato cultivar. However, no significant reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was found when root diffusates from the ‘San Pedro” tomato cultivar were used. For G. rostochiensis reduction in the juveniles hatching is obtained from the root diffusates 'Desirée' potato cultivar. Treatment with P. oxalicum also significantly reduces the number of cysts of G. pallida in pots. In order to optimize the practical application of P. oxalicum strain 212 as a biological soil treatment, it is essential to understand how the physical environment influences the BCA colonization, survival and growth, and the possible risk that can cause its application on other microorganisms in the ecosystem of performance. Therefore, the second objective of this thesis is the interaction of the BCA with the environment in which it is applied. Within this objective is evaluated the INFLUENCE OF TEMPERATURE, WATER AVAILABILITY AND PHYSICAL-CHEMICAL PROPERTIES OF SOILS (POROSITY, TEXTURE, DENSITY...) ON SURVIVAL AND GROWTH OF PO212 under controlled conditions to develop models for predicting the environmental impact of each factor on survival and growth of P. oxalicum and to know their ability to grow and survive in different environments. Two parameters are evaluated in the soil samples: i) the survival of Penicillium spp. by counting the number of colony forming units in semi-selective medium and ii) growth (biomass) of PO212 by real-time PCR. P. oxalicum grows and survives better in drought conditions regardless of temperature and soil type. P. oxalicum grows and survives more in sandy loam soils with low organic matter content, higher pH and lower availability of phosphorus and nitrogen. Survival and growth of P. oxalicum negatively correlates with the availability of water and positively with the organic content. Only survival also correlated positively with pH. Moreover, trials are carried out into commercial orchards soils with different physic-chemical properties and different environmental conditions TO STUDY THE ESTABLISHMENT, SURVIVAL, VERTICAL DISPERSION AND HORIZONTAL SPREAD OF PO212. P. oxalicum 212 can persist and survive at very low levels in soil one year after its release. The size of the PO212 population after its release into the tested natural soils is similar to that of indigenous Penicillium spp. Furthermore, the vertical dispersion and horizontal spread of PO212 is limited in different soil types. The introduction of P. oxalicum in a natural environment not only involves their action on the target organism, the pathogen, but also on other indigenous microorganisms. TO ASSESS THE EFFECT OF P. oxalicum APPLICATION ON SOIL INDIGENOUS FUNGAL COMMUNITIES in two commercial orchards, soil samples are analyzed by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis polyacrylamide (DGGE). Samples are taken from soil at two depths (5 and 10 cm) and four dates from the application of P. oxalicum 212 (0, 75, 180 and 365 days). DGGE analysis shows that differences are observed between sampling dates and are independent of the treatment of P. oxalicum applied and the depth. BCA application does not affect the fungal population of the two soil analyzed. Sequence analysis of the DGGE bands confirms previous findings and to identify the presence of BCA on soils. The presence of P. oxalicum in soil is especially related to environmental factors such as humidity. Therefore, we conclude that the 212 of strain Penicillium oxalicum can be considered an optimum BCA, since it is environmentally competitive and effective against a broad spectrum of diseases and does not have any negative effect on soil non-target fungi communities.

Toxicity and sublethal effects of six insecticides to last instar larvae and adults of the biocontrol agents Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera: Chrysopidae) and Adalia bipunctata (L.) (Coleoptera: Coccinellidae)

To further develop Integrated Pest Management (IPM) strategies against crop pests, it is important to evaluate the effects of insecticides on biological control agents. Therefore, we tested the toxicity and sublethal effects (fecundity and fertility) of flonicamid, flubendiamide, metaflumizone, spirotetramat, sulfoxaflor and deltamethrin on the natural enemies Chrysoperla carnea and Adalia bipunctata. The side effects of the active ingredients of the insecticides were evaluated with residual contact tests for the larvae and adults of these predators in the laboratory. Flonicamid, flubendiamide, metaflumizone and spirotetramat were innocuous to last instar larvae and adults of C. carnea and A. bipunctata. Sulfoxaflor was slightly toxic to adults of C. carnea and was highly toxic to the L4 larvae of A. bipunctata. For A. bipunctata, sulfoxaflor and deltamethrin were the most damaging compounds with a cumulative larval mortality of 100%. Deltamethrin was also the most toxic compound to larvae and adults of C. carnea. In accordance with the results obtained, the compounds flonicamid, flubendiamide, metaflumizone and spirotetramat might be incorporated into IPM programs in combination with these natural enemies for the control of particular greenhouse pests. Nevertheless, the use of sulfoxaflor and deltamethrin in IPM strategies should be taken into consideration when releasing either of these biological control agents, due to the toxic behavior observed under laboratory conditions. The need for developing sustainable approaches to combine the use of these insecticides and natural enemies within an IPM framework is discussed.

Supervisión multidistribuida para el control de procesos de conservación de productos agroalimentarios: optimización de calidad del producto

La presente Tesis está orientada al análisis de la supervisión multidistribuida de tres procesos agroalimentarios: el secado solar, el transporte refrigerado y la fermentación de café, a través de la información obtenida de diferentes dispositivos de adquisición de datos, que incorporan sensores, así como el desarrollo de metodologías de análisis de series temporales, modelos y herramientas de control de procesos para la ayuda a la toma de decisiones en las operaciones de estos entornos. En esta tesis se han utilizado: tarjetas RFID (TemTrip®) con sistema de comunicación por radiofrecuencia y sensor de temperatura; el registrador (i-Button®), con sensor integrado de temperatura y humedad relativa y un tercer prototipo empresarial, módulo de comunicación inalámbrico Nlaza, que integra un sensor de temperatura y humedad relativa Sensirion®. Estos dispositivos se han empleado en la conformación de redes multidistribuidas de sensores para la supervisión de: A) Transportes de producto hortofrutícola realizados en condiciones comerciales reales, que son: dos transportes terrestre de producto de IV gama desde Murcia a Madrid; transporte multimodal (barco-barco) de limones desde Montevideo (Uruguay) a Cartagena (España) y transporte multimodal (barco-camión) desde Montevideo (Uruguay) a Verona (Italia). B) dos fermentaciones de café realizadas en Popayán (Colombia) en un beneficiadero. Estas redes han permitido registrar la dinámica espacio-temporal de temperaturas y humedad relativa de los procesos estudiados. En estos procesos de transporte refrigerado y fermentación la aplicación de herramientas de visualización de datos y análisis de conglomerados, han permitido identificar grupos de sensores que presentan patrones análogos de sus series temporales, caracterizando así zonas con dinámicas similares y significativamente diferentes del resto y permitiendo definir redes de sensores de menor densidad cubriendo las diferentes zonas identificadas. Las metodologías de análisis complejo de las series espacio-temporales (modelos psicrométricos, espacio de fases bidimensional e interpolaciones espaciales) permitieron la cuantificación de la variabilidad del proceso supervisado tanto desde el punto de vista dinámico como espacial así como la identificación de eventos. Constituyendo así herramientas adicionales de ayuda a la toma de decisiones en el control de los procesos. Siendo especialmente novedosa la aplicación de la representación bidimensional de los espacios de fases en el estudio de las series espacio-temporales de variables ambientales en aplicaciones agroalimentarias, aproximación que no se había realizado hasta el momento. En esta tesis también se ha querido mostrar el potencial de un sistema de control basado en el conocimiento experto como es el sistema de lógica difusa. Se han desarrollado en primer lugar, los modelos de estimación del contenido en humedad y las reglas semánticas que dirigen el proceso de control, el mejor modelo se ha seleccionado mediante un ensayo de secado realizado sobre bolas de hidrogel como modelo alimentario y finalmente el modelo se ha validado mediante un ensayo en el que se deshidrataban láminas de zanahoria. Los resultados sugirieron que el sistema de control desarrollado, es capaz de hacer frente a dificultades como las variaciones de temperatura día y noche, consiguiendo un producto con buenas características de calidad comparables a las conseguidas sin aplicar ningún control sobre la operación y disminuyendo así el consumo energético en un 98% con respecto al mismo proceso sin control. La instrumentación y las metodologías de análisis de datos implementadas en esta Tesis se han mostrado suficientemente versátiles y transversales para ser aplicadas a diversos procesos agroalimentarios en los que la temperatura y la humedad relativa sean criterios de control en dichos procesos, teniendo una aplicabilidad directa en el sector industrial ABSTRACT This thesis is focused on the analysis of multi-distributed supervision of three agri-food processes: solar drying, refrigerated transport and coffee fermentation, through the information obtained from different data acquisition devices with incorporated sensors, as well as the development of methodologies for analyzing temporary series, models and tools to control processes in order to help in the decision making in the operations within these environments. For this thesis the following has been used: RFID tags (TemTrip®) with a Radiofrequency ID communication system and a temperature sensor; the recorder (i-Button®), with an integrated temperature and relative humidity and a third corporate prototype, a wireless communication module Nlaza, which has an integrated temperature and relative humidity sensor, Sensirion®. These devices have been used in creating three multi-distributed networks of sensors for monitoring: A) Transport of fruits and vegetables made in real commercial conditions, which are: two land trips of IV range products from Murcia to Madrid; multimodal transport (ship - ship) of lemons from Montevideo (Uruguay) to Cartagena (Spain) and multimodal transport (ship - truck) from Montevideo (Uruguay) to Verona (Italy). B) Two coffee fermentations made in Popayan (Colombia) in a coffee processing plant. These networks have allowed recording the time space dynamics of temperatures and relative humidity of the processed under study. Within these refrigerated transport and fermentation processes, the application of data display and cluster analysis tools have allowed identifying sensor groups showing analogical patterns of their temporary series; thus, featuring areas with similar and significantly different dynamics from the others and enabling the definition of lower density sensor networks covering the different identified areas. The complex analysis methodologies of the time space series (psychrometric models, bi-dimensional phase space and spatial interpolation) allowed quantifying the process variability of the supervised process both from the dynamic and spatial points of view; as well as the identification of events. Thus, building additional tools to aid decision-making on process control brought the innovative application of the bi-dimensional representation of phase spaces in the study of time-space series of environmental variables in agri-food applications, an approach that had not been taken before. This thesis also wanted to show the potential of a control system based on specialized knowledge such as the fuzzy logic system. Firstly, moisture content estimation models and semantic rules directing the control process have been developed, the best model has been selected by an drying assay performed on hydrogel beads as food model; and finally the model has been validated through an assay in which carrot sheets were dehydrated. The results suggested that the control system developed is able to cope with difficulties such as changes in temperature daytime and nighttime, getting a product with good quality features comparable to those features achieved without applying any control over the operation and thus decreasing consumption energy by 98% compared to the same uncontrolled process. Instrumentation and data analysis methodologies implemented in this thesis have proved sufficiently versatile and cross-cutting to apply to several agri-food processes in which the temperature and relative humidity are the control criteria in those processes, having a direct effect on the industry sector.

ERP Software Selection Processes: A Case Study in the Metal Transformation Sector

When a firm decides to implement ERP softwares, the resulting consequences can pervade all levels, includ- ing organization, process, control and available information. Therefore, the first decision to be made is which ERP solution must be adopted from a wide range of offers and vendors. To this end, this paper describes a methodology based on multi-criteria factors that directly affects the process to help managers make this de- cision. This methodology has been applied to a medium-size company in the Spanish metal transformation sector which is interested in updating its IT capabilities in order to obtain greater control of and better infor- mation about business, thus achieving a competitive advantage. The paper proposes a decision matrix which takes into account all critical factors in ERP selection.

Improving Speech Interaction in Vehicles Using Context-Aware Information through A SCXML Framework

Speech Technologies can provide important benefits for the development of more usable and safe in-vehicle human-machine interactive systems (HMIs). However mainly due robustness issues, the use of spoken interaction can entail important distractions to the driver. In this challenging scenario, while speech technologies are evolving, further research is necessary to explore how they can be complemented with both other modalities (multimodality) and information from the increasing number of available sensors (context-awareness). The perceived quality of speech technologies can significantly be increased by implementing such policies, which simply try to make the best use of all the available resources; and the in vehicle scenario is an excellent test-bed for this kind of initiatives. In this contribution we propose an event-based HMI design framework which combines context modelling and multimodal interaction using a W3C XML language known as SCXML. SCXML provides a general process control mechanism that is being considered by W3C to improve both voice interaction (VoiceXML) and multimodal interaction (MMI). In our approach we try to anticipate and extend these initiatives presenting a flexible SCXML-based approach for the design of a wide range of multimodal context-aware HMI in-vehicle interfaces. The proposed framework for HMI design and specification has been implemented in an automotive OSGi service platform, and it is being used and tested in the Spanish research project MARTA for the development of several in-vehicle interactive applications.

Criterios de calidad del servicio prestado en el ámbito de la línea de atraque de las terminales portuarias de contenedores

Esta Tesis Doctoral evalúa empíricamente la calidad del servicio en la línea de atraque de las terminales portuarias de contenedores. La metodología propuesta utiliza indicadores de calidad y se basa en el concepto de la segmentación de servicio. Para ello se desarrolla la teoría del Control Estadístico de Procesos (CEP) y se utilizan los gráficos de control para clasificar el servicio en las terminales de contenedores. El propósito de la Tesis es proporcionar una metodología basada en el Control Estadístico de Procesos (CEP) para evaluar la calidad del servicio y detectar las escalas de un servicio regular de línea que se encuentran fuera de control. Por tanto, la metodología se puede utilizar para detectar eventos que son indicativos de cambio real del proceso en la línea de atraque. Esta detección puede ser compleja pues las características de los procesos en terminales de contenedores son variables. La metodología proporciona mediante los gráficos de control criterios estadísticamente objetivos de cambio. Cuando el cambio es detectado y considerado bueno sus causas deben ser identificadas y posiblemente convertirse en la nueva forma de trabajar, cuando el cambio es negativo, entonces sus causas deberían ser identificadas y eliminadas. La Tesis Doctoral está organizado de la siguiente manera: La primera parte es la introducción, e incluye los capítulos 1 al 4, la segunda parte presenta el Estado del Arte (capítulo 5) y algunos de los estudios que han inspirado esta investigación, la tercera parte se centra en la metodología utilizada (capítulo 6) y su aplicación sobre un caso de estudio (capítulo 7). Finalmente, en la cuarta parte se presentan las conclusiones y se proponen algunas de las nuevas líneas de investigación que quedan abiertas (capítulo 8). This Thesis empirically evaluates the quality of service in the berthing face of container terminals. The methodology proposed is focused on quality of service indicators and is based on the concept of service segmentation. The Statistical Process Control (SPC) theory and the control charts are used to classify container terminal service. The aim of this Thesis is to provide a methodology based on Statistical Process Control that can evaluate the quality of service and also can detect scales of shipping liner service that are out of control. Therefore, the methodology can be used to detect events that are indicative of real change in the berthing process of container vessels. The methodology proposed allows simple detection of events that are indicative of actual process change in container terminals. This detection is complex because the characteristics of the processes are variable in the container terminals; the control chart provides statistically objective criteria of change. When change is detected and considered good its cause should be identified and possibly become the new way of working, where the change is bad then its cause should be identified and eliminated. This Thesis is organized as follows: The first part is the introduction (includes Chapters 1 to 4), the second part presents the State of the Art (Chapter 5) and some of the studies that have inspired this research. The third part focuses on the methodology used (Chapter 6) and its application to a case study (Chapter 7). Finally, Part 4 presents the conclusions and suggests future research (Chapter 8).

Selectivity of diacylhydrazine insecticides to the predatory bug Orius laevigatus: In vivo and modeling/docking experiments

BACKGROUND: Knowledge of pesticide selectivity to natural enemies is necessary for a successful implementation of biological and chemical control methods in integrated pest management (IPM) programs. Diacylhydrazine (DAH)-based ecdysone agonists also known as molting-accelerating compounds (MACs) are considered a selective group of insecticides, and their compatibility with predatory Heteroptera, which are used as biological control agents, is known. However, their molecular mode of action has not been explored in beneficial insects such as Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae). RESULTS: In this project in vivo toxicity assays demonstrated that the DAH-based RH-5849, tebufenozide and methoxyfenozide have no toxic effect against O. laevigatus. The ligand-binding domain (LBD) of the ecdysone receptor (EcR) of O. laevigatus was sequenced and a homology protein model was constructed which confirmed a cavity structure with 12 ?-helixes, harboring the natural insect molting hormone 20-hydroxyecdysone. However, docking studies showed that a steric clash occurred for the DAH-based insecticides due to a restricted extent of the ligand-binding cavity of the EcR of O. laevigatus. CONCLUSIONS: The insect toxicity assays demonstrated that MACs are selective for O. laevigatus. The modeling/docking experiments are indications that these pesticides do not bind with the LBD-EcR of O. laevigatus and support that they show no biological effects in the predatory bug. These data help in explaining the compatible use of MACs together with predatory bugs in IPM programs. Keywords: Orius laevigatus, selectivity, diacylhydrazine insecticides, ecdysone receptor, homology modelling, docking studies.

Influence of new integrated pest management strategies on aphidophagous predators in horticultural crops

El 1 de enero de 2014 entró en vigor la Directiva Europea 2009/128/CE sobre uso sostenible de plaguicidas y el Real Decreto 1311/2012 por el cual se traspone dicha normativa comunitaria al ámbito nacional. Estos reglamentos establecen el marco legal por el que las explotaciones agrícolas deben cumplir los principios generales de la Gestión Integrada de Plagas (GIP). Los principios de la GIP dan preferencia a aquellos métodos de control que sean sostenibles y respetuosos con el medio ambiente, dando prioridad al control biológico, al físico y a otros de carácter no químico. Sin embargo, el uso de insecticidas selectivos con los enemigos naturales es necesario en ocasiones para el adecuado manejo de las plagas en cultivos hortícolas. Por ello, el objetivo general de esta Tesis ha sido aportar conocimientos para la mejora del control de plagas en cultivos hortícolas, mediante la integración de estrategias de lucha biológica, física y química. La primera de las líneas de investigación de esta Tesis se centró en el estudio del efecto de la presencia dos depredadores, larvas Chrysoperla carnea y adultos de Adalia bipunctata, en la dispersión del virus de transmisión no persistente Cucumber mosaic virus (CMV) y del virus de transmisión persistente Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV), transmitidos por el pulgón Aphis gosypii en cultivo de pepino. La tasa de transmisión de CMV fue baja para los dos tiempos de evaluación ensayados (1 y 5 días), debido al limitado movimiento de su vector A. gossypii. Las plantas que resultaron infectadas se localizaron próximas a la fuente de inóculo central y la presencia de ambos enemigos naturales no incrementó significativamente el porcentaje de plantas ocupadas por pulgones ni la tasa de transmisión de CMV. Los patrones de distribución de A. gossypii y de CMV tan solo fueron coincidentes en las proximidades de la planta central infectada en la que se liberaron los insectos. En los ensayos con CABYV, la presencia de C. carnea y de A. bipunctata respectivamente provocó un incremento significativo de la dispersión de A. gossypii tras 14 días, pero no tras 7 días desde la liberación de los insectos. La reducción en el número inicial de pulgones en la planta central infectada con CABYV fue siempre mayor tras la liberación de C. carnea en comparación con A. bipunctata. Sin embargo, la tasa de transmisión de CABYV y su distribución espacial no se vieron significativamente modificadas por la presencia de ninguno de los depredadores, ni tras 7 días ni tras 14 días desde el inicio de los ensayos. Al igual que se estudió el efecto de la presencia de enemigos naturales en el comportamiento de las plagas y en la epidemiología de las virosis que transmiten, en una segunda línea de investigación se evaluó el posible efecto del consumo de pulgones portadores de virus por parte de los enemigos naturales. Este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Ecotoxicología del Departamento de Entomología de la Universidade Federal de Lavras (UFLA) (Brasil). En él se evaluó la influencia en los parámetros biológicos del enemigo natural Chrysoperla externa al alimentarse de Myzus persicae contaminados con el virus de transmisión persistente Potato leafroll virus (PLRV). El consumo de M. persicae contaminados con PLRV incrementó significativamente la duración de la fase larvaria, reduciendo también la supervivencia en comparación a otras dos dietas a base de M. persicae no contaminados con el virus y huevos del lepidóptero Ephestia kuehniella. La duración de la fase de pupa de C. externa no difirió significativamente entre las dietas a base de pulgones contaminados con PLRV y pulgones no contaminados, pero ambas fueron menores que con la dieta con huevos de E. kuehniella. Sin embargo, ni la supervivencia en la fase de pupa ni los parámetros reproductivos de los adultos emergidos mostraron diferencias significativas entre las dietas evaluadas. Por el contrario, la supervivencia de los adultos durante los 30 primeros días desde su emergencia sí se vio significativamente afectada por la dieta, siendo al término de este periodo del 54% para aquellos adultos de C. externa que durante su fase larvaria consumieron pulgones con PLRV. Dentro de la GIP, una de las estrategias de carácter físico que se emplean para el control de plagas y enfermedades en cultivos hortícolas protegidos es el uso de plásticos con propiedades fotoselectivas de absorción de la radiación ultravioleta (UV). Por ello, la tercera línea de investigación de la Tesis se centró en el estudio de los efectos directos e indirectos (mediados por la planta) de condiciones especiales de baja radiación UV sobre el crecimiento poblacional del pulgón A. gossypii y los parámetros biológicos del enemigo natural C. carnea, así como sobre las plantas de pepino en las que se liberaron los insectos. Los ensayos se realizaron en jaulones dentro de invernadero, utilizándose en el primero de ellos plantas de pepino sanas, mientras que en el segundo las plantas de pepino fueron previamente infectadas con CABYV para estudiar de qué manera afectaba la incidencia del virus en las mismas condiciones. Las condiciones de baja radiación UV (bajo plástico Térmico Antivirus®) ejercieron un efecto directo en las fases iniciales del cultivo de pepino, promoviendo su crecimiento, mientras que en fases más avanzadas del cultivo indujeron un aumento en el contenido en nitrógeno de las plantas. Las plantas de pepino que fueron sometidas a mayor intensidad de radiación UV (bajo plástico Térmico Blanco®) al inicio del cultivo mostraron un engrosamiento significativo de las paredes de las células epidérmicas del haz de las hojas, así como de la cutícula. El uso del plástico Térmico Antivirus®, utilizado como barrera fotoselectiva para crear condiciones de baja radiación UV, no alteró con respecto al plástico Térmico Blanco® (utilizado como control) el desarrollo poblacional del pulgón A. gossypii ni los parámetros biológicos evaluados en el depredador C. carnea. En el segundo experimento, realizado con plantas infectadas con CABYV, la incidencia de la virosis enmascaró las diferencias encontradas en experimento con plantas sanas, reduciendo aparentemente la influencia de las distintas condiciones de radiación UV. Por último, para el desarrollo de las estrategias de GIP es importante estudiar los posibles efectos secundarios que los plaguicidas pueden tener en los enemigos naturales de las plagas. Es por ello que en la Tesis se evaluaron la toxicidad y los efectos subletales (fecundidad y fertilidad) de flonicamida, flubendiamida, metaflumizona, spirotetramat, sulfoxaflor y deltametrina en los enemigos naturales C. carnea y A. bipunctata. Los efectos secundarios fueron evaluados por contacto residual tanto para larvas como para adultos de ambos enemigos naturales en condiciones de laboratorio. Flonicamida, flubendiamida, metaflumizona y spirotetramat fueron inocuos para larvas de último estadio y adultos de C. carnea y A. bipunctata. Por este motivo, estos insecticidas se presentan como buenos candidatos para ser incorporados dentro de programas de GIP en combinación con estos enemigos naturales para el control de plagas de cultivos hortícolas. Sulfoxaflor fue ligeramente tóxico para adultos de C. carnea y altamente tóxico para larvas de último estadio de A. bipunctata. Para A. bipunctata, sulfoxaflor y deltametrina fueron los compuestos más dañinos. Deltametrina fue también el compuesto más tóxico para larvas y adultos de C. carnea. Por tanto, el uso de deltametrina y sulfoxaflor en programas de GIP debería tomarse en consideración cuando se liberasen cualquiera de estos dos enemigos naturales debido al comportamiento tóxico que mostraron en condiciones de laboratorio. ABSTRACT On 1 January 2014 came into effect the Directive 2009/128/EC of the European Parliament about sustainable use of pesticides and the Royal Decree 1311/2012 that transposes the regulation to the Spanish level. These regulations establish the legal framework that agricultural holdings must adhere to in order to accomplish the general principles of Integrated Pest Management (IPM). The guidelines of IPM give priority to sustainable and eco-friendly pest control techniques, such as biological and physical measures. Nevertheless, the use of pesticides that are selective to natural enemies is sometimes a necessary strategy to implement accurate pest management programs in horticultural protected crops. Therefore, the general objective of this Thesis was to contribute to the improvement of pest management strategies in horticultural crops, by means of the integration of biological, physical and chemical techniques. The first research line of this Thesis was focused on the evaluation of the effects of two aphidophagous predators, Chrysoperla carnea larvae and Adalia bipunctata adults, on the spread of the non-persistently transmitted Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus) and the persistently transmitted Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV, Polerovirus), by the aphid vector Aphis gossypii in a cucumber crop under greenhouse conditions. The CMV transmission rate was generally low, both after 1 and 5 days, due to the limited movement of its aphid vector A. gossypii. Infected plants were mainly located around the central virusinfected source plant, and the percentage of aphid occupation and CMV-infected plants did not differ significantly in absence and presence of natural enemies. The distribution patterns of A. gossypii and CMV were only coincident close to the central plant where insects were released. In the CABYV experiments, the presence of C. carnea larvae and A. bipunctata adults induced significant A. gossypii dispersal after 14 days but not after 7 days. The reduction in the initial aphid population established in the central plant was always higher for C. carnea than for A. bipunctata. Nevertheless, CABYV spread was not significantly modified by the presence of each predator either in the short term (7 days) or in the long term (14 days). Furthermore, the percentage of CABYV-infected plants did not significantly differ when each natural enemy was present in any evaluation period. It is important to evaluate the influence that natural enemies have on pest dynamics and on the spread of viral diseases, but it should be also taken into account the possible effect on the performance of natural enemies when they feed on preys that act as vectors of viruses. Thus, in a second research line developed in the Laboratory of Ecotoxicology, Department of Entomology, of the Universidade Federal de Lavras (UFLA) (Brazil), it was evaluated the performance of Chrysoperla externa under the condition of consuming Myzus persicae acting as vector of Potato leafroll virus (PLRV). The diet composed of PLRV-infected M. persicae significantly increased the length and reduced the survival rate, of the larval period in regard to the other two diets, composed of non-infected M. persicae and Ephestia kuehniella eggs. The lengths of the pupal stage were not significantly different between the aphid diets, but both were significantly shorter than that of E. kuehniella eggs. Neither pupal survival nor reproductive parameters revealed significant differences among the diets. Nevertheless, the adult survival curves during the first 30 days after emergence showed significant differences, reaching at the end of this interval a value of 54% for those C. externa adults fed on PLRVinfected aphids during their larval period. According to the IPM guidelines, one of the physical strategies for the control of pests and diseases in horticultural protected crops is the use of plastic films with photoselective properties that act as ultraviolet (UV) radiation blocking barriers. In this sense, the third research line of the Thesis dealt with the study of the direct and plant-mediated influence of low UV radiation conditions on the performance of the aphid A. gossypii and on the biological parameters of the natural enemy C. carnea, as well as on the cucumber plants where insects were released. The experiments were conducted inside cages under greenhouse conditions, using for the first one healthy cucumber plants, while for the second experiment the cucumber plants were previously infected with CABYV in order to assess the influence of the virus in the same conditions. The low UV radiation conditions (under Térmico Antivirus® plastic film) seemed to exert a direct effect in the early stages of cucumber plants, enhancing their growth, and in an increasing nitrogen content at further developmental stages. The higher UV radiation exposure (under Térmico Blanco® plastic film) in the early stages of the cucumber crop induced the thickening of the adaxial epidermal cell walls and the cuticle of leaves. The use of Térmico Antivirus® plastic film as a photoselective barrier to induce low UV radiation conditions did not modify, in regard to Térmico Blanco® plastic film (used as control), neither the population development of A. gossypii nor the studied biological parameters of the predator C. carnea. In the second experiment, done with CABYV-infected cucumber plants, the incidence of the virus seemed to mask the direct and plant-mediated influence of the different UV radiation conditions. In last term, for the development of IPM strategies it is important to study the potential side effects that pesticides might have on natural enemies. For this reason, in the Thesis were tested the toxicity and sublethal effects (fecundity and fertility) of flonicamid, flubendiamide, metaflumizone, spirotetramat, sulfoxaflor and deltamethrin on the natural enemies C. carnea and A. bipunctata. The side effects of the active ingredients of the insecticides were evaluated with residual contact tests for the larvae and adults of these predators under laboratory conditions. Flonicamid, flubendiamide, metaflumizone and spirotetramat were innocuous to last instar larvae and adults of C. carnea and A. bipunctata. Therefore, these pesticides are promising candidates for being incorporated into IPM programs in combination with these natural enemies for the control of particular greenhouse pests. In contrast, sulfoxaflor was slightly toxic to adults of C. carnea and was highly toxic to last instar larvae of A. bipunctata. For A. bipunctata, sulfoxaflor and deltamethrin were the most damaging compounds. Deltamethrin was also the most toxic compound to larvae and adults of C. carnea. In accordance with this fact, the use of sulfoxaflor and deltamethrin in IPM strategies should be taken into consideration when releasing either of these biological control agents, due to the toxic behavior observed under laboratory conditions.

Transductive neurofuzzy-based torque control of a milling process: results of a case study

This paper presents the design and implementation of an intelligent control system based on local neurofuzzy models of the milling process relayed through an Ehternet-based application. Its purpose is to control the spindle torque of a milling process by using an internal model control paradigm to modify the feed rate in real time. The stabilization of cutting cutting torque is especially necessary in milling processes such as high-spedd roughing of steel moulds and dies tha present minor geometric uncertainties. Thus, maintenance of the curring torque increaes the material removal rate and reduces the risk of damage due to excessive spindle vibration, a very sensitive and expensive component in all high-speed milling machines. Torque control is therefore an interesting challenge from an industrial point of view.