Mecanismos implicados en las etapas iniciales de infección en la cancrosis de los cítricos provocada por Xanthomonas citri subsp. citri

La cancrosis o chancro bacteriano de los cítricos (CBC) causada por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii, afecta a un gran número de especies dentro de la familia de las rutáceas, especialmente cítricos. Esta enfermedad produce graves pérdidas económicas allí donde está presente, principalmente porque la comercialización de cítricos desde las zonas afectadas hacía zonas libres de cancrosis, está sujeta a fuertes medidas cuarentenarias. La cancrosis se encuentra distribuida a nivel mundial pero no se ha localizado ni en la Unión Europea ni en ningún área del Mediterráneo. Se han descrito tres tipos de cancrosis en función de la gama de huésped y de las características fenotípicas y genotípicas de las bacterias que las producen. La más extendida es la cancrosis tipo A producida por Xcc, dentro de la cual se distinguen los subtipos Aw y A*, originarios de Florida y Sudeste Asiático, respectivamente, que de forma natural solo son capaces de producir enfermedad en lima mejicana. En este trabajo se presentan estudios sobre mecanismos implicados en las primeras etapas de la infección, como la quimiotaxis y formación de biopelículas, en la cancrosis de los cítricos. La quimiotaxis es el proceso por el cual las bacterias se dirigen hacia zonas favorables para su supervivencia y desarrollo. Los perfiles quimiotácticos obtenidos frente a distintas fuentes de carbono, así como los estudios en relación al contenido de proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs), permitieron agrupar a las cepas de Xanthomonas estudiadas en este trabajo, de acuerdo a la enfermedad producida y a su gama de huésped. Todas las cepas mostraron quimiotaxis positiva frente a extractos de hoja y apoplasto de diferentes especies, sin embargo, Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac) y X. campestris pv. campestris (Xc) manifestaron respuestas más específicas frente a extractos de apoplasto de hojas de naranjo dulce, lima y col china, respectivamente. Dicho resultado nos permite asociar el mecanismo de quimiotaxis con la capacidad de las cepas de Xanthomonas para colonizar estos huéspedes de forma específica. Las cepas estudiadas fueron capaces de realizar movimiento tipo swimming, twitching y sliding en distintos medios, siendo el movimiento swimming el único en el que se encontraron diferencias entre las cepas de Xcc con distinta gama de huésped. En este trabajo se ha estudiado además la formación de biopelículas en superficies bióticas y abióticas, un mecanismo importante tanto para la supervivencia en superficie vegetal como para el desarrollo de la infección. Las cepas de Xanthomonas estudiadas fueron capaces de formar biopelículas in vitro, siendo mayor en un medio que simula el apoplasto y que contiene una baja concentración de nutrientes en comparación con medios que contenían alta concentración de nutrientes. La formación de biopelículas en superficie vegetal se encontró relacionada, en las cepas patógenas de cítricos, con la capacidad para infectar un tejido o huésped determinado. Se han caracterizado algunos de los componentes de la matriz extracelular producida por Xcc, que compone hasta un 90% de las bipoelículas. Entre ellos destaca el ADN extracelular, que tiene un papel como adhesina en las primeras etapas de formación de biopelículas y estructural en biopelículas maduras. Además, se han identificado el pilus tipo IV como componente importante en las biopelículas, que también participa en motilidad. Finalmente, se han realizado estudios sobre la expresión de genes implicados en motilidad bacteriana y formación de biopelículas que han confirmado las diferencias existentes entre cepas de Xcc de amplia y limitada gama de huésped, así como el papel que juegan elementos como el pilus tipo IV o el flagelo en estos procesos. ABSTRACT Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and X. fuscans subsp. aurantifolii are the causal agents of Citrus Bacterial Canker (CBC) which is one of the most important citrus diseases. CBC affects all Citrus species as well as other species from Rutaceae family. CBC produces strong economic losses; furthermore the commercialization of plants and fruits is restricted from infested to citrus canker free areas. The disease is worldwide distributed in tropical and subtropical areas, however it is not present in the European Union. Three types of CBC have been described according to the host range and phenotypic and genotypic characteristics. CBC type A caused by Xcc is he widest distributed. Within CBC A type two subtypes Aw and A* were described from Florida and Iran respectively, both infecting only Mexican lime. Herein mechanisms connected to early events in the citrus bacterial canker disease such as chemotaxis and biofilm formation, were studied. Chemotaxis allows bacteria to move towards the more suitable environments for its survival, host colonization and infection. Studies performed on citrus pathogenic Xanthomonas and X. campestris pv. campestris (Xc), a crucifer pathogen, have shown different chemotactic profiles towards carbon compound as well as different MCPs profile, which clustered strains according to host range and disease caused. Every strain showed positive chemotaxis toward leaf extracts and apoplastic fluids from sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage leaves. However, a more specific response was found for strains Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis and Xc towards sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage apoplastic fluids, respectively. These results relate chemotaxis with the higher ability of those strains to specifically colonize their proper host. Xanthomonas strains studied were able to perform swimming, sliding and twitching motilities. The ability to swim was variable among CBC strains and seemed related to host range. Biofilm formation is an important virulence factor for Xcc because it allows a better survival onto the plant surface as well as facilitates the infection process. The studied Xanthomonas strains were able to form biofilm in vitro, on both nutrient rich and apoplast mimicking media, furthermore the biofilm formation by all the strains was higher in the apoplast mimicking media. The ability to form biofilm in planta by Xcc and Xac strains was dependent of the host and the tissue colonized. The wide host range CBC strain was able to form biofilm onto several citrus leaves and fruits, however the limited host range CBC strain produced biofilm solely onto Mexican lime leaves and fruits. Furthermore Xac strain, which solely infects leaves of young plants, was not able to develop biofilms on fruits. Some components of the extracellular matrix produced by Xcc strains have been characterized. Extracellular DNA acted as an adhesin at the very early stages of biofilm formation and as structural component of mature biofilm for citrus pathogenic Xanthomonas. Furthermore type IV pilus has been identified as a component of the extracellular matrix in biofilm and motility. Transcriptional studies of genes related with biofilm formation and motility have confirmed the differential behavior found among wide and limited host range CBC strains as well as the role of type IV pili and flagellum on those processes.

Evaluación del tiempo de reacción en velocistas con y sin discapacidad auditiva: aplicaciones para la inclusión

Este trabajo de investigación trata de aportar luz al estudio del tiempo de reacción (TR) en velocistas con y sin discapacidad auditiva desde las Ciencias del Deporte. El planteamiento del presente estudio surgió al cuestionarnos la existencia de las diferencias en cuanto al TR visual y auditivo aplicado a velocistas con y sin discapacidad auditiva, pensando en el desarrollo futuro de competiciones inclusivas entre ambos colectivos. Por ello, este estudio trata de resolver las dificultades que los velocistas con discapacidad se encuentran habitualmente en las competiciones. A priori, los atletas con discapacidad auditiva compiten en inferioridad de condiciones como consecuencia de una salida que no parece la más adecuada para ellos (desde los tacos, han de mirar hacia la pistola del juez o el movimiento de un rival). El documento se divide en tres partes. En la primera parte se realiza la pertinente revisión del marco teórico y justificación del estudio. La segunda parte se centra en los objetivos de la investigación, el material y el método, donde se muestran los resultados, discusión y conclusiones del estudio realizado, así como las limitaciones del presente trabajo y sus futuras líneas de investigación. La tercera parte corresponde a la bibliografía y la cuarta parte a los anexos. En la primera parte, presentamos el marco teórico compuesto por cinco capítulos organizan la fundamentación que hemos realizado como revisión sobre los aspectos más destacados del TR, determinado por las características de la tarea y otros factores que influyen en el TR como objeto de nuestro estudio. Después exponemos los principales aspectos estructurales y funcionales del sistema nervioso (SN) relacionados con el TR visual y auditivo. Tras ello se expone la realidad del deporte para personas con discapacidad auditiva, indagando en sus peculiaridades y criterios de elegibilidad que tiene ese colectivo dentro del ámbito deportivo. A continuación abordamos el estudio de la salida de velocidad en el atletismo, como aspecto clave que va a guiar nuestra investigación, especialmente los parámetros determinantes en la colocación de los tacos de salida para atletas con y sin discapacidad auditiva, la posición de salida y la propia colocación de los estímulos en dicha situación. Es la segunda parte se desarrolla el trabajo de investigación que tiene como objetivos estudiar los valores de TR visual simple manual, TR en salida de tacos y los tiempos de desplazamiento a los 10m y 20m de velocistas con y sin discapacidad auditiva, así como analizar las posibles diferencias en TR según posición y tipo de estímulo luminoso, respecto a ambos grupos de atletas. Como tercer objetivo de estudio se evalúa cualitativamente, por parte de los propios atletas, el dispositivo luminoso utilizado. La toma de datos de este estudio se llevó a cabo entre los meses de febrero y mayo del 2014, en el módulo de atletismo del Centro de Alto Rendimiento Joaquín Blume (Madrid), con dos grupos de estudio, uno de 9 velocistas con discapacidad auditiva (VDA), conformando éstos el 60% de toda la población en España, según el número de las licencias de la FEDS en la modalidad de atletismo (velocistas, pruebas de 100 y 200 m.l.), en el momento del estudio, y otro de 13 velocistas sin discapacidad (VsDA) que se presentaron de manera voluntaria con unos mismos criterios de inclusión para ambos grupos. Para la medición y el registro de los datos se utilizaron materiales como hoja de registro, Medidor de Tiempo de Reacción (MTR), tacos de salida, ReacTime®, dispositivo luminoso conectado a los tacos de salida, células fotoeléctricas, ordenador y software del ReacTime, y cámara de video. La metodología utilizada en este estudio fue de tipo correlacional, analizando los resultados del TR simple manual según vía sensitiva (visual y auditiva) entre los dos grupos de VDA y VsDA. También se estudiaron los TR desde la salida de tacos en función de la colocación del dispositivo luminoso (en el suelo y a 5 metros, vía visual) y pistola de salida atlética (vía auditiva) así como el tiempo de desplazamiento a los 10m (t10m) y 20m (t20m) de ambos grupos de velocistas. Finalmente, se desarrolló y llevó a cabo un cuestionario de evaluación por parte de los atletas VDA con el objetivo de conocer el grado de satisfacción después de haber realizado la serie de experimentos con el dispositivo luminoso y adaptado para sistemas de salida en la velocidad atlética. Con el objetivo de comprobar la viabilidad de la metodología descrita y probar en el contexto de análisis real el protocolo experimental, se realizó un estudio piloto con el fin de conocer las posibles diferencias del TR visual desde los tacos de salida en velocistas con discapacidad auditiva, usando para dicha salida un estímulo visual mediante un dispositivo luminoso coordinado con la señal sonora de salida (Soto-Rey, Pérez-Tejero, Rojo-González y Álvarez-Ortiz, 2015). En cuanto a los procedimientos estadísticos utilizados, con el fin de analizar la distribución de los datos y su normalidad, se aplicó la prueba de Kolmogorov-Smirnof, dicha prueba arrojó resultados de normalidad para todas las variables analizadas de las situaciones experimentales EA, EVsuelo y EV5m. Es por ello que en el presente trabajo de investigación se utilizó estadística paramétrica. Como medidas descriptivas, se calcularon el máximo, mínimo, media y la desviación estándar. En relación a las situaciones experimentales, para estudiar las posibles diferencias en las variables estudiadas dentro de cada grupo de velocistas (intragrupo) en la situación experimental 1 (MTR), se empleó una prueba T de Student para muestras independientes. En las situaciones experimentales 2, 3 y 4, para conocer las diferencias entre ambos grupos de velocistas en cada situación, se utilizó igualmente la prueba T para muestras independientes, mientras que un ANOVA simple (con post hoc Bonferroni) se utilizó para analizar las diferencias para cada grupo (VDA y VsDA) por situación experimental. Así mismo, se utilizó un ANOVA de medidas repetidas, donde el tipo de estímulo (situación experimental) fue la variable intra-grupo y el grupo de velocistas participantes (VDA y VsDA) la entre-grupo, realizándose esta prueba para evaluar en cada situación el TR, t1m0 y t20m y las interacciones entre las variables. Para el tratamiento estadístico fue utilizado el paquete estadístico SPSS 18.0 (Chicago, IL, EEUU). Los niveles de significación fueron establecidos para un ≤0.05, indicando el valor de p en cada caso. Uno de los aspectos más relevantes de este trabajo es la medición en diferentes situaciones, con instrumentación distinta y con situaciones experimentales distintas, del TR en velocistas con y sin discapacidad auditiva. Ello supuso el desarrollo de un diseño de investigación que respondió a las necesidades planteadas por los objetivos del estudio, así como el desarrollo de instrumentación específica (Rojo-Lacal, Soto-Rey, Pérez-Tejero y Rojo-González, 2014; Soto-Rey et al., 2015) y distintas situaciones experimentales que reprodujeran las condiciones de práctica y competición real de VsDA y VDA en las pruebas atléticas de velocidad, y más concretamente, en las salidas. El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre los estímulos visuales y sonoros medidos con el MTR, siendo menor el TR ante el estímulo visual que ante el sonoro, tanto para los atletas con discapacidad auditiva como para los que no la presentaron (TR visual, 0.195 s ± 0.018 vs 0.197 s ± 0.022, p≤0.05; TR sonoro 0.230 s ± 0.016 vs 0.237 s ± 0.045, p≤0.05). Teniendo en cuenta los resultados según población objeto de estudio y situación experimental, se registraron diferencias significativas entre ambas poblaciones, VDA y VsDA, siendo más rápidos los VDA que VsDA en la situación experimental con el estímulo visual en el suelo (EVsuelo, 0.191 ±0.025 vs 0.210 ±0.025, p≤0.05, respectivamente) y los VsDA en la situación experimental con el estímulo auditivo (EA, 0.396 ±0.045 vs 0.174 ±0.021, p≤0.05), aunque sin diferencias entre ambos grupos en la situación experimental con el estímulo visual a 5m de los tacos de salida. Es de destacar que en el TR no hubo diferencias significativas entre EA para VsDA y EVsuelo para VDA. El ANOVA simple registró diferencias significativas en todas las situaciones experimentales dentro de cada grupo y para todas las variables, por lo que estadísticamente, las situaciones experimentales fueron diferentes entre sí. En relación al de ANOVA medidas repetidas, la prueba de esfericidad se mostró adecuada, existiendo diferencias significativas en las varianzas de los pares de medias: el valor de F indicó que existieron diferencias entre las diferentes situaciones experimentales en cuanto a TR, incluso cuando éstas se relacionaban con el factor discapacidad (factor interacción, p≤0,05). Por ello, queda patente que las situaciones son distintas entre sí, también teniendo en cuenta la discapacidad. El η2 (eta al cuadrado, tamaño del efecto, para la interacción) indica que el 91.7% de la variación se deben a las condiciones del estudio, y no al error (indicador de la generalización de los resultados del estudio). Por otro lado, la evaluación del dispositivo luminoso fue positiva en relación a la iluminación, comodidad de uso, ubicación, color, tamaño, adecuación del dispositivo y del equipamiento necesario para adaptar al sistema de salida. La totalidad de los atletas afirman rotundamente que el dispositivo luminoso favorecería la adaptación al sistema de salida atlética para permitir una competición inclusiva. Asimismo concluyen que el dispositivo luminoso favorecería el rendimiento o mejora de marca en la competición. La discusión de este estudio presenta justificación de las diferencias demostradas que el tipo de estímulo y su colocación son clave en el TR de esta prueba, por lo que podríamos argumentar la necesidad de contar con dispositivos luminosos para VDA a la hora de competir con VsDA en una misma prueba, inclusiva. El presente trabajo de investigación ha demostrado, aplicando el método científico, que el uso de estos dispositivos, en las condiciones técnicas y experimentales indicadas, permite el uso por parte del VDA, usando su mejor TR visual posible, que se muestra similar (ns) al TR auditivo de VsDA, lo que indica que, para competiciones inclusivas, la salida usando el semáforo (para VDA) y la salida habitual (estímulo sonoro) para VsDA, puede ser una solución equitativa en base a la evidencia demostrada en este estudio. De esta manera, y como referencia, indicar que la media de los TR de los velocistas en la final de los 100 m.l. en los Juegos Olímpicos de Londres 2012 fue de 0.162 ±0.015. De esta manera, creemos que estos parámetros sirven de referencia a técnicos deportivos, atletas y futuros trabajos de investigación. Las aplicaciones de este trabajo permitirán modificaciones y reflexiones en forma de apoyo al entrenamiento y la competición para el entrenador, o juez de salida en la competición que, creemos, es necesaria para proporcionar a este colectivo una atención adecuada en las salidas, especialmente en situaciones inclusivas de práctica. ABSTRACT This research aims to study of reaction time (RT) in sprinters with and without hearing impairment from the Sports Science perspective. The approach of this study came asking whether there were differences in the visual and auditory RT applied to sprinters with and without hearing impairment, thinking about the future development of inclusive competition between the two groups. Therefore, this study attempts to resolve the difficulties commonly founded by sprinters with hearing impairments during competitions. A priori, sprinters with hearing impairment would compete in a disadvantage situation as a result of the use of a staring signal not suitable for them (from the blocks, they have to look to the judge´s pistol or the movement of an opponent). The document is divided into three parts. In the first part of the review of relevant theoretical framework and justification of the study is presented. The second part focuses on the research objectives, material and method, where results, discussion and conclusions of the study, as well as the limitations of this study and future research are presented. The third part contains references and the fourth, annexes. In the first part, we present the theoretical framework consisting of five chapters, organizing the state of the art of RT, determined by the characteristics of the task and other factors that influence the RT as object of our study. Then we present the main structural and functional aspects of the nervous system associated with visual and auditory RT. After that, sport for people with hearing disabilities is presented, investigating its peculiarities and eligibility criteria is that group within the deaf sport. Finally, we discuss the theoretical foundation of the study of start speed in athletics as a key aspect that will guide our research, especially the determining parameters in placing the starting blocks for athletes with and without hearing impairment, the starting position and the actual placement of stimuli in such a situation. The second part of the research aims to study the values of simple manual visual RT, RT start from blocks and travel times up to 10m and 20m of sprinters with and without hearing impairment, and to analyze possible differences in RT as position and type of light stimulus with respect to both groups of athletes. The third objective of the study is to assess the pertinence of the lighting device developed and used in the study, in a qualitatively way by athletes themselves. Data collection for this study was carried out between February and May 2014, in the Athletics module at the High Performance Centre Joaquin Blume (Madrid) with the two study groups: 9 sprinters with hearing impairments(VDA, reaching 60% of the population in Spain, according to the number of licenses for athletics at FEDS: sprint, 100 and 200 m.l., at the time of the study), and another 13 sprinters without disability (VsDA) who voluntarily presented themselves, with same inclusion criteria for both groups. For measuring and data collection materials such as recording sheet, gauge reaction time (MTR), starting blocks, ReacTime®, luminous device connected to the starting blocks, photocells, computer and software ReacTime, and video camera were used. The methodology used in this study was correlational, analyzing the results of simple manual RT according sensory pathway (visual and auditory) between the two groups (VsDA and VDA). Also auditory and visual RT was studied depending the placement of the start light signal (on the ground and 5 meters, visual pathway) and athletic start gun signal (auditory pathway, conventional situation) and travel time up to 10m (t10m) and 20m (t20m) for both groups of sprinters. Finally, we developed and carried out an evaluation questionnaire for VDA athletes in order to determine the degree of satisfaction after completing the series of experiments with lighting device and adapted to start systems in athletic speed. In order to test the feasibility of the methodology described and tested in the context of real analysis of the experimental protocol, a pilot study in order to know the possible differences visual RT from the starting blocks in sprinters with hearing impairments was performed, to said output using a visual stimulus coordinated by a lighting device with sound output signal (Soto-Rey Perez-Tejero, Rojo-González y Álvarez-Ortiz, 2015). For the statistical procedures, in order to analyze the distribution of the data and their normality, Kolmogorov-Smirnov test was applied, this test yielded normal results for all variables analyzed during EA, EVsuelo and EV5m experimental situations. Parametric statistics were used in this research. As descriptive measures, the maximum, minimum, mean and standard deviation were calculated. In relation to experimental situations, to study possible differences in the variables studied in each group sprinters (intragroup) in the experimental situation 1 (MTR), a Student t test was used for independent samples. Under the experimental situations 2, 3 and 4, to know the differences between the two groups of sprinters in every situation, the T test for independent samples was used, while a simple ANOVA (with post hoc Bonferroni) was used to analyze differences for each group (VDA and VsDA) by experimental situation. Likewise, a repeated measures ANOVA, where the type of stimulus (experimental situation) was variable intra-group and participants sprinters group (VDA and VsDA) the variable between-group, was performed to assess each situation for RT, t10m and t20m, and also interactions between variables. For the statistical treatment SPSS 18.0 (Chicago, IL, USA) was used. Significance levels were set for  ≤0.05, indicating the value of p in each case. One of the most important aspects of this work is the measurement of RT in sprinters with and without hearing impairment in different situations, with different instrumentation and different experimental situations. This involved the development of a research design that responded to the needs raised by the study aims and the development of specific instrumentation (Rojo-Lacal, Soto-Rey Perez-Tejero and Rojo-Gonzalez, 2014; Soto-Rey et al., 2015) and different experimental situations to reproduce the conditions of practical and real competition VsDA and VDA in athletic sprints, and more specifically, at the start. Statistical analysis showed significant differences between the visual and sound stimuli measured by the MTR, with lower RT to the visual stimulus that for sound, both for athletes with hearing disabilities and for those without (visual RT, 0.195 s ± 0.018 s vs 0.197 ± 0.022, p≤0.05; sound RT 0.230 s ± 0.016 vs 0.237 s ± 0.045, p≤0.05). Considering the results according to study population and experimental situation, significant differences between the two populations, VDA and VsDA were found, being faster the VDA than VsDA in the experimental situation with the visual stimulus on the floor (EVsuelo, recorded 0.191 s ± 0.025 vs 0.210 s ± 0.025, p≤0.05, respectively) and VsDA in the experimental situation with the auditory stimulus (EA, 0.396 s ± 0.045 vs 0.174 s ± 0.021, p≤0.05), but no difference between groups in the experimental situation with the 5m visual stimulus to the starting blocks. It is noteworthy that no significant differences in EA and EVsuelo between VsDA to VDA, respectively, for RT. Simple ANOVA showed significant differences in all experimental situations within each group and for all variables, so statistically, the experimental situations were different. Regarding the repeated measures ANOVA, the sphericity test showed adequate, and there were significant differences in the variances of the pairs of means: the value of F indicated that there were differences between the different experimental situations regarding RT, even when they were related to the disability factor (factor interaction, p≤0.05). Therefore, it is clear that the situations were different from each other, also taking into account impairment. The η2 (eta squared, effect size, for interaction) indicates that 91.7% of the variation is due to the conditions of the study, not by error (as indicator of the generalization potential of the study results). On the other hand, evaluation of the light signal was positively related to lighting, ease of use, location, color, size, alignment device and equipment necessary to adapt the start system. All the athletes claim strongly in favor of the lighting device adaptation system to enable athletic competition inclusive. Also they concluded that light device would enhance performance or would decrease their RT during the competition. The discussion of this study justify the type of stimulus and the start light positioning as key to the RT performance, so that we could argue the need for lighting devices for VDA when competing against VsDA the same competition, inclusive. This research has demonstrated, applying the scientific method, that the use of these devices, techniques and given experimental conditions, allows the use of the VDA, using his best visual RT, shown similar (ns) auditory RT of VsDA, indicating that for inclusive competitions, the start signal using the light (for VDA) and the usual start (sound stimulus) to VsDA can be an equitable solution based on the evidence shown in this study. Thus, and as a reference, indicate that the average of the RT sprinters in the 100 m. final at the 2012 Summer Olympic Games was 0.162 s ± 0.015. Thus, we believe that these parameters become a reference to sports coaches, athletes and future research. Applications of this work will allow modifications and reflections in the form of support for training and competition for the coach, or judge, as we believe is necessary to provide adequate attention to VDA in speed starts, especially in inclusive practice situations.