Caracterización molecular del mutante riso 1508 de cebada : modificaciones transcripcionales y posttranscripcionales en el desarrollo de la semilla

La semilla es el principal órgano reproductivo de las plantas espermatofitas, permitiendo la dispersión de las poblaciones y asegurando su supervivencia gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad para germinar bajo condiciones ambientales óptimas. El rendimiento y valor económico de los cereales, que constituyen la primera cosecha mundial, depende, en buena medida, de la eficacia con que se acumulan en la semilla sustancias de reserva: proteínas, carbohidratos y lípidos. El principal carbohidrato acumulado en la semilla de cebada es el almidón y la fracción mayoritaria de proteínas es la de las prolaminas (solubles en etanol al 70%); estas proteínas tienen muy bajo contenido en lisina, un aminoácido esencial en la dieta de animales monogástricos. Con el fin de mejorar el valor nutricional de la semilla de cebada, se han obtenido diferentes mutantes con un mayor contenido en este aminoácido. Riso 1508 es un mutante de cebada rico en lisina cuya mutación lys3a, de efectos pleiotrópicos, segrega como un único gen mendeliano. Entre otros, presenta una reducción drástica de la expresión de algunos genes que codifican proteínas de reserva de tipo prolamina, en concreto, presenta reducida la expresión de los genes que codifican B-, C- y ϒ-Hordeínas y del inhibidor de tripsina CMe, pero no tiene alterada la expresión del gen que codifica las D-Hordeínas. Este último gen carece en su promotor del motivo GLM (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), que es reconocido por factores transcripcionales bZIP. En este trabajo, el mutante de cebada Riso 1508 se ha utilizado como herramienta para profundizar en el conocimiento de la regulación génica en semillas durante las fases de la maduración y la germinación. Para ello, en una primera aproximación, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparando el genotipo mutante con el silvestre durante la maduración de la semilla. Además de confirmar variaciones en los genes que codifican proteínas de reserva, este análisis indicó que también estaban afectados los genes relacionados con metabolismo de carbohidratos. Por ello se decidió caracterizar la familia multigénica de sacarosas sintasa (SUSy) en cebada. Se anotaron dos nuevos genes, HvSs3 y HvSs4, cuya expresión se comparó con la de los genes HvSs1 y HvSs2, previamente descritos en el laboratorio. La expresión de los cuatro genes en tejidos diferentes y su respuesta a estreses abióticos se analizó mediante RT-qPCR. HvSs1 y HvSs2 se expresaron preferencialmente durante el desarrollo del endospermo, y HvSs1 también fue un tránscrito abundante durante la germinación. HvSs1 se indujo en hojas en condiciones de anoxia y HvSs3 por estrés hídrico, y ambos genes se indujeron por tratamientos de frío. La localización subcelular de las cuatro isoformas no fue sólo citoplásmica, sino que también se localizaron en zonas próximas a retículo endoplásmico y en la cara interna de la membrana plasmática; además, se observó una co-localización de HvSS1 con el marcador de mitocondrias. Estos datos sugieren un papel distinto aunque parcialmente solapante de las cuatro Sacarosa Sintasas de cebada, descritas hasta la fecha. Las cinéticas de expresión de los genes que codifican los TFs más importantes implicados en la regulación génica durante el desarrollo del endospermo de cebada, se analizaron por RT-qPCR en ambos genotipos, demostrando que los TFs de la clase DOF aparecieron desregulados durante todo el proceso en Riso 1508 comparado con el cv. Bomi, aunque también se observaron diferencias significativas en algunos de los que codifican bZIPs. Estudios previos indicaban que el ortólogo de BLZ2 en maíz, O2, se regula post-traduccionalmente mediante un mecanismo de fosforilación/defosforilación reversible, y que la forma defosforilada es la fisiológicamente activa. En este trabajo se demostró que BLZ2 está sujeto a este tipo de regulación y que la proteín-fosfatasa HvPP2C2 está implicada en el proceso. La interacción de HvPP2C2 y BLZ2 tiene lugar en el núcleo celular únicamente en presencia de 100 μM ABA. En el mutante Riso 1508, BLZ2 se encuentra en un estado hiperfosforilado tanto durante la maduración como durante la germinación de la semilla, lo que dificultaría la unión de BLZ2 a las secuencias GLM en los promotores de los genes que codifican B-, C-,y ϒ- Hordeínas y CMe. Summary The seed is the main reproductive organ of spermatophyte plants allowing the spread of populations and ensuring their survival through its desiccation tolerance and because of their ability to germinate under optimum environmental conditions. Yield and economic value of cereal crops, that constitute the first world crop, depend largely on the efficiency with which they accumulate in the seed reserve substances: proteins, carbohydrates and lipids. The main carbohydrate accumulated in the barley seed is starch and the major protein fraction is that of prolamins (soluble in 70% ethanol); these proteins have a very low lysine content, an essential amino-acid for the diet of monogastric animals. In order to improve the nutritional value of the barley seed, different mutants have been obtained with a higher content of this amino-acid. Riso 1508 is one lysine-rich mutant whose mutation (lys3a) segregates as a single Mendelian gene with pleiotropic effects, such as a drastic reduction of genes encoding the trypsin inhibitor CMe and the B-, C-and ϒ-hordeins, but has not altered the expression of the gene encoding the D-hordeins. This latter gene lacks in its promotor the GLM motif (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), that is recognised by bZIP transcription factors In this work we have used the barley mutant Riso 1508 as a tool for better understanding gene regulation in seeds during the maturation and germination phases. To this aim, a transcriptomic analysis was performed comparing wild and mutant genotypes during seed maturation. Besides confirming variations in the expression of genes encoding reserve proteins, this analysis indicated that some genes related with carbohydrate metabolism were also affected. It was therefore decided to characterize the multigene family of sucrose synthases (SUSy) in barley. Two new genes were annotated, HvSs3 and HvSs4, and its expression was compared with that of genes HvSs1 and HvSs2, previously described in our laboratory. The expression of the four genes in different tissues and in response to abiotic stresses was analyzed by RTqPCR. HvSs1 and HvSs2 were preferentially expressed during the development of the endosperm, and the HvSs1 transcript was also abundant upon germination. HvSs1 was induced in leaves by anoxic conditions, HvSs3 by water stress, and both genes were induced by cold treatments. The subcellular localization of all four isoforms was not only cytoplasmic, but they could be found along the endoplasmic reticulum and at the inner side of the cell membrane; HvSS1, was also associated with the mitochondrial marker. These data suggest a distinct but partially overlapping roles for the barley sucrose synthases, described so far. The expression kinetics of the genes encoding the most important TFs involved in gene regulation during barley endosperm development was analyzed by RT-qPCR in both genotypes. These data show that the genes encoding DOF TFs were mis-regulated throughout the process in Riso 1508, although significant differences were also found among some of those encoding bZIPs. Previous studies indicated that the BLZ2 orthologue in maize, O2, was post-translationally regulated by reversible phosphorylation/dephosphorylation and that the dephosphorylated protein is the physiologically active form. In this work we demostrate that BLZ2 is under a similar regulation and that the proteinphosphatase HvPP2C2 is implicated in the process. The interaction between HvPP2C2 and BLZ2 takes place in the cell nucleus only in the presence of 100 μM ABA. In the Riso 1508 mutant, BLZ2 is found in a hyperphosphorylated state in the maturation phase and upon seed germination; because of this, the BLZ2 binding to the GLM promoter sequences of genes encoding B-, C- y ϒ- Hordeins and CMe would be decreased in the mutant.

El levantamiento de arquitectura como dibujo de concurso sin tiempo: los dibujos del Pantheon desde el Renacimiento hasta la actualidad

En un estudio reciente sobre ?Los cuatro libros de arquitectura? de Andrea Palladio, Javier Rivera (2008) propone la hipótesis que el autor utilizó la publicación para influir en la adjudicación de obras en Venecia. Aunque no se tratara de un concurso formalmente establecido el dibujo de arquitectura en general y el de levantamiento en particular se utilizaba como herramienta competitiva para comparar habilidades. La obra de documentación de Antoine Degodetz en Italia también es fruto de una difícil selección para adjudicarse y mantener en los años la beca de estancia en la Academia de Roma. Puesto que el levantamiento es una operación crítica e interpretativa cada arquitecto entiende su trabajo como una mejora personal respeto al anterior y vuelve a dibujar obras ya documentadas previamente. El levantamiento y el dibujo se utilizan para superar los límites de los predecesores o contemporáneos posicionándose en continua comparación con otros trabajos sobre el mismo tema y configurándose efectivamente como un dibujo de concurso sin tiempo. El trabajo realizado tiene como objeto el análisis con esta óptica de una serie de dibujos de levantamiento del Pantheon. El modelo se ha elegido por su indiscutible valor histórico y por su presencia en un gran número de los estudios de edificios antiguos documentados a partir del Renacimiento hasta la actualidad.

Andrea Branzi y la “Città senza architettura”: De la No-Stop City a los modelos de urbanización débil

El tema de estudio de esta tesis son las propuestas urbanas que Andrea Branzi ha desarrollado durante los últimos cincuenta años, centrándose especialmente en aquellas más elaboradas y completas: la No-Stop City (1970-71), que elabora como miembro del grupo radical Archizoom, y dos de sus modelos de urbanización débil, Agronica (1995) y el Master Plan para el Strijp Philips de Eindhoven (2000). Se trata de una parte de su obra que ha mantenido constante, a lo largo del tiempo, una propuesta de disolución de la arquitectura de notable consistencia que puede describirse con la fórmula “città senza architettura”, acuñada por él mismo. Una voluntad que ya se apunta en la muy variada producción de Archizoom previa a la No-Stop City, y que cristaliza y se hace explícita en este proyecto que aspiraba a: “liberar al hombre de la arquitectura”. A pesar de la continuidad de esta idea en el tiempo, la ciudad sin arquitectura de Branzi ha evolucionado claramente dando lugar a distintos tipos de disolución. Una disolución que, obviamente, no supone la efectiva desaparición de la disciplina, sino la formulación de una arquitectura “otra” basada en un replanteamiento radical de la naturaleza y el papel de la misma. Esta agenda contra la disciplina se ha desplegado a través de una serie de temas que socavan el objeto arquitectónico canónico (su vaciamiento expresivo, la pérdida de importancia de la envolvente y la forma acabada, el carácter anticompositivo, la independencia entre forma y función, la mutabilidad en el tiempo…), pero va más allá al poner en crisis el rol que la propia arquitectura ha tenido en la configuración material, política y simbólica del hábitat humano. Una pérdida de protagonismo y centralidad en la sociedad contemporánea que, en el discurso del arquitecto, implica necesariamente un papel subordinado. De este proceso de disolución surge un nuevo tipo de ciudad en la que la forma urbana o se ha perdido o se ha convertido en superflua, en la que se ha disuelto la zonificación funcional, cuyos espacios interiores se hallan en un proceso de permanente reprogramación que ignora las tipologías, que trasciende la división entre lo urbano y lo agrícola y que es, ante todo, un espacio de flujos y servicios. La crisis de la ciudad tradicional implica, en definitiva, un cambio en la naturaleza misma de lo urbano que pasa de considerarse un lugar físico y construido, a convertirse en una condición inmaterial y virtualmente omnipresente que se despliega independientemente de su soporte físico. En las investigaciones urbanas de Branzi convergen, además, muchas de las reflexiones que el arquitecto ha desarrollado sobre, y desde, las distintas “escalas” de la actividad profesional: diseño, arquitectura y urbanismo. Estas propuestas no sólo cuestionan las relaciones establecidas entre objetos, edificios, ciudades y territorios sino que ponen en cuestión estas mismas categorías. Unas ciudades sin arquitectura que se basan, en última instancia, en plantear preguntas que son muy sencillas y, por otra parte, eternas: ¿Qué es un edificio? ¿Qué es una ciudad? ABSTRACT The subject of study of this thesis are the urban proposals developed by Andrea Branzi over the last fifty years, with a special focus on the more developed and comprehensive ones: the No- Stop City (1970-1971), produced as a member of the architettura radicale group Archizoom, and two of his “weak urbanization models”: Agronica (1995) and the Master Plan for Philips Strijp in Eindhoven (2000). This area of his work has kept, over time, a remarkably consistent proposal for the dissolution of architecture that can be described with the motto città senza architettura (city without architecture), coined by himself. A determination, already latent in the very diverse production of Archizoom prior to No-Stop City, that crystallizes and becomes explicit in this project which was aimed to "liberate man from the architecture." Despite the continuity of this idea over time, Branzi’s city without architecture has clearly evolved leading to different types of dissolution. A dissolution that, obviously, does not mean the effective demise of the discipline, but rather, the formulation of an architecture autre based on a radical rethinking of its nature and role. This agenda against the discipline has been developed through a number of issues that undermine the canonical architectural object (its expressive emptying, the loss of importance of the envelope and the finished shape, the anticompositional character, the independence between form and function, the mutability over time...), but goes beyond it by putting into crisis the role that architecture itself has had in the material, political and symbolic configuration of the human habitat. A loss of prominence and centrality in contemporary society that, in the architect’s discourse, implies a subordinate role. From this dissolution process, a new type of city arises: a city where urban form has been lost or has become superfluous, in which functional zoning has dissolved, whose interiors are in a permanent process of reprogramming that ignores typologies, that transcends the division between urban and agricultural and becomes, above all, a space of flows and services. Ultimately, the crisis of the traditional city implies a change in the very nature of the urban that moves from being regarded as a physical and built place, to become an immaterial and virtually omnipresent condition that unfolds regardless of its physical medium. Many of the ideas Branzi has developed on, and from, the different "scales" of professional activity (design, architecture and urbanism) converge in his urban research. These proposals not only question the relations between objects, buildings, cities and territories but also these very categories. Cities without architecture that are based, ultimately, on raising simple questions that are, on the other hand, eternal: What is a building? What is a city?