Caracterización funcional de los genes sgb (suppressors of agb1-2 susceptibility to pathogens): Nuevos reguladores de la respuesta de inmunidad innata de Arabidopsis thaliana

Un porcentaje importante de las pérdidas de la producción agrícola se deben a las enfermedades que causan en los cultivos los hongos necrótrofos y vasculares. Para mejorar la productividad agrícola es necesario tener un conocimiento detallado de las bases genéticas y moleculares que regulan la resistencia de las plantas a este tipo de patógenos. En Arabidopsis thaliana la resistencia frente a patógenos necrótrofos, como el hongo Plectosphaerella cucumerina BMM (PcBMM), es genéticamente compleja y depende de la activación coordinada de distintas rutas de señalización, como las reguladas por las hormonas ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA), etileno (ET) y ácido abscísico (ABA), así como de la síntesis de compuestos antimicrobianos derivados del Triptófano y de la integridad de la pared celular (Llorente et al., 2005, Hernández-Blanco et al., 2007; Delgado-Cerezo et al., 2012). Uno de los componentes claves en la regulación de la resistencia de las plantas a patógenos (incluidos hongos necrótrofos y biótrofos) es la proteína G heterotrimérica, un complejo proteico formado por tres subunidades (Gα, Gβ y Gγ), que también regula distintos procesos del desarrollo vegetal. En Arabidopsis hay un gen que codifica para la subunidad α (GPA1), otro para la β (AGB1), y tres genes para la subunidad γ (AGG1, AGG2 y AGG3). El complejo GPA1-AGB1-AGG (1-3) se activa y disocia tras la percepción de una señal específica, actuando el dímero AGB1-AGG1/2 como un monómero funcional que regula las respuestas de defensa (Delgado-Cerezo et al., 2012). Estudios transcriptómicos y análisis bioquímicos de la pared celular en los que se comparaban los mutantes agb1-2 y agg1 agg2, y plantas silvestres (Col-0) revelaron que la resistencia mediada por Gβ-Gγ1/2 no es dependiente de rutas de defensa previamente caracterizadas, y sugieren que la proteína G podría modular la composición/estructura (integridad) de la pared celular (Delgado-Cerezo et al., 2012). Recientemente, se ha demostrado que AGB1 es un componente fundamental de la respuesta inmune mediada por Pathogen- Associated Molecular Patterns (PTI), ya que los mutantes agb1-2 son incapaces de activar tras el tratamiento con PAMPs respuestas de inmunidad, como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS; Liu et al., 2013). Dada la importancia de la proteína G heterotrimérica en la regulación de la respuestas de defensa (incluida la PTI) realizamos un escrutinio de mutantes supresores de la susceptibilidad de agb1-2 al hongo necrótrofo, PcBMM, para identificar componentes adicionales de las rutas de señalización reguladas por AGB1. En este escrutinio se aislaron cuatro mutantes sgb (suppressors of agb1-2 susceptibility to pathogens), dos de los cuales, sgb10 y sgb11, se han caracterizado en la presente Tesis Doctoral. El mutante sgb10 es un segundo alelo nulo del gen MKP1 (At3g55270) que codifica la MAP quinasa-fosfatasa 1 (Bartels et al., 2009). Este mutante presenta lesiones espontáneas en plantas adultas y una activación constitutiva de las principales rutas de defensa (SA, JA y ET, y de metabolitos secundarios, como la camalexina), que explicaría su elevada resistencia a PcBMM y Pseudomonas syringae. Estudios epistáticos sugieren que la resistencia mediada por SGB10 no es dependiente, si no complementaria a la regulada por AGB1. El mutante sgb10 es capaz de restablecer en agb1-2 la producción de ROS y otras respuestas PTI (fosforilación de las MAPK6/3/4/11) tras el tratamiento con PAMPs tan diversos como flg22, elf18 y quitina, lo que demuestra el papel relevante de SGB10/MKP1 y de AGB1 en PTI. El mutante sgb11 se caracteriza por presentar un fenotipo similar a los mutantes irregular xylem (e.g. irx1) afectado en pared celular secundaria: irregularidades en las células xilemáticas, reducción en el tamaño de la roseta y altura de planta, y hojas con un mayor contenido de clorofila. La resistencia de sgb11 a PcBMM es independiente de agb1-2, ya que la susceptibilidad del doble mutante sgb11 agb1-2 es intermedia entre la de agb1-2 y sgb11. El mutante sgb11 no revierte la deficiente PTI de agb1-2 tras el tratamiento con flg22, lo que indica que está alterado en una ruta distinta de la regulada por SGB10. sgb11 presenta una sobreactivación de la ruta del ácido abscísico (ABA), lo que podría explicar su resistencia a PcBMM. La mutación sgb11 ha sido cartografiada en el cromosoma III de Arabidopsis entre los marcadores AthFUS6 (81,64cM) y nga6 (86,41cM) en un intervalo de aproximadamente 200 kb, que comprende genes, entre los que no se encuentra ninguno previamente descrito como IRX. El aislamiento y caracterización de SGB11 apoya la relevancia de la proteína G heterotrimérica en la regulación de la interconexión entre integridad de la pared celular e inmunidad. ABSTRACT A significant percentage of agricultural losses are due to diseases caused by necrotrophic and vascular fungi. To enhance crop yields is necessary to have a detailed knowledge of the genetic and molecular bases regulating plant resistance to these pathogens. Arabidopsis thaliana resistance to necrotrophic pathogens, such as Plectosphaerella cucumerina BMM (PcBMM) fungus, is genetically complex and depends on the coordinated activation of various signaling pathways. These include those regulated by salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), ethylene (ET) and abscisic acid (ABA) hormones and the synthesis of tryptophan-derived antimicrobial compounds and cell wall integrity (Llorente et al., 2005, Hernández-Blanco et al., 2007; Delgado-Cerezo et al., 2012). One key component in the regulation of plant resistance to pathogens (including biotrophic and necrotrophic fungi) is the heterotrimeric G-protein. This protein complex is formed by three subunits (Gα, Gβ and Gγ), which also regulates various plant developmental processes. In Arabidopsis only one gene encodes for subunits α (GPA1) and β (AGB1), and three genes for subunit γ (AGG1, AGG2 y AGG3). The complex GPA1- AGB1-AGG(1-3) is activated and dissociates after perception of an specific signal, AGB1- AGG1/2 acts as a functional monomer regulating defense responses (Delgado-Cerezo et al., 2012). Comparative transcriptomic studies and biochemical analyses of the cell wall of agb1-2 and agg1agg2 mutant and wild plants (Col-0), showed that Gβ-Gγ1/2-mediated resistance is not dependent on previously characterized defense pathways. In addition, it suggests that G protein may modulate the composition/structure (integrity) of the plant cell wall (Delgado-Cerezo et al., 2012). Recently, it has been shown that AGB1 is a critical component of the immune response mediated by Pathogen-Associated Molecular Patterns (PTI), as agb1-2 mutants are unable to activate immune responses such as oxygen reactive species (ROS) production after PAMPs treatment (Liu et al., 2013). Considering the importance of the heterotrimeric G protein in regulation of defense responses (including PTI), we performed a screening for suppressors of agb1-2 susceptibility to the necrotrophic fungus PcBMM. This would allow the identification of additional components of the signaling pathways regulated by AGB1. In this search four sgb mutants (suppressors of agb1-2 susceptibility to pathogens) were isolated, two of which, sgb10 and sgb11, have been characterized in this PhD thesis. sgb10 mutant is a second null allele of MKP1 gene (At3g55270), which encodes the MAP kinase-phosphatase 1 (Bartels et al., 2009). This mutant exhibits spontaneous lesions in adult plants and a constitutive activation of the main defense pathways (SA, JA and ET, and secondary metabolites, such as camalexin), which explains its high resistance to Pseudomonas syringae and PcBMM. Epistatic studies suggest that SGB10- mediated resistance is not dependent, but complementary to the regulated by AGB1. The sgb10 mutant is able to restore agb1-2 ROS production and other PTI responses (MAPK6/3/4/11 phosphorylation) upon treatment with PAMPs as diverse as, flg22, elf18 and chitin, demonstrating the relevant role of SGB10/MKP1 and AGB1 in PTI. sgb11 mutant is characterized by showing a similar phenotype to irregular xylem mutants (e.g. irx1), affected in secondary cell wall: irregular xylems cells, rosette size reduction and plant height, and higher chlorophyll content on leaves. The resistance of sgb11 to PcBMM is independent of agb1-2, as susceptibility of the double mutant agb1-2sgb11 is intermediate between agb1-2 and sgb11. The sgb11 mutant does not revert the deficient PTI response in agb1-2 after flg22 treatment, indicating that is altered in a pathway different to the one regulated by SGB10. sgb11 presents an over-activation of the abscisic acid pathway (ABA), which could explain its resistance to PcBMM. The sgb11 mutation has been mapped on chromosome III of Arabidopsis, between AthFUS6 (81.64 cM) and nga6 (86.41 cM) markers, in 200 kb interval, which does not include previously known IRX genes. The isolation and characterization of SGB11 supports the importance of heterotrimeric G protein in the regulation of the interconnection between the cell wall integrity and immunity.

Potencial de la producción de bioelectricidad de las Comarcas Agrarias de la Comunidad de Madrid en base a centeno y triticale

En el presente trabajo se estudia la producción potencial de biomasa procedente de los cultivos de centeno y triticale en las seis comarcas agrarias de la Comunidad de Madrid (CM) y la posibilidad de su aplicación a la producción de bioelectricidad en cada una de ellas. En primer lugar se realiza un estudio bibliográfico de la situación actual de la bioelectricidad. Uno de los principales datos a tener en cuenta es que en el PER 2011- 2020 se estima que el total de potencia eléctrica instalada a partir de biomasa en España en el año 2020 sea de 1.350 MW, unas dos veces y media la existente a finales de 2010. Además, se comenta el estado de la incentivación del uso de biomasa de cultivos energéticos para producción de electricidad, la cual se regula actualmente según el Real Decreto-ley 9/2013, de 12 de Julio, por el que se adoptaron medidas urgentes para garantizar la estabilidad financiera del sistema eléctrico, y se consideran los criterios de sostenibilidad en el uso de biocombustibles sólidos. Se realiza una caracterización de las seis comarcas agrarias que forman la Comunidad Autónoma de Madrid: Área Metropolitana, Campiña, Guadarrama, Lozoya- Somosierra, Sur-Occidental y Vegas, la cual consta de dos partes: una descripción de la climatología y otra de la distribución de la superficie dedicada a barbecho y cultivos herbáceos. Se hace una recopilación bibliográfica de los modelos de simulación más representativos de crecimiento de los cultivos (CERES y Cereal YES), así como de ensayos realizados con los cultivos de centeno y triticale para la producción de biomasa y de estudios efectuados mediante herramientas GIS y técnicas de análisis multicriterio para la ubicación de centrales de bioelectricidad y el estudio de la logística de la biomasa. Se propone un modelo de simulación de la productividad de biomasa de centeno y de triticale para la CM, que resulta de la combinación de un modelo de producción de grano en base a datos climatológicos y a la relación biomasa/grano media de ambos cultivos obtenida en una experiencia previa. Los modelos obtenidos responden a las siguientes ecuaciones (siendo TN = temperatura media normalizada a 9,9 ºC y PN = precipitación acumulada normalizada a 496,7 mm): - Producción biomasa centeno (t m.s./ha) = 2,785 * [1,078 * ln(TN + 2*PN) + 2,3256] - Producción biomasa triticale (t m.s./ha) = 2,595 * [2,4495 * ln(TN + 2*PN) + 2,6103] Posteriormente, aplicando los modelos desarrollados, se cuantifica el potencial de producción de biomasa de centeno y triticale en las distintas comarcas agrarias de la CM en cada uno de los escenarios establecidos, que se consideran según el uso de la superficie de barbecho de secano disponible (25%, 50%, 75% y 100%). Las producciones potenciales de biomasa, que se podrían alcanzar en la CM utilizando el 100% de la superficie de barbecho de secano, en base a los cultivos de centeno y triticale, se estimaron en 169.710,72 - 149.811,59 - 140.217,54 - 101.583,01 - 26.961,88 y 1.886,40 t anuales para las comarcas de Campiña - Vegas, Sur - Occidental - Área Metropolitana - Lozoya-Somosierra y Guadarrama, respectivamente. Se realiza un análisis multicriterio basado en la programación de compromiso para definir las comarcas agrarias con mejores características para la ubicación de centrales de bioelectricidad en base a los criterios de potencial de biomasa, infraestructura eléctrica, red de carreteras, espacios protegidos y superficie de núcleos urbanos. Al efectuar el análisis multicriterio, se obtiene la siguiente ordenación jerárquica en base a los criterios establecidos: Campiña, Sur Occidental, Vegas, Área Metropolitana, Lozoya-Somosierra y Guadarrama. Mediante la utilización de técnicas GIS se estudia la localización más conveniente de una central de bioelectricidad de 2,2 MW en cada una de las comarcas agrarias y según el uso de la superficie de barbecho de secano disponible (25%, 50%, 75% y 100%), siempre que exista potencial suficiente. Para el caso de la biomasa de centeno y de triticale en base seca se considera un PCI de 3500 kcal/kg, por lo que se necesitarán como mínimo 17.298,28 toneladas para satisfacer las necesidades de cada una de las centrales de 2,2 MW. Se analiza el potencial máximo de bioelectricidad en cada una de las comarcas agrarias en base a los cultivos de centeno y triticale como productores de biomasa. Según se considere el 25% o el 100% del barbecho de secano para producción de biomasa, la potencia máxima de bioelectricidad que se podría instalar en cada una de las comarcas agrarias variaría entre 5,4 y 21,58 MW en la comarca Campiña, entre 4,76 y 19,05 MW en la comarca Vegas, entre 4,46 y 17,83 MW en la comarca Sur Occidental, entre 3,23 y 12,92 MW en la comarca Área Metropolitana, entre 0,86 y 3,43 MW en la comarca Lozoya Somosierra y entre 0,06 y 0,24 MW en la comarca Guadarrama. La potencia total que se podría instalar en la CM a partir de la biomasa de centeno y triticale podría variar entre 18,76 y 75,06 MW según que se utilice el 25% o el 100% de las tierras de barbecho de secano para su cultivo. ABSTRACT In this work is studied the potential biomass production from rye and triticale crops in the six Madrid Community (MC) agricultural regions and the possibility of its application to the bioelectricity production in each of them. First is performed a bibliographical study of the current situation of bioelectricity. One of the main elements to be considered is that in the PER 2011-2020 is estimated that the total installed electric power from biomass in Spain in 2020 was 1.350 MW, about two and a half times as at end 2010. Also is discussed the status of enhancing the use of biomass energy crops for electricity production, which is currently regulated according to the Real Decreto-ley 9/2013, of July 12, by which urgent measures were adopted to ensure financial stability of the electrical system, and there are considered the sustainability criteria in the use of solid biofuels. A characterization of the six Madrid Community agricultural regions is carried out: Area Metropolitana, Campiña, Guadarrama, Lozoya-Somosierra, Sur-Occidental and Vegas, which consists of two parts: a description of the climatology and another about the distribution of the area under fallow and arable crops. It makes a bibliographic compilation of the most representative crop growth simulation models (CERES and Cereal YES), as well as trials carried out with rye and triticale crops for biomass production and studies conducted by GIS tools and techniques multicriteria analysis for the location of bioelectricity centrals and the study of the logistics of biomass. Is proposed a biomass productivity simulation model for rye and triticale for MC that results from the combination of grain production model based on climatological data and the average relative biomass/grain of both crops obtained in a prior experience. The models obtained correspond to the following equations (where TN = normalized average temperature and PN = normalized accumulated precipitation): - Production rye biomass (t d.m./ha) = 2.785 * [1.078 * ln (TN + 2*PN) + 2.3256] - Production triticale biomass (t d.m./ha) = 2,595 * [2.4495 * ln (TN + 2*PN) + 2.6103] Subsequently, applying the developed models, the biomass potential of the MC agricultural regions is quantified in each of the scenarios established, which are considered as the use of dry fallow area available (25%, 50%, 75 % and 100%). The potential biomass production that can be achieved within the MC using 100% of the rainfed fallow area based on rye and triticale crops, were estimated at 169.710,72 - 149.811,59 - 140.217,54 - 101.583,01 - 26.961,88 and 1.886,40 t annual for the regions of Campiña, Vegas, Sur Occidental, Area Metropolitana, Lozoya- Somosierra and Guadarrama, respectively. A multicriteria analysis is performed, based on compromise programming to define the agricultural regions with better features for the location of bioelectricity centrals, on the basis of biomass potential, electrical infrastructure, road network, protected areas and urban area criteria. Upon multicriteria analysis, is obtained the following hierarchical order based on criteria: Campiña, Sur Occidental, Vegas, Area Metropolitana, Lozoya-Somosierra and Guadarrama. Likewise, through the use of GIS techniques, the most suitable location for a 2,2 MW bioelectricity plant is studied in each of the agricultural regions and according to the use of dry fallow area available (25%, 50% , 75% and 100%), if there is sufficient potential. In the case of biomass rye and triticale dry basis is considered a PCI of 3500 kcal/kg, so it will take at least 17,298.28 t to satisfy the needs of each plant. Is analyzed the maximum bioelectricity potential on each of the agricultural regions on the basis of the rye and triticale crops as biomass producers. As deemed 25% or 100% dry fallow for biomass, the maximum bioelectricity potential varies between 5,4 and 21,58 MW in the Campiña region, between 4,76 and 19,05 MW in the Vegas region, between 4,46 and 17,83 MW in the Sur Occidental region, between 3,23 and 12,92 MW in the Area Metropolitana region, between 0,86 and 3,43 MW in the Lozoya-Somosierra region and between 0,06 and 0,24 MW in the Guadarrama region. The total power that could be installed in the CM from rye and triticale biomass could vary between 18.76 and 75.06 MW if is used the 25% or 100% of fallow land for rainfed crop.

On the production of N-2(+) ions at the N 1s edge of the nitrogen molecule

The N+2 ion yield of the N2 molecule has been measured at the N 1s → Rydberg excitations. It displays Fano-type line shapes due to interference between direct outer-valence photoionization and participator decay of the core-excited Rydberg states. The N+2 ion yield is compared with the total intensity of the outer-valence photoelectron lines obtained recently with electron spectroscopy (Kivimäki et al 2012 Phys. Rev. A 86 012516). The increasing difference between the two curves at the higher core-to-Rydberg excitations is most likely due to soft x-ray emission processes that are followed by autoionization. The results also suggest that resonant Auger decay from the core–valence doubly excited states contributes to the N+2 ion yield at the photon energies that are located on both sides of the N 1s ionization limit.