Análisis molecular de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel y eficiencia simbiótica en Rhizobium leguminosarum

Los suelos ultramáficos, que poseen elevadas concentraciones de níquel, cobalto y cromo de manera natural, son fuente de bacterias resistentes a altas concentraciones de metales. Se realizó la caracterización físico-química de seis suelos ultramáficos del suroeste europeo, seleccionándose un suelo de la región de Gorro, Italia, como el más adecuado para aislar bacterias endosimbióticas resistentes a metales. A partir de plantas-trampa de guisante y lenteja inoculados con suspensiones de ese suelo, se obtuvieron 58 aislados de Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) que fueron clasificados en 13 grupos según análisis de PCR-RAPDs. Se determinó la resistencia a cationes metálicos [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] de una cepa representante de cada grupo, así como la secuencia de los genomas de las cepas que mostraron altos niveles (UPM1137 y UPM1280) y bajos niveles (UPM1131 y UPM1136) de tolerancia a metales. Para identificar mecanismos de resistencia a metales se realizó una mutagénesis al azar en dicha cepa mediante la inserción de un minitransposón. El análisis de 4313 transconjugantes permitió identificar 14 mutantes que mostraron una mayor sensibilidad a Ni(II) que la cepa silvestre. Se determinó el punto de inserción del minitransposón en todos ellos y se analizaron en más detalle dos de los mutantes (D2250 y D4239). En uno de los mutantes (D2250), el gen afectado codifica para una proteína que presenta un 44% de identidad con dmeF (divalent efflux protein) de Cupriavidus metallidurans. Cadena arriba de dmeF se identificó un gen que codifica una proteína con un 39% de identidad con el regulador RcnR de Escherichia coli. Se decidió nombrar a este sistema dmeRF, y se generó un mutante en ambos genes en la cepa Rlv SPF25 (Rlv D15). A partir de experimentos de análisis fenotípico y de regulación se pudo demostrar que el sistema dmeRF tiene un papel relevante en la resistencia a Ni(II) y sobre todo a Co(II) en células en vida libre y en simbiosis con plantas de guisante. Ambos genes forman un operón cuya expresión se induce en respuesta a la presencia de Ni(II) y Co(II). Este sistema se encuentra conservado en distintas especies del género Rhizobium como un mecanismo general de resistencia a níquel y cobalto. Otro de los mutantes identificados (D4239), tiene interrumpido un gen que codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC. Aunque inicialmente fue identificado por su sensibilidad a níquel, experimentos posteriores demostraron que su elevada sensibilidad a metales era debida a su sensibilidad al medio TY, y más concretamente a la triptona presente en el medio. En otros medios de cultivo el mutante no está afectado específicamente en su tolerancia a metales. Este mutante presenta un fenotipo simbiótico inusual, siendo inefectivo en guisantes y efectivo en lentejas. Análisis de complementación y de mutagénesis dirigida sugieren que el fenotipo de la mutación podría depender de otros factores distintos del gen portador de la inserción del minitransposón. ABSTRACT Ultramafic soils, having naturally high concentrations of nickel, cobalt and chrome, are potential sources of highly metal-resistant bacteria. A physico-chemical characterization of six ultramafic soils from the European southwest was made. A soil from Gorro, Italy, was chosen as the most appropriated for the isolation of heavy-metal-resistant endosymbiotic bacteria. From pea and lentil trap plants inoculated with soil suspensions, 58 isolates of Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) were obtained and classified into 13 groups based on PCR-RAPDs analysis. The resistance to metallic cations [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] was analyzed in a representative strain of each group. From the results obtained in the resistance assays, the Rlv UPM1137 strain was selected to identify metal resistance mechanism. A random mutagenesis was made in UPM1137 by using minitransposon insertion. Analysis of 4313 transconjugants allowed to identify 14 mutants with higher sensitivity to Ni(II) than the wild type strain. The insertion point of the minitransposon was determined in all of them, and two mutants (D2250 and D4239) were studied in more detail. In one of the mutants (D2250), the affected gene encodes a protein with 44% identity in compared with DmeF (divalent efflux protein) from Cupriavidus metallidurans. Upstream R. leguminosarum dmeF, a gene encoding a protein with 39% identity with RcnR regulator from E. coli was identified. This protein was named DmeR. A mutant with both genes in the dmeRF deleted was generated and characterized in Rlv SPF25 (Rlv D15). From phenotypic and regulation analysis it was concluded that the dmeRF system is relevant for Ni(II) and specially Co(II) tolerance in both free living and symbiotic forms of the bacteria. This system is conserved in different Rhizobium species like a general mechanism for nickel and cobalt resistance. Other of the identified mutants (D4239) contains the transposon insert on a gene that encodes for an AraC-like transcriptional regulator. Although initially this mutant was identified for its nickel sensitivity, futher experiments demonstrated that its high metal sensitivity is due to its sensitivity to the TY medium, specifically for the tryptone. In other media the mutant is not affected specifically in their tolerance to metals. This mutant showed an unusual symbiotic phenotype, being ineffective in pea and effective in lentil. Complementation analysis and directed mutagenesis suggest that the mutation phenotype could depend of other factors different from the insertion minitransposon gene.

Functional characterization of Rhizobium leguminosarum bv. viciae DmeRF, a cation diffusion facilitator system involved in nickel and cobalt resistance

In prokaryotes, nickel is an essential element participating in the structure of enzymes involved in multiple cellular processes. Nickel transport is a challenge for microorganisms since, although essential, high levels of this metal inside the cell are toxic. For this reason, bacteria have developed high-affinity nickel transporters as well as nickel-specific detoxification systems. Ultramafic soils, and soils contaminated with heavy metals are excellent sources of nickel resistant bacteria. Molecular analysis of strains isolated in the habitats has revealed novel genetic systems involved in adaptation to such hostile conditions.

Respuesta transcripcional de Populus a bifenilos policlorados: Aspectos aplicados a la fitorremediación

La degradación del suelo ha adquirido una magnitud preocupante. Los métodos tradicionales de descontaminación, son costosos e insuficientes. La fitorremediación representa una alternativa eficaz, de bajo coste, respetuosa con el medio ambiente, que además mejora las propiedades del suelo, si bien ha habido desarrollos relevantes en la última década. Desde el punto de vida científico, el reto principal es descifrar las rutas metabólicas implicadas en respuesta a contaminantes y comprender su regulación. Esta información es imprescindible si aspiramos a mejorar las capacidades naturales de algunas especies vegetales para remediar los suelos contaminados. Los estudios de esta Tesis se han centrado en Populus, el mejor modelo forestal disponible a raíz de la secuenciación de su genoma completo. Por otra parte, Populus tiene una gran capacidad natural para la degradación de contaminantes orgánicos, lo que explica su predominio en los programas forestales de fitorremediación que se desarrollan actualmente. Hemos elegido en concreto al híbrido Populus tremula x P. alba, por la facilidad con que se cultiva y su particular interés biotecnológico. La presente Tesis plantea un estudio comprehensivo de la respuesta molecular a bifenilos policlorados (PCBs), una familia de contaminantes orgánicos persistentes de particular relevancia a escala mundial. Se ha utilizado para ello una aproximación transcriptómica, basada en tecnología RNA-seq, para identificar los genes implicados en el metabolismo de los compuestos in planta y cuantificar sus niveles de activación en distintas situaciones controladas. La tesis pretende asimismo definir el control transcripcional subyacente a la respuesta bioquímica frente a este tipo de contaminantes. Resulta sorprendente que dicha respuesta sea prácticamente desconocida a nivel molecular, a pesar de su gran potencial aplicado en el contexto de la tecnología fitorremediadora. Para desarrollar este proyecto aplicamos a nuestros cultivos de chopo híbridos concentraciones diferentes de Aroclor 1221, una mezcla de PCBs muy utilizada a nivel comercial durante décadas, su uso está prohibido hoy internacionalmente. Y tomamos muestras de RNA a dos concentraciones y dos momentos distintos de exposición al contaminante, generando así una matriz de cuatro elementos con sus controles correspondientes. Con el fin de incrementar la especificidad de nuestro análisis, consideramos sobre todo los genes diferencialmente expresados más significativos según cuatro algoritmos estadísticos distintos. Por otra parte, realizamos análisis funcionales con herramientas bioinformáticas basadas en comparaciones de secuencias y en redes de co-expresión génica. La respuesta de los genes de particular interés fue validada mediante tecnología qRT-PCR (reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa en tiempo real). Se trata del primer estudio comprehensivo de la respuesta de un organismo vegetal ante la presencia de PCBs. Este estudio nos ha permitido identificar una cantidad considerable de genes estructurales y reguladores, definiendo nuevos factores de transcripción cuya expresión es proporcional a la concentración de contaminante en el medio o al tiempo de exposición al mismo. Los análisis de correlación nos permiten afirmar en que la respuesta metabólica a PCBs, incluyendo posibles rutas degradadoras, participan en al menos quince factores de transcripción y unas cuarenta proteínas o enzimas que resultan particularmente inducidas. Entre las familias implicadas destacan los citocromos P450, la glutatión transferasas, las deshidrogenasas reductasas (short-chain dehydrogenase reductase) y las proteínas MDR (multi-drug resistance). Mientras que los factores de transcripción encontrados pertenecen a la familia de ZF-TF, MYBs, WRKYs entre otros. También identificamos proteínas de función desconocida que no se habían vinculado previamente a este tipo de respuestas en plantas, como la CSP (cold-shock domain proteins). Para estudiar su posible relación con la presencia de PCBs, se caracterizó un gen de esta familia detectado mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) a partir de mapas IEF x SDS-PAGE (isoelectro focusing x sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) de alta resolución. Mediante qRT-PCR pudimos confirmar la inducción del gen correspondiente, ortólogo a PtCSP4 de P. trichocarpa (Potri.004g172600), en respuesta a Aroclor 1221. El análisis fenotípico de las líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobre-expresaba la proteína CSP de chopo híbrido confirmó un papel para la misma tolerancia a PCBs, posiblemente a través de mecanismos reguladores que activan proteínas MDR. Este trabajo, además de aportar datos novedosos sobre los mecanismos moleculares desencadenados por la presencia de un PCB en Populus, utilizado aquí como sistema modelo. Con ello se demuestra el potencial de las especies arbóreas no solo como agentes descontaminantes, ya explotado comercialmente, sino también como fuente potencial de genes interesantes. Entre los genes identificados en esta Tesis hay candidatos evidentes a participar en mecanismos de tolerancia al estrés inducido por la contaminación y también rutas metabólicas degradadores de PCBs. Precisamente la posibilidad de degradar al contaminante confiere particular interés a este tipo de estudios frente a la fitorremediación de metales pesados y otros contaminantes elementales. La comparación de los datos generados en este estudio con estudios análogos que se realicen en el futuro con otras especies y xenobióticos, contribuirán a definir mejor la respuesta de las plantas ante la contaminación orgánica y mejorar su potencial descontaminante. ABSTRACT Soil degradation has acquired a disturbing magnitude. Traditional methods of decontamination are expensive and insufficient. Phytoremediation represent an effective alternative, low cost, respectful of the environment, that also improves soil properties, although there have been relevant developments in the last decade. From a life scientist, the challenge is to decipher the major metabolic pathways involved in response to pollutants and understand their regulation. This information is essential if we desire to enhance the natural abilities of some plant species to remediate contaminated soils. This thesis studies have focused on Populus, the best available forestry model following the sequencing of the entire genome. Moreover, Populus has a natural ability to degrade organic pollutants, which explains its predominance in phytoremediation forestry programs currently being developed. We have chosen specifically to hybrid Populus tremula x P. alba, the ease with which it is grown and its particular biotechnological interest. This thesis presents a comprehensive study of the molecular response to polychlorinated biphenyls (PCBs), a family of persistent organic pollutants of particular relevance worldwide. It has been used for a transcriptomic approach using RNA-seq technology, to identify genes involved in the metabolism of compounds in plant and quantify their levels of activation in different controlled situations. The thesis also aims to define the underlying transcriptional control the biochemical response to these pollutants. It is surprising that the response is virtually unknown at the molecular level, despite its great potential applied in the context of phytoremediation technology. To develop this project we applied our hybrid poplar crops different concentrations of Aroclor 1221, a mixture of PCBs widely used commercially for decades, its use is now banned internationally. And we RNA samples at two different concentrations and times of exposure to the pollutant, generating an array of four elements with their corresponding controls. In order to increase the specificity of our analysis, we consider mainly the most significant differentially expressed genes in four different statistical algorithms. Moreover, functional analyzes conducted with bioinformatics tools based on sequence comparisons and networks gene co-expression. The response of genes of particular interest was validated by qRT-PCR (polymerase reaction chain in real-time quantitative. This is the first comprehensive study of the response of a plant organism in the presence of PCBs. This study allowed us to identify a considerable amount of structural and regulatory genes, defining new transcription factors whose expression is proportional to the concentration of contaminant in the middle or at the time of exposure. Correlation analyzes allow us to affirm that the metabolic response to PCBs, including possible degradative pathways, at least fifteen involved in transcription factors and forty proteins or enzymes which are particularly induced. Among the families involved include cytochromes P450, the glutathione transferases, dehydrogenases reductases (short -chain dehydrogenase reductase) and MDR proteins (multi - drug resistance). While transcription factors belong to the family found ZF-TF, MYBs, WRKYs among others. We also identify proteins of unknown function that had not been previously linked to such responses in plants such as CSP (cold- shock domain proteins). To study their possible relationship with the presence of PCBs, a gene in this family was characterized and was detected by tandem mass spectrometry (MS/MS) from maps IEF x SDS -PAGE (sodium dodecyl isoelectro x sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) of high resolution. By qRT -PCR could confirm the induction of the corresponding gene, ortholog to PtCSP4 of P. trichocarpa (Potri.004g172600), in response to Aroclor 1221. Phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines over- expressing the protein CSP poplar hybrid confirmed a role for PCBs same tolerance, possibly through regulatory mechanisms activated MDR proteins. This work, in addition to providing new data on the molecular mechanisms triggered by the presence of PCBs in Populus, used here as a model system. Thus the potential of tree species not only as decontamination agents, and commercially exploited, but also as a potential source of interesting genes is shown. Among the genes identified in this thesis there are evident candidates to participate in tolerance mechanisms to stress induced by pollution and degrading metabolic pathways of PCBs. Precisely the possibility of degrading the pollutant attaches particular interest to this type of study off the phytoremediation of heavy metals and other elemental pollutants. The comparison of the data generated in this study with similar studies carried out in the future with other species and xenobiotics contribute to better define the response of plants to organic pollution and improve their decontamination potential.

Influencia de los fármacos presentes en el agua residual sobre la resistencia de la bacteria Escherichia coli y su eliminación por oxidación avanzada

Los fármacos en el agua han sido considerados en los últimos años un problema medioambiental grave, y se ha incrementado el interés por los efectos que pueden producirse en el medio acuático. Aunado a este problema se encuentra el consumo excesivo de medicamentos no controlados, los cuales pueden ser desechados sin tener el tratamiento adecuado; por lo que se ingresan a los cursos de agua. Estos contaminantes emergentes son compuestos cuyo vertido supone un problema sanitario y ambiental. Se trata de contaminantes solubles en agua por lo que son capaces de estar presentes en todas las etapas del ciclo del agua. Han sido numerosos estudios los que se han realizado en diferentes países, ya que su presencia se ha convertido en un tema emergente en la química del medio ambiente, debido a que en las investigaciones realizadas muestran que no hay una eliminación completa a pesar de los distintos procesos que se aplican en las plantas de tratamiento de aguas residuales. Esta contaminación, incrementa la necesidad de conocer cuál es el efecto toxicológico sobre los organismos acuáticos y, en consecuencia, en las personas. La bacteria Escherichia Coli, es un organismo muy estudiado, debido a que se encuentra en los intestinos de los animales y humanos y por lo consiguiente en las aguas negras. Teniendo en cuenta la crítica situación, se planteó estudiar el efecto sobre la bacteria E. coli de 4 fármacos: Atenolol, Azitromicina, Estradiol e Ibuprofeno, para conocer cual era su comportamiento y el efecto que podían producir la presencia de los fármacos en la eliminación por procesos de oxidación. Así también, los efectos producidos sobre E. Coli, después de estar en contacto con los fármacos 1, 3 y 7 días. Se observó que los fármacos tienen efectos en el aumento o eliminación de los microrganismos dependiendo de los tiempos de exposición y la concentración del fármaco. Así mismo se observó que los microorganismos asimilan mejor las concentraciones menores de fármacos, a tiempos de contacto mayores de 24 horas. Con todos los desinfectantes de estudio se observaron ligeras resistencias de la bacteria ante la presencia de los fármacos. Drugs in water have been considered in recent years a serious environmental problem, and has increased interest in the effects that may occur in the aquatic environment. Added to this problem is the excessive consumption of non-controlled drugs, which can be disposed of without proper treatment, so they enter waterways. These are compounds emerging contaminants being discharged is a health and environmental problem. It is water soluble contaminants and are therefore able to be present in all stages of the water cycle. There have been numerous studies conducted in different countries, since their presence has become an emerging issue in environmental chemistry, because in the research shows that there isn’t a removal despite the different processes used in wastewater treatment plants. This contamination, increases the need to know what is the toxicological effects on aquatic organisms and, consequently, in people. The bacterium Escherichia coli, is a well-studied organism because it is found in the intestines of animals and humans and is therefore in the wastewater. Given the critical situation, was proposed to study the effect on the bacterium E. coli of 4 drugs: Atenolol, Azithromycin, Estradiol and Ibuprofen, to know what his behavior and the effect it could produce the presence of drugs in the removal by oxidation processes. Also, the effects on E. Coli, after being in contact with the drug 1, 3 and 7 days. It was noted that the drugs have effects on the growth or elimination of microorganisms depending on exposure time and the drug concentration. Also it was observed that the microorganisms assimilate lower concentrations of drug better over 24 hours. With all disinfectants study were observed resistances of the bacteria in the presence of the drugs.