Function of C1A barley peptidases and their inhibitors (cystatins) in barley seed germination : Funcion de las peptidasas C1A de cebada y sus inhibidores (cistatinas) en la germinacion de la semilla

Plant proteolysis is a metabolic process where specific enzymes called peptidases degrade proteins. In plants, this complex process involves broad metabolic networks and different sub-cellular compartments. Several types of peptidases take part in the proteolytic process, mainly cysteine-, serine-, aspartyl- and metallo- peptidases. Among the cysteine-peptidases, the papain-like or C1A peptidases (family C1, clan CA) are extensively present in land plants and are classified into catepsins L-, B-, H- and Flike. The catalytic mechanism of these C1A peptidases is highly conserved and involves the three amino acids Cys, His and Asn in the catalytic triad, and a Gln residue which seems essential for maintaining an active enzyme conformation. These proteins are synthesized as inactive precursors, which comprise an N-terminal signal peptide, a propeptide, and the mature protein. In barley, we have identified 33 cysteine-peptidases from the papain-like family, classifying them into 8 different groups. Five of them corresponded to cathepsins L-like (5 subgroups), 1 cathepsin B-like group, 1 cathepsin F-like group and 1 cathepsin H-like group. Besides, C1A peptidases are the specific targets of the plant proteinaceous inhibitors known as phytocystatins (PhyCys). The cystatin inhibitory mechanism is produced by a tight and reversible interaction with their target enzymes. In barley, the cystatin gene family is comprised by 13 members. In this work we have tried to elucidate the role of the C1A cysteine-peptidases and their specific inhibitors (cystatins) in the germination process of the barley grain. Therefore, we selected a representative member of each group/subgroup of C1A peptidases (1 cathepsin B-like, 1 cathepsin F-like, 1 cathepsin H-like and 5 cathepsins L-like). The molecular characterization of the cysteine-peptidases was done and the peptidase-inhibitor interaction was analyzed in vitro and in vivo. A study in the structural basis for specificity of pro-peptide/enzyme interaction in barley C1A cysteine-peptidases has been also carried out by inhibitory assays and the modeling of the three-dimensional structures. The barley grain maturation produces the accumulation of storage proteins (prolamins) in the endosperm which are mobilized during germination to supply the required nutrients until the photosynthesis is fully established. In this work, we have demonstrated the participation of the cysteine-peptidases and their inhibitors in the degradation of the different storage protein fractions (hordeins, albumins and globulins) present in the barley grain. Besides, transgenic barley plants overexpressing or silencing cysteine-peptidases or cystatins were obtained by Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos to analyze their physiological function in vivo. Preliminary assays were carried out with the T1 grains of several transgenic lines. Comparing the knock-out and the overexpressing lines with the WT, alterations in the germination process were detected and were correlated with their grain hordein content. These data will be validated with the homozygous grains that are being produced through the double haploid technique by microspore culture. Resumen La proteólisis es un proceso metabólico por el cual se lleva a cabo la degradación de las proteínas de un organismo a través de enzimas específicas llamadas proteasas. En plantas, este complejo proceso comprende un entramado de rutas metabólicas que implican, además, diferentes compartimentos subcelulares. En la proteólisis participan numerosas proteasas, principalmente cisteín-, serín-, aspartil-, y metalo-proteasas. Dentro de las cisteín-proteasas, las proteasas tipo papaína o C1A (familia C1, clan CA) están extensamente representadas en plantas terrestres, y se clasifican en catepsinas tipo L, B, H y F. El mecanismo catalítico de estas proteasas está altamente conservado y la triada catalítica formada por los aminoácidos Cys, His y Asn, y a un aminoácido Gln, que parece esencial para el mantenimiento de la conformación activa de la proteína. Las proteasas C1A se sintetizan como precursores inactivos y comprenden un péptido señal en el extremo N-terminal, un pro-péptido y la proteína madura. En cebada hemos identificado 33 cisteín-proteasas de tipo papaína y las hemos clasificado filogenéticamente en 8 grupos diferentes. Cinco de ellos pertenecen a las catepsinas tipo L (5 subgrupos), un grupo a las catepsinas tipo-B, otro a las catepsinas tipo-F y un último a las catepsinas tipo-H. Las proteasas C1A son además las dianas específicas de los inhibidores protéicos de plantas denominados fitocistatinas. El mecanismo de inhibición de las cistatinas está basado en una fuerte interacción reversible. En cebada, se conoce la familia génica completa de las cistatinas, que está formada por 13 miembros. En el presente trabajo se ha investigado el papel de las cisteín-proteasas de cebada y sus inhibidores específicos en el proceso de la germinación de la semilla. Para ello, se seleccionó una proteasa representante de cada grupo/subgrupo (1 catepsina tipo- B, 1 tipo-F, 1 tipo-H, y 5 tipo-L, una por cada subgrupo). Se ha llevado a cabo su caracterización molecular y se ha analizado la interacción enzima-inhibidor tanto in vivo como in vitro. También se han realizado estudios sobre las bases estructurales que demuestran la especificidad en la interacción enzima/propéptido en las proteasas C1A de cebada, mediante ensayos de inhibición y la predicción de modelos estructurales de la interacción. Finalmente, y dado que durante la maduración de la semilla se almacenan proteínas de reserva (prolaminas) en el endospermo que son movilizadas durante la germinación para suministrar los nutrientes necesarios hasta que la nueva planta pueda realizar la fotosíntesis, en este trabajo se ha demostrado la participación de las cisteínproteasas y sus inhibidores en la degradación de las diferentes tipos de proteínas de reserva (hordeinas, albúmins y globulinas) presentes en el grano de cebada. Además, se han obtenido plantas transgénicas de cebada que sobre-expresan o silencian cistatinas y cisteín-proteasas con el fin de analizar la función fisiológica in vivo. Se han realizado análisis preliminares en las semillas T1 de varias líneas tránsgenicas de cebada y al comparar las líneas knock-out y las líneas de sobre-expresión con las silvestres, se han detectado alteraciones en la germinación que están además correlacionadas con el contenido de hordeinas de las semillas. Estos datos serán validados en las semillas homocigotas que se están generando mediante la técnica de dobles haploides a partir del cultivo de microesporas.

Cartografía de QTL asociados a la tolerancia a estrés hídrico en frijol común (Phaseolus vulgaris L.)

Phaseolus vulgaris L. (frijol común o judía) es una leguminosa de gran demanda para la nutrición humana y un producto agrícola muy importante. Sin embargo, la producción de frijol se ve limitada por presiones ambientales como la sequía. En México, el 85% de la cosecha de frijol se produce en la temporada de primavera-verano, principalmente en las regiones del altiplano semiárido con una precipitación anual entre 250 y 400 mm. A pesar del implemento de tecnología en el campo, los factores naturales impiden al agricultor llegar a los rendimientos deseados. El Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), como instituto de investigación gubernamental en México, tiene como objetivo la mejora de cultivos estratégicos, uno de ellos, P. vulgaris. Los estudios en relación a la sequía se enfocan especialmente en la selección de genotipos tolerantes, los cuales son sometidos en condiciones de estrés y monitoreando parámetros como el rendimiento y peso de semilla, además de algunos indicadores tales como índice de cosecha. El resultado de estos trabajos ha sido la obtención de variedades con mayor tolerancia a la sequía, tales como Pinto Villa y Pinto Saltillo. En los últimos años se ha avanzado notablemente en el conocimiento de las bases moleculares en las respuestas de las plantas al estrés. De acuerdo a diversos estudios se ha demostrado que las plantas bajo estrés por sequía experimentan cambios en la expresión de genes involucrados en la señalización, regulación de la transcripción y la traducción, transporte de agua y la función directa en la protección celular. También se ha observado que el déficit de agua es causado por las temperaturas extremas y la alta concentración de sales, por lo que al nivel molecular, las respuestas al estrés tienen puntos de especificidad y puntos de entrecruzamiento. La sequía puede generar estreses secundarios, tales como el nutricional, oxidativo y osmótico. Sin embargo, es necesario identificar y caracterizar muchos de los componentes involucrados en las respuestas al déficit hídrico, la caracterización de estos genes permitirá tener una mejor comprensión de los mecanismos bioquímicos y fisiológicos involucrados en la tolerancia al estrés. Actualmente, con el apoyo de la biología molecular se han identificado algunos genes que otorgan ventajas para la adaptación a ambientes desfavorables. Por lo que el objetivo del presente trabajo es identificar marcadores genéticos asociados a rasgos fenotípicos con énfasis a la tolerancia a estrés hídrico en P. vulgaris. Una vez establecidos los marcadores asociados al estrés hídrico, es factible considerar su uso para la selección asistida por marcadores en líneas o variedades de frijol de interés para los mejoradores. Se evaluaron 282 familias F3:5 derivadas de la cruza entre los cultivares Pinto Villa y Pinto Saltillo. Las familias se sembraron bajo un diseño simple de látice 17x17, el experimento se llevo acabo en el ciclo primavera-verano del 2010 y 2011, y otoñoinvierno de 2010 en el Campo Experimental Bajío del INIFAP con dos repeticiones para cada tratamiento de humedad (riego completo y sequía terminal). En todos los genotipos se realizó el fenotipado (variables fenotípicas) y el genotipado a través de marcadores moleculares. Los análisis estadísticos se basaron en el análisis de componentes principales (Eigen Analysis Selection Index Method, ESIM), la asociación entre marcadores SNP y el fenotipado (paquete SNPassoc para R) y el análisis de varianza (ANOVA). Los valores ESIM mostraron que las variables de Rendimiento, Días a floración, Días a madurez fisiológica e Índice de cosecha fueron sobresalientes en sequía terminal, por lo que se sugieren tomarse en consideración para los estudios de sequía en P. vulgaris como monitores de evaluación a la resistencia. Se identificaron nueve familias sobresalieron por sus valores ESIM (PV/PS6, 22, 131, 137, 149, 154, 201, 236 y 273), además de presentar valores superiores para el rendimiento en comparación con los parentales. Estos genotipos son candidatos interesantes para realizar estudios de identificación de loci asociados con la respuesta al estrés, y como potenciales parentales en el desarrollo de nuevas variedades de frijol. En los análisis de asociación SNPassoc se identificaron 83 SNPs significativos (p<0,0003) asociados a los rasgos fenotípicos, obteniendo un total de 222 asociaciones, de las cuales predomina el modelo genético de codominancia para las variables Días a floración, Periodo reproductivo y Biomasa total. Treinta y siete SNPs se identificaron a diferentes funciones biológicas a través del análisis de anotación funcional, de los cuales 12 SNPs (9, 18, 28, 39, 61, 69, 80, 106, 115, 128, 136 y 142) sobresalen por su asociación al fenotipado, y cuya anotación funcional indica que se encuentran en genes relacionados a la tolerancia a la sequía, tales como la actividad kinasa, actividad metabólica del almidón, carbohidratos y prolina, respuesta al estrés oxidativo, así como en los genes LEA y posibles factores de transcripción. En el caso de los análisis ANOVA, se identificaron 72 asociaciones entre los SNPs y las variables fenotípicas (F< 3,94E-04). Las 72 asociaciones corresponden a 30 SNPs y 7 variables fenotípicas, de las que predomina Peso de 100 semillas y Periodo reproductivo. Para los rasgos de Rendimiento, Índice de cosecha y Días a madurez fisiológica se presentaron asociaciones con seis SNPs (17, 34, 37, 50, 93 y 107), de los cuales, a los SNP37 y SNP107 fueron identificados a la anotación biológica de protein binding. Por otro lado, los SNP106 y SNP128 asociados al Periodo reproductivo, son genes con actividad kinasa y actividad metabólica del almidón, respectivamente. Para los marcadores tipo AFLP, se identificaron 271 asociaciones (F<2,34E-04). Las asociaciones corresponden a 86 AFLPs con todas las variables fenotípicas evaluadas, de las que predomina peso de 100 semillas, Días a floración y Periodo reproductivo. Debido a que los en los AFLPs no es posible determinar su anotación biológica, se proponen como marcadores potenciales relacionados a la resistencia a la sequía en frijol. Los AFLPs candidatos requieren más estudios tales como la secuenciación de los alelos respectivos, así como la identificación de éstas secuencias en el genoma de referencia y su anotación biológica, entre otros análisis, de esta manera podríamos establecer aquellos marcadores candidatos a la validación para la selección asistida. El presente trabajo propone tanto genotipos como marcadores genéticos, que deben ser validados para ser utilizados en el programa de mejoramiento de P. vulgaris, con el objetivo de desarrollar nuevas líneas o variedades tolerantes a la sequía. ABSTRACT Phaseolus vulgaris L. (common bean or judia) is a legume of great demand for human consumption and an important agricultural product. However, the common bean production is limited by environmental stresses, such as drought. In Mexico, 85% of the common bean crop is produced in the spring-summer season mainly in semiarid highland regions with a rainfall between 250 and 400 mm per year. In spite of the improvement of crop technology, the natural factors hamper getting an optimal yield. The National Institute for Forestry, Agriculture and Livestock (INIFAP) is a government research institute from Mexico, whose main objective is the genetic breeding of strategic crops, like P. vulgaris L. The drought tolerance studies particularly focus on the selection of bean tolerant genotypes, which are subjected to stress conditions, by means of monitoring parameters such as yield and seed weight, plus some agronomic indicators such as harvest index. The results of these works have led to obtain cultivars with higher drought tolerance such as Pinto Villa and Pinto Saltillo. Significant achievements have been recently made in understanding the molecular basis of stress plant responses. Several studies have shown that plants under drought stress present changes in gene expression related to cell signalling, transcriptional and translational regulation, water transport and cell protection. In addition, it has been observed that the extreme temperatures and high salt concentrations can cause a water deficiency so, at the molecular level, stress responses have specific and crossover points. The drought can cause secondary stresses, such as nutritional, oxidative and osmotic stress. It is required the identification of more components involved in the response to water deficit, the characterization of these genes will allow a better understanding of the biochemical and physiological mechanisms involved in stress tolerance. Currently, with the support of molecular biology techniques, some genes that confer an advantage for the crop adaptation to unfavourable environments have been identified. The objective of this study is to identify genetic markers associated with phenotypic traits with emphasis on water stress tolerance in P. vulgaris. The establishment of molecular markers linked to drought tolerance would make possible their use for marker-assisted selection in bean breeding programs. Two hundred and eighty two F3:5 families derived from a cross between the drought resistant cultivars Pinto Villa and Pinto Saltillo were evaluated. The families were sowed under a 17x17 simple lattice design. The experiment was conducted between spring-summer seasons in 2010 and 2011, and autumn-winter seasons in 2010 at the Bajio Experimental Station of INIFAP with two treatments (full irrigation and terminal drought). All families were phenotyped and genotyped using molecular markers. Statistical analysis was based on principal component analysis (Eigen Analysis Selection Index Method, ESIM), association analysis between SNP markers and phenotype (SNPassoc package R) and analysis of variance (ANOVA). The ESIM values showed that seed yield, days to flowering, days to physiological maturity and harvest index were outstanding traits in terminal drought treatment, so they could be considered as suitable parameters for drought-tolerance evaluation in P. vulgaris. Nine outstanding families for the ESIM values were identified (PV/PS6, 22, 131, 137, 149, 154, 201, 236 and 273), in addition, these families showed higher values for seed yield compared to the parental cultivars. These families are promising candidates for studies focused on the identification of loci associated to the stress response, and as potential parental cultivars for the development of new varieties of common bean. In the SNPassoc analysis, 83 SNPs were found significantly associated (p<0.0003) with phenotypic traits, obtaining a total of 222 associations, most of which involved the traits days to flowering, reproductive period and total biomass under a codominant genetic model. The functional annotation analysis showed 37 SNPs with different biological functions, 12 of them (9, 18, 28, 39, 61, 69, 80, 106, 115, 128, 136 and 142) stand out by their association to phenotype. The functional annotation suggested a connection with genes related to drought tolerance, such as kinase activity, starch, carbohydrates and proline metabolic processes, responses to oxidative stress, as well as LEA genes and putative transcription factors. In the ANOVA analysis, 72 associations between SNPs and phenotypic traits (F<3.94E- 04) were identified. All of these associations corresponded to 30 SNPs markers and seven phenotypic traits. Weight of 100 seeds and reproductive period were the traits with more associations. Seed yield, harvest index and days to physiological maturity were associated to six SNPs (17, 34, 37, 50, 93 and 107), the SNP37 and SNP107 were identified as located in protein binding genes. The SNP106 and SNP128 were associated with the reproductive period and belonged to genes with kinase activity and genes related to starch metabolic process, respectively. In the case of AFLP markers, 271 associations (F<2.34E-04) were identified. The associations involved 86 AFLPs and all phenotypic traits, being the most frequently associated weight of 100 seeds, days to flowering and reproductive period. Even though it is not possible to perform a functional annotation for AFLP markers, they are proposed as potential markers related to drought resistance in common bean. AFLPs candidates require additional studies such as the sequencing of the respective alleles, identification of these sequences in the reference genome and gene annotation, before their use in marker assisted selection. This work, although requires further validation, proposes both genotypes and genetic markers that could be used in breeding programs of P. vulgaris in order to develop new lines or cultivars with enhanced drought-tolerance.