Respuesta transcripcional de Populus a bifenilos policlorados: Aspectos aplicados a la fitorremediación

La degradación del suelo ha adquirido una magnitud preocupante. Los métodos tradicionales de descontaminación, son costosos e insuficientes. La fitorremediación representa una alternativa eficaz, de bajo coste, respetuosa con el medio ambiente, que además mejora las propiedades del suelo, si bien ha habido desarrollos relevantes en la última década. Desde el punto de vida científico, el reto principal es descifrar las rutas metabólicas implicadas en respuesta a contaminantes y comprender su regulación. Esta información es imprescindible si aspiramos a mejorar las capacidades naturales de algunas especies vegetales para remediar los suelos contaminados. Los estudios de esta Tesis se han centrado en Populus, el mejor modelo forestal disponible a raíz de la secuenciación de su genoma completo. Por otra parte, Populus tiene una gran capacidad natural para la degradación de contaminantes orgánicos, lo que explica su predominio en los programas forestales de fitorremediación que se desarrollan actualmente. Hemos elegido en concreto al híbrido Populus tremula x P. alba, por la facilidad con que se cultiva y su particular interés biotecnológico. La presente Tesis plantea un estudio comprehensivo de la respuesta molecular a bifenilos policlorados (PCBs), una familia de contaminantes orgánicos persistentes de particular relevancia a escala mundial. Se ha utilizado para ello una aproximación transcriptómica, basada en tecnología RNA-seq, para identificar los genes implicados en el metabolismo de los compuestos in planta y cuantificar sus niveles de activación en distintas situaciones controladas. La tesis pretende asimismo definir el control transcripcional subyacente a la respuesta bioquímica frente a este tipo de contaminantes. Resulta sorprendente que dicha respuesta sea prácticamente desconocida a nivel molecular, a pesar de su gran potencial aplicado en el contexto de la tecnología fitorremediadora. Para desarrollar este proyecto aplicamos a nuestros cultivos de chopo híbridos concentraciones diferentes de Aroclor 1221, una mezcla de PCBs muy utilizada a nivel comercial durante décadas, su uso está prohibido hoy internacionalmente. Y tomamos muestras de RNA a dos concentraciones y dos momentos distintos de exposición al contaminante, generando así una matriz de cuatro elementos con sus controles correspondientes. Con el fin de incrementar la especificidad de nuestro análisis, consideramos sobre todo los genes diferencialmente expresados más significativos según cuatro algoritmos estadísticos distintos. Por otra parte, realizamos análisis funcionales con herramientas bioinformáticas basadas en comparaciones de secuencias y en redes de co-expresión génica. La respuesta de los genes de particular interés fue validada mediante tecnología qRT-PCR (reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa en tiempo real). Se trata del primer estudio comprehensivo de la respuesta de un organismo vegetal ante la presencia de PCBs. Este estudio nos ha permitido identificar una cantidad considerable de genes estructurales y reguladores, definiendo nuevos factores de transcripción cuya expresión es proporcional a la concentración de contaminante en el medio o al tiempo de exposición al mismo. Los análisis de correlación nos permiten afirmar en que la respuesta metabólica a PCBs, incluyendo posibles rutas degradadoras, participan en al menos quince factores de transcripción y unas cuarenta proteínas o enzimas que resultan particularmente inducidas. Entre las familias implicadas destacan los citocromos P450, la glutatión transferasas, las deshidrogenasas reductasas (short-chain dehydrogenase reductase) y las proteínas MDR (multi-drug resistance). Mientras que los factores de transcripción encontrados pertenecen a la familia de ZF-TF, MYBs, WRKYs entre otros. También identificamos proteínas de función desconocida que no se habían vinculado previamente a este tipo de respuestas en plantas, como la CSP (cold-shock domain proteins). Para estudiar su posible relación con la presencia de PCBs, se caracterizó un gen de esta familia detectado mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) a partir de mapas IEF x SDS-PAGE (isoelectro focusing x sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) de alta resolución. Mediante qRT-PCR pudimos confirmar la inducción del gen correspondiente, ortólogo a PtCSP4 de P. trichocarpa (Potri.004g172600), en respuesta a Aroclor 1221. El análisis fenotípico de las líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobre-expresaba la proteína CSP de chopo híbrido confirmó un papel para la misma tolerancia a PCBs, posiblemente a través de mecanismos reguladores que activan proteínas MDR. Este trabajo, además de aportar datos novedosos sobre los mecanismos moleculares desencadenados por la presencia de un PCB en Populus, utilizado aquí como sistema modelo. Con ello se demuestra el potencial de las especies arbóreas no solo como agentes descontaminantes, ya explotado comercialmente, sino también como fuente potencial de genes interesantes. Entre los genes identificados en esta Tesis hay candidatos evidentes a participar en mecanismos de tolerancia al estrés inducido por la contaminación y también rutas metabólicas degradadores de PCBs. Precisamente la posibilidad de degradar al contaminante confiere particular interés a este tipo de estudios frente a la fitorremediación de metales pesados y otros contaminantes elementales. La comparación de los datos generados en este estudio con estudios análogos que se realicen en el futuro con otras especies y xenobióticos, contribuirán a definir mejor la respuesta de las plantas ante la contaminación orgánica y mejorar su potencial descontaminante. ABSTRACT Soil degradation has acquired a disturbing magnitude. Traditional methods of decontamination are expensive and insufficient. Phytoremediation represent an effective alternative, low cost, respectful of the environment, that also improves soil properties, although there have been relevant developments in the last decade. From a life scientist, the challenge is to decipher the major metabolic pathways involved in response to pollutants and understand their regulation. This information is essential if we desire to enhance the natural abilities of some plant species to remediate contaminated soils. This thesis studies have focused on Populus, the best available forestry model following the sequencing of the entire genome. Moreover, Populus has a natural ability to degrade organic pollutants, which explains its predominance in phytoremediation forestry programs currently being developed. We have chosen specifically to hybrid Populus tremula x P. alba, the ease with which it is grown and its particular biotechnological interest. This thesis presents a comprehensive study of the molecular response to polychlorinated biphenyls (PCBs), a family of persistent organic pollutants of particular relevance worldwide. It has been used for a transcriptomic approach using RNA-seq technology, to identify genes involved in the metabolism of compounds in plant and quantify their levels of activation in different controlled situations. The thesis also aims to define the underlying transcriptional control the biochemical response to these pollutants. It is surprising that the response is virtually unknown at the molecular level, despite its great potential applied in the context of phytoremediation technology. To develop this project we applied our hybrid poplar crops different concentrations of Aroclor 1221, a mixture of PCBs widely used commercially for decades, its use is now banned internationally. And we RNA samples at two different concentrations and times of exposure to the pollutant, generating an array of four elements with their corresponding controls. In order to increase the specificity of our analysis, we consider mainly the most significant differentially expressed genes in four different statistical algorithms. Moreover, functional analyzes conducted with bioinformatics tools based on sequence comparisons and networks gene co-expression. The response of genes of particular interest was validated by qRT-PCR (polymerase reaction chain in real-time quantitative. This is the first comprehensive study of the response of a plant organism in the presence of PCBs. This study allowed us to identify a considerable amount of structural and regulatory genes, defining new transcription factors whose expression is proportional to the concentration of contaminant in the middle or at the time of exposure. Correlation analyzes allow us to affirm that the metabolic response to PCBs, including possible degradative pathways, at least fifteen involved in transcription factors and forty proteins or enzymes which are particularly induced. Among the families involved include cytochromes P450, the glutathione transferases, dehydrogenases reductases (short -chain dehydrogenase reductase) and MDR proteins (multi - drug resistance). While transcription factors belong to the family found ZF-TF, MYBs, WRKYs among others. We also identify proteins of unknown function that had not been previously linked to such responses in plants such as CSP (cold- shock domain proteins). To study their possible relationship with the presence of PCBs, a gene in this family was characterized and was detected by tandem mass spectrometry (MS/MS) from maps IEF x SDS -PAGE (sodium dodecyl isoelectro x sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) of high resolution. By qRT -PCR could confirm the induction of the corresponding gene, ortholog to PtCSP4 of P. trichocarpa (Potri.004g172600), in response to Aroclor 1221. Phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines over- expressing the protein CSP poplar hybrid confirmed a role for PCBs same tolerance, possibly through regulatory mechanisms activated MDR proteins. This work, in addition to providing new data on the molecular mechanisms triggered by the presence of PCBs in Populus, used here as a model system. Thus the potential of tree species not only as decontamination agents, and commercially exploited, but also as a potential source of interesting genes is shown. Among the genes identified in this thesis there are evident candidates to participate in tolerance mechanisms to stress induced by pollution and degrading metabolic pathways of PCBs. Precisely the possibility of degrading the pollutant attaches particular interest to this type of study off the phytoremediation of heavy metals and other elemental pollutants. The comparison of the data generated in this study with similar studies carried out in the future with other species and xenobiotics contribute to better define the response of plants to organic pollution and improve their decontamination potential.