Identificación y caracterización de la ruta mediada por la proteína G heterotrimérica de Arabidopsis thaliana en la respuesta inmune

La resistencia de las plantas a los hongos necrótrofos como Plectosphaerella cucumerina es genéticamente compleja y depende de la activación coordinada de distintas rutas de señalización (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Entre éstas se encuentran las mediadas por la proteína G heterotrimérica, un complejo formado por tres subunidades (Gα, Gβ y Gγ) que regula tanto la respuesta de inmunidad a diferentes patógenos como distintos procesos de desarrollo (Temple and Jones, 2007). En esta Tesis hemos demostrado que, en Arabidopsis, el monómero funcional formado por las subunidades Gβ y Gγ1/Gγ2 es el responsable de la regulación de la respuesta de defensa, ya que mutantes nulos en estas subunidades (agb1 y agg1 agg2) presentan una alta susceptibilidad al hongo P. cucumerina. Además, hemos identificado varios aminoácidos (Q102, T188 y R235) de la proteína AGB1 esenciales en la interacción con los efectores correspondientes para la regulación de la respuesta inmune (Jiang et al, enviado). Para determinar las bases moleculares de la resistencia mediada por la proteína G heterotrimérica, llevamos a cabo un análisis transcriptómico comparativo entre los genotipos agb1 y Col-0, el cual reveló que la resistencia mediada por AGB1 no depende de rutas defensivas implicadas en la resistencia a hongos necrotrofos, como las mediadas por el ácido salicílico (SA), etileno (ET), jasmónico (JA) o ácido abscísico (ABA), o la ruta de biosíntesis de metabolitos derivados del triptófano. Este estudio mostró que un número significativo de los genes desregulados en respuesta a P. cucumerina en el genotipo agb1 respecto a las plantas silvestres codificaban proteínas con funciones relacionadas con la pared celular. La evaluación de la composición y estructura de la pared de los mutantes de las subunidades de la proteína G heterotrimérica reveló que los genotipos agb1 y agg1 agg2 presentaban alteraciones similares diferentes de las observadas en plantas silvestres Col-0, como una reducción significativa en el contenido de xilosa en la pared. Estos datos sugieren que la proteína G heterotrimérica puede modular la composición/estructura de la pared celular y contribuir, de esta manera, en la regulación de la respuesta inmune (Delgado- Cerezo et al, 2011). La caracterización del interactoma de la proteína G heterotrimérica corroboró la relevancia funcional que presenta en la regulación de la pared celular, ya que un número significativo de las interacciones identificadas estaban comprendidas por proteínas relacionadas directa o indirectamente con la biogénesis y remodelación de la pared celular (Klopffleisch et al, 2011). El papel en inmunidad de algunos de estos potenciales efectores ha sido validado mediante el análisis de la resistencia a P. cucumerina de los mutantes de pérdida de función correspondientes. Con el objetivo de caracterizar las rutas de señalización mediadas por AGB1 e identificar efectores implicados en esta señalización, llevamos a cabo una búsqueda de mutantes supresores de la susceptibilidad de agb1 a P. cucumerina, identificándose varios mutantes sgb (supressor of Gbeta). En esta Tesis hemos caracterizado en detalle el mutante sgb10, que presenta una activación constitutiva de las rutas de señalización mediadas por SA y JA+ET y suprime el fenotipo de susceptibilidad de agb1. SGB10 y AGB1 forman parte de rutas independientes en la regulación de la respuesta inmune, mientras que interaccionan de forma compleja en el control de determinados procesos de desarrollo. La mutación sgb10 ha sido cartografiada entre los genes At3g55010 y At3g56408, que incluye una región con 160 genes. ABSTRACT Plant resistance to necrotrophic fungi Plectosphaerella cucumerina is genetically complex and depends on the interplay of different signalling pathways (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Among others, the heterotrimeric G protein complex has a relevant role. The G protein that is formed by three subunits (Gα, Gβ and Gγ) is a pleiotropic regulator of immune responses to different types of pathogens and developmental issues (Temple and Jones, 2007). Throughout the Thesis, we have demonstrated that Arabidopsis’ functional monomer formed by the Gβ and Gγ1/Gγ2 subunits is a key regulator of defense response, as null mutants (agb1 and agg1 agg2) are equally hypersusceptible to P. cucumerina infection. In addition we have identified several AGB1 aminoacids (Q102, T188 y R235) essentials to interact with specific effectors during the regulation of immune response (Jiang et al, sent).To determine the molecular basis of heterotrimeric G protein mediated resistance we have performed a microarray analysis with agb1-1 and wild type Col-0 plants before and after P. cucumerina challenge. A deep and exhaustive comparative transcriptomical analysis of these plants revealed that AGB1 mediated resistance does not rely on salicilic acid (SA), ethylene (ET), jasmonates (JA), abscisic acid (ABA) or triptophan derived metabolites biosynthesis. However the analysis revealed that a significant number of cell wall related genes are misregulated in the agb1 mutant after pathogen challenge when compared to wild-type plants. The analysis of cell wall composition and structure showed similar cell wall alterations between agb1 and agg1 agg2 mutants that are different from those of wild-type plants, so far the mutants present a significant reduction in xylose levels. All these results suggest that heterotrimeric G protein may regulate immune response through modifications in the cell wall composition/structure (Delgado-Cerezo et al, 2011). The characterization of Heterotrimeric G protein interactome revealed highly connected interactions between the G-protein core and proteins involved in cell wall composition or structure (Klopffleisch et al, 2011). To test the role in immunity of several effectors identified above, we have performed resistance analysis of corresponding null mutants against P. cucumerina. In order to characterize AGB1 mediated signalling pathway and identify additional effectors involved in AGB1-mediated immune response against P. cucumerina, we have performed a screening to isolate mutants with suppression of agb1 phenotype. One of the mutants, named sgb10, has been characterized during the Thesis. The mutant shows constitutive expression of SA, JA+ET-mediated defense signaling pathways to suppres agb1 hypersusceptibility. SGB10 and AGB1 proteins seem to be part of independent pathways in immunity, however its function during development remains unclear. At present, we have mapped the sgb10 mutation between At3g55010 and At3g56408 genes. This region contains 160 genes.

CRYPT4YOU y la utilidad de los MOOCs en la formación online en lengua española.

En los últimos dos años la formación online ha experimentado un auge significativo gracias al paradigma de formación denominado MOOC (Massive Open Online Course). Un MOOC simplifica la formación a distancia gracias a sus características de abierto, colaborativo, masivo y gratuito. Por desgracia en lengua española la utilización de este tipo de recurso formativo todavía es minoritaria. La presente investigación recoge una experiencia de innovación educativa en la que se destaca el diseño, implementación y difusión del primer MOOC en lengua española dedicado a la seguridad de la información por parte de la Universidad Politécnica de Madrid. Esta experiencia aborda las ventajas e inconvenientes de este tipo de recurso formativo, debatiendo aspectos vitales para la elaboración prolongada de cursos tipo MOOC, como son la interactividad y retroalimentación con los usuarios del curso o la forma más adecuada de representar el contenido docente. Todas estas cuestiones reciben respuesta en el MOOC Crypt4you, que con más de 10 meses de vida permite vislumbrar un gran éxito de este tipo de cursos en la formación, al menos en lengua española, de hispanohablantes. ABSTRACT In the last two years, online training has boomed thanks to significant training paradigm called MOOC (Massive Open Online Course). A MOOC simplifies remote training thanks to its open, collaborativend free mass features. Unfortunately, the use of this kind of learning resource in Spanish teaching is still a minority. This research includes an educational experience which emphasizes the design, implementation and dissemination of the first Spanish-language MOOC devoted to information security by the Technical University of Madrid. This experiment addresses the advantages and disadvantages of this kind of learning resource discussing critical issues for developing type MOOC prolonged courses, such as interactivity and feedback from users of the course or the most appropriate way of representing the educational content. All these questions are answered in the MOOC Crypt4you which, over its 10 months of life, can glimpse a great success of this type of training course, at least in Spanish, Spanish-speakers.

Caracterización de la necrosis sistémica inducida por la interacción sinérgica entre el Virus X de la patata y potyvirus en Nicotiana benthamiana

Los virus de plantas pueden causar enfermedades severas que conllevan serias pérdidas económicas a nivel mundial. Además, en la naturaleza son comunes las infecciones simultáneas con distintos virus que conducen a la exacerbación de los síntomas de enfermedad, fenómeno al que se conoce como sinergismo viral. Una de las sintomatologías más severas causadas por los virus en plantas susceptibles es la necrosis sistémica (NS), que incluso puede conducir a la muerte del huésped. Este fenotipo ha sido comparado en ocasiones con la respuesta de resistencia de tipo HR, permitiendo establecer una serie de paralelismos entre ambos tipos de respuesta que sugieren que la NS producida en interacciones compatibles sería el resultado de una respuesta hipersensible sistémica (SHR). Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de la NS, su relación con procesos de defensa antiviral o su relevancia biológica aún no son bien entendidos, al igual que tampoco han sido estudiados los cambios producidos en la planta a escala genómica en infecciones múltiples que muestran sinergismo en patología. En esta tesis doctoral se han empleado distintas aproximaciones de análisis de expresión génica, junto con otras técnicas genéticas y bioquímicas, en el sistema modelo de Nicotiana benthamiana para estudiar la NS producida por la infección sinérgica entre el Virus X de la patata (PVX) y diversos potyvirus. Se han comparado los cambios producidos en el huésped a nivel genómico y fisiológico entre la infección doble con PVX y el Virus Y de la patata (PVY), y las infecciones simples con PVX o PVY. Además, los cambios transcriptómicos y hormonales asociados a la infección con la quimera viral PVX/HC‐Pro, que reproduce los síntomas del sinergismo entre PVX‐potyvirus, se han comparado con aquellos producidos por otros dos tipos de muerte celular, la PCD ligada a una interacción incompatible y la PCD producida por la disfunción del proteasoma. Por último, técnicas de genética reversa han permitido conocer la implicación de factores del huésped, como las oxilipinas, en el desarrollo de la NS asociada al sinergismo entre PVXpotyvirus. Los resultados revelan que, respecto a las infecciones con solo uno de los virus, la infección doble con PVX‐PVY produce en el huésped diferencias cualitativas además de cuantitativas en el perfil transcriptómico relacionado con el metabolismo primario. Otros cambios en la expresión génica, que reflejan la activación de mecanismos de defensa, correlacionan con un fuerte estrés oxidativo en las plantas doblemente infectadas que no se detecta en las infecciones simples. Además, medidas en la acumulación de determinados miRNAs implicados en diversos procesos celulares muestran como la infección doble altera de manera diferencial tanto la acumulación de estos miRNAs como su funcionalidad, lo cual podría estar relacionado con los cambios en el transcriptoma, así como con la sintomatología de la infección. La comparación a nivel transcriptómico y hormonal entre la NS producida por PVX/HC‐Pro y la interacción incompatible del Virus del mosaico del tabaco en plantas que expresan el gen N de resistencia (SHR), muestra que la respuesta en la interacción compatible es similar a la que se produce durante la SHR, si bien se presenta de manera retardada en el tiempo. Sin embargo, los perfiles de expresión de genes de defensa y de respuesta a hormonas, así como la acumulación relativa de ácido salicílico (SA), ácido jasmonico (JA) y ácido abscísico, en la interacción compatible son más semejantes a la respuesta PCD producida por la disfunción del proteasoma que a la interacción incompatible. Estos datos sugieren una contribución de la interferencia sobre la funcionalidad del proteasoma en el incremento de la patogenicidad, observado en el sinergismo PVX‐potyvirus. Por último, los resultados obtenidos al disminuir la expresión de 9‐LOX, α‐DOX1 y COI1, relacionados con la síntesis o con la señalización de oxilipinas, y mediante la aplicación exógena de JA y SA, muestran la implicación del metabolismo de las oxilipinas en el desarrollo de la NS producida por la infección sinérgica entre PVXpotyvirus en N. benthamiana. Además, estos resultados indican que la PCD asociada a esta infección, al igual que ocurre en interacciones incompatibles, no contiene necesariamente la acumulación viral, lo cual indica que necrosis e inhibición de la multiplicación viral son procesos independientes. ABSTRACT Plant viruses cause severe diseases that lead to serious economic losses worldwide. Moreover, simultaneous infections with several viruses are common in nature leading to exacerbation of the disease symptoms. This phenomenon is known as viral synergism. Systemic necrosis (SN) is one of the most severe symptoms caused by plant viruses in susceptible plants, even leading to death of the host. This phenotype has been compared with the hypersensitive response (HR) displayed by resistant plants, and some parallelisms have been found between both responses, which suggest that SN induced by compatible interactions could be the result of a systemic hypersensitive response (SHR). However, the molecular mechanisms involved in the development of SN, its relationship with antiviral defence processes and its biological relevance are still unknown. Furthermore, the changes produced in plants by mixed infections that cause synergistic pathological effects have not been studied in a genome‐wide scale. In this doctoral thesis different approaches have been used to analyse gene expression, together with other genetic and biochemical techniques, in the model plant Nicotiana benthamiana, in order to study the SN produced by the synergistic infection of Potato virus X (PVX) with several potyviruses. Genomic and physiological changes produced in the host by double infection with PVX and Potato virus Y (PVY), and by single infection with PVX or PVY have been compared. In addition, transcriptional and hormonal changes associated with infection by the chimeric virus PVX/HC‐Pro, which produces synergistic symptoms similar to those caused by PVX‐potyvirus, have been compared with those produced by other types of cell death. These types of cell death are: PCD associated with an incompatible interaction, and PCD produced by proteasome disruption. Finally, reverse genetic techniques have revealed the involvement of host factors, such as oxylipins, in the development of SN associated with PVX‐potyvirus synergism. The results revealed that compared with single infections, double infection with PVX‐PVY produced qualitative and quantitative differences in the transcriptome profile, mainly related to primary metabolism. Other changes in gene expression, which reflected the activation of defence mechanisms, correlated with a severe oxidative stress in doubly infected plants that was undetected in single infections. Additionally, accumulation levels of several miRNAs involved in different cellular processes were measured, and the results showed that double infection not only produced the greatest variations in miRNA accumulation levels but also in miRNA functionality. These variations could be related with transcriptomic changes and the symptomatology of the infection. Transcriptome and hormone level comparisons between SN induced by PVX/HCPro and the incompatible interaction produced by Tobacco mosaic virus in plants expressing the N resistance gene (SHR), showed some similarities between both responses, even though the compatible interaction appeared retarded in time. Nevertheless, the expression profiles of both defence‐related genes and hormoneresponsive genes, as well as the relative accumulation of salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) and abscisic acid in the compatible interaction are more similar to the PCD response produced by proteasome disruption. These data suggest that interference with proteasome functionality contributes to the increase in pathogenicity associated with PVX‐potyvirus synergism. Finally, the results obtained by reducing the expression of 9‐LOX, α‐DOX1 and COI1, related with synthesis or signalling of oxylipins, and by applying exogenously JA and SA, revealed that oxylipin metabolism is involved in the development of SN induced by PVX‐potyvirus synergistic infections in N. benthamiana. Moreover, these results also indicated that PVX‐potyvirus associated PCD does not necessarily restrict viral accumulation, as is also the case in incompatible interactions. This indicates that both necrosis and inhibition of viral multiplication are independent processes.

Diseño, implantación y seguimiento de la asignatura "Ingenia: Proyecto de Máquinas"

El presente proyecto fin de carrera surge y se engloba dentro del marco del Proyecto de Innovación Educativa IE-14-15-05008 y abarca el proceso de diseño, implantación y seguimiento de la nueva asignatura “Ingenia: Proyecto de Máquinas” perteneciente al recién estrenado Máster en Ingeniería Industrial que oferta la Universidad Politécnica de Madrid. Esto debe realizarse dentro del ámbito de organización educativa que constituye el Marco Europeo de Educación Superior y que con el Proceso de Bolonia (1999) propuso un cambio en el modelo educativo, que permitiese entre otras cosas, impulsar cambios en las metodologías docentes. Durante gran parte del siglo XX, la enseñanza de la ingeniería en las universidades ofrecía una exposición efectiva a la práctica. Era enseñada por ingenieros que estaban ejerciendo su profesión y se concentraba en la resolución de problemas tangibles mientras que los estudiantes aprendían a conceptualizar y diseñar productos y sistemas. La rápida expansión del conocimiento científico y técnico que ocurrió a finales de los 90s causó que la enseñanza de la ingeniería se convirtiera en la enseñanza de la “ciencia de la ingeniería”, con una menor concentración práctica. Los líderes de la industria empezaron a hallar que los estudiantes que se graduaban, si bien tenían una sólida capacitación técnica, carecían de muchas de las habilidades requeridas en las situaciones de ingeniería del mundo real. La enseñanza en general y la enseñanza de la Ingeniería en particular necesitan por tanto de una reforma educativa integral. De esta necesidad, surge la iniciativa CDIO (ConcebirDiseñar-Implementar-Operar), un marco educativo innovador dirigido a producir la próxima generación de líderes de ingeniería; siendo este el marco al que se abrazan las asignaturas tipo “INGENIA” y con el que se pretenden alcanzar las habilidades tanto técnicas como personales e interpersonales que requiere la nueva generación de ingenieros para ser competitivos en un sector cada vez más amplio y multidisciplinar. Para conseguir el cambio requerido antes citado, se hace necesaria la realización de proyectos de innovación educativa como el presente, que ayuden durante el proceso de transición que está viviendo el modelo educativo. Para lograr estos, el presente proyecto pretende dar respuesta a preguntas como: ¿De dónde venimos y hacia dónde debemos ir?, ¿Por qué es necesario un cambio?, ¿Qué pretendemos alcanzar con este cambio?, ¿Qué resultados esperamos de ello?, ¿Qué cambios se han introducido y cuales hay pendientes por introducir?, ¿Cómo planificar la reestructuración y adaptación de recursos y contenidos docentes para alcanzar los objetivos?, ¿De qué recursos se dispone y cuales hay que incorporar?, ¿Cómo debemos medir, evaluar y difundir los resultados obtenidos?, ¿Qué conclusiones se pueden extraer de los resultados? Para dar respuesta a estas y otras preguntas se abordan los puntos que se exponen a continuación. Los principales apartados del presente proyecto son la INTRODUCCIÓN, PLANIFICACIÓN y RESULTADOS OBTENIDOS. En primer lugar, durante la INTRODUCCIÓN se realiza una descripción del Espacio Europeo de Educación Superior (EEES), resumiendo cuáles son los objetivos estratégicos del mismo, y la conexión existente con la enseñanza de la Ingeniería Mecánica. Posteriormente se aborda un breve estudio de las metodologías docentes tradicionales empleadas en la enseñanza para inmediatamente después introducir las bases del aprendizaje activo. Se analizan las necesidades que han llevado a plantear los cambios en las metodologías docentes. Para esto se analizan varios estudios enfocados a concretar las características que se requieren en los recién egresados de titulaciones técnicas. Como consecuencia de las necesidades descritas surge la iniciativa CDIO, marco a la que se acogen las asignaturas “Ingenia” y que se estudiará en profundidad. Por último y tras introducir el contexto del proyecto, se describen los objetivos del mismo así como la planificación de las actividades. Con el apartado PLANIFICACIÓN se pretende describir las actividades realizadas del proceso de diseño de la asignatura abarcando la programación de actividades, gestión y empleo de recursos, metodologías docentes empleadas, plan de evaluación, entre otras actividades. En el apartado RESULTADOS OBTENIDOS se describen los prototipos fabricados, los resultados de aprendizaje, la valoración de la asignatura y problemas encontrados. Todo ello será de especial interés para extraer lecciones aprendidas y proponer acciones correctoras y/o de mejora.