Silencing microRNA-134 produces neuroprotective and prolonged seizure-suppressive effects

Temporal lobe epilepsy is a common, chronic neurological disorder characterized by recurrent spontaneous seizures. MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs that regulate post-transcriptional expression of protein-coding mRNAs, which may have key roles in the pathogenesis of neurological disorders. In experimental models of prolonged, injurious seizures (status epilepticus) and in human epilepsy, we found upregulation of miR-134, a brain-specific, activity-regulated miRNA that has been implicated in the control of dendritic spine morphology. Silencing of miR-134 expression in vivo using antagomirs reduced hippocampal CA3 pyramidal neuron dendrite spine density by 21% and rendered mice refractory to seizures and hippocampal injury caused by status epilepticus. Depletion of miR-134 after status epilepticus in mice reduced the later occurrence of spontaneous seizures by over 90% and mitigated the attendant pathological features of temporal lobe epilepsy. Thus, silencing miR-134 exerts prolonged seizure-suppressant and neuroprotective actions; determining whether these are anticonvulsant effects or are truly antiepileptogenic effects requires additional experimentation.

Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Incidencia, prevalencia y severidad de las lesiones deportivas en tres programas de entrenamiento para la pérdida de peso. Proyecto PRONAF

La práctica de actividad física y del deporte ha dado muestras indiscutibles sobre su relación con un buen estado de salud, tanto mental como corporal. Sin embargo, también entraña riesgos que pueden mermar la calidad de vida del practicante, siendo uno de los más comunes e importantes el riesgo de sufrir una lesión deportiva. Actualmente, se han dado respuesta a los factores de riesgo internos y externos que pueden afectar a que un deportista, tanto a nivel profesional como recreativo, pueda sufrir una lesión, pero pocos estudios se han realizado para evaluar la incidencia, la prevalencia y la severidad de las lesiones, en personas sedentarias con sobrepeso y obesidad que deciden comenzar a entrenar y/o a realizar actividad física. Incluso en aquellos casos que por razones clínicas, deben incluir el ejercicio físico como una parte integral del tratamiento terapéutico. Por lo tanto, el objetivo del estudio fue analizar la incidencia, prevalencia y severidad de las lesiones deportivas registradas en los protocolos de entrenamiento desarrollados durante el proyecto de Nutrición y Actividad Física para el tratamiento del sobrepeso y la obesidad (PRONAF). Se realizó un análisis descriptivo y se evaluó el efecto y el grado de asociación entre la incidencia de lesión y la composición corporal, el sexo o el protocolo de entrenamiento. Por otro lado, se observó la localización anatómica más común de las lesiones en cada una de las fases. Por último, se propuso una ecuación para estimar el riesgo de lesión en sujetos en sobrepeso y obesidad, antes de comenzar un programa de ejercicio controlado. Un total de 167 adultos con sobrepeso y obesidad sanos (77 hombres, 90 mujeres) fueron evaluados durante el proyecto mediante un registro de lesiones previamente validado. Los principales resultados de este trabajo mostraron que un 47,3% de los participantes sufrió, al menos, una lesión o dolencia durante el programa de intervención, observando una incidencia de 1,22 lesiones por cada 100 horas de entrenamiento. No obstante, se observó que el 80,2% de las lesiones fueron menores (de 1 a 7 días). La rodilla fue la localización que mayor proporción de lesiones registró durante la intervención. Por otro lado, no se observaron asociaciones significativas entre la fase de sobrepeso y la fase de obesidad, ni entre ser hombre o mujer y sufrir más lesiones durante la intervención. Sin embargo, los protocolos de entrenamiento que incluyen cargas, mostraron hasta cinco veces más riesgo de sufrir una lesión que el protocolo que no las incluyó. Por último, se propuso una ecuación para predecir la influencia de las variables fase, lesión previa, protocolo de entrenamiento, sexo y edad para predecir el riesgo de lesión en una población con sobrepeso y obesidad que incluya los protocolos de entrenamiento propuestos en el proyecto PRONAF. ABSTRACT The practice of physical activity and sport has indisputable signs on his relationship with a good health, both mental and physical. However, it is true that also risks that may impair the quality of life of the practitioner, one of the most common and important risk of sports injury. However, although they have responded to factors internal and external risks that may affect an athlete, both professional and recreational may suffer an injury, few studies have been conducted to assess the incidence and prevalence of injuries in sedentary people who decide to start training and / or physical activity. Even in those cases for clinical reasons, such as overweight and obesity, should include exercise as an integral part of therapy. Therefore, the aim of the study was to analyze the incidence, prevalence and severity of sports injuries registered training protocols developed during the project's Nutrition and Physical Activity for the treatment of overweight and obesity (PRONAF). A descriptive analysis was performed and the effect and the degree of association between the incidence of injury and body composition, sex or training protocol was evaluated. Furthermore, the most common anatomical injury location in each of the phases were observed. Finally, an equation for estimating the risk of injury in overweight and obese subjects, before starting a controlled exercise program was proposed A total of 167 healthy adults with overweight and obesity (77 men, 90 women) were evaluated during the project using a previously validated record injuries. The main results of this study showed that 47.3% of participants experienced at least one injury or illness during the intervention program, having an incidence of 1.22 injuries per 100 hours of training. However, it was observed that 80.2% of injuries were lower (1 to 7 days). Knee location was higher proportion of lesions that recorded during the procedure. On the other hand, no significant associations between the phase of overweight and obesity were observed phase or between being male or female and further injury during project. However, training protocols that included loads, showed up to five times the risk of injury to the protocol did not include them. Finally, an equation was proposed to predict the influence of the phase, previous injury, training protocol, sex and age to observe the risk of injury in a population of overweight and obesity with includes the training protocols proposed in the PRONAF project.