Identificación y caracterización de la ruta mediada por la proteína G heterotrimérica de Arabidopsis thaliana en la respuesta inmune

La resistencia de las plantas a los hongos necrótrofos como Plectosphaerella cucumerina es genéticamente compleja y depende de la activación coordinada de distintas rutas de señalización (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Entre éstas se encuentran las mediadas por la proteína G heterotrimérica, un complejo formado por tres subunidades (Gα, Gβ y Gγ) que regula tanto la respuesta de inmunidad a diferentes patógenos como distintos procesos de desarrollo (Temple and Jones, 2007). En esta Tesis hemos demostrado que, en Arabidopsis, el monómero funcional formado por las subunidades Gβ y Gγ1/Gγ2 es el responsable de la regulación de la respuesta de defensa, ya que mutantes nulos en estas subunidades (agb1 y agg1 agg2) presentan una alta susceptibilidad al hongo P. cucumerina. Además, hemos identificado varios aminoácidos (Q102, T188 y R235) de la proteína AGB1 esenciales en la interacción con los efectores correspondientes para la regulación de la respuesta inmune (Jiang et al, enviado). Para determinar las bases moleculares de la resistencia mediada por la proteína G heterotrimérica, llevamos a cabo un análisis transcriptómico comparativo entre los genotipos agb1 y Col-0, el cual reveló que la resistencia mediada por AGB1 no depende de rutas defensivas implicadas en la resistencia a hongos necrotrofos, como las mediadas por el ácido salicílico (SA), etileno (ET), jasmónico (JA) o ácido abscísico (ABA), o la ruta de biosíntesis de metabolitos derivados del triptófano. Este estudio mostró que un número significativo de los genes desregulados en respuesta a P. cucumerina en el genotipo agb1 respecto a las plantas silvestres codificaban proteínas con funciones relacionadas con la pared celular. La evaluación de la composición y estructura de la pared de los mutantes de las subunidades de la proteína G heterotrimérica reveló que los genotipos agb1 y agg1 agg2 presentaban alteraciones similares diferentes de las observadas en plantas silvestres Col-0, como una reducción significativa en el contenido de xilosa en la pared. Estos datos sugieren que la proteína G heterotrimérica puede modular la composición/estructura de la pared celular y contribuir, de esta manera, en la regulación de la respuesta inmune (Delgado- Cerezo et al, 2011). La caracterización del interactoma de la proteína G heterotrimérica corroboró la relevancia funcional que presenta en la regulación de la pared celular, ya que un número significativo de las interacciones identificadas estaban comprendidas por proteínas relacionadas directa o indirectamente con la biogénesis y remodelación de la pared celular (Klopffleisch et al, 2011). El papel en inmunidad de algunos de estos potenciales efectores ha sido validado mediante el análisis de la resistencia a P. cucumerina de los mutantes de pérdida de función correspondientes. Con el objetivo de caracterizar las rutas de señalización mediadas por AGB1 e identificar efectores implicados en esta señalización, llevamos a cabo una búsqueda de mutantes supresores de la susceptibilidad de agb1 a P. cucumerina, identificándose varios mutantes sgb (supressor of Gbeta). En esta Tesis hemos caracterizado en detalle el mutante sgb10, que presenta una activación constitutiva de las rutas de señalización mediadas por SA y JA+ET y suprime el fenotipo de susceptibilidad de agb1. SGB10 y AGB1 forman parte de rutas independientes en la regulación de la respuesta inmune, mientras que interaccionan de forma compleja en el control de determinados procesos de desarrollo. La mutación sgb10 ha sido cartografiada entre los genes At3g55010 y At3g56408, que incluye una región con 160 genes. ABSTRACT Plant resistance to necrotrophic fungi Plectosphaerella cucumerina is genetically complex and depends on the interplay of different signalling pathways (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Among others, the heterotrimeric G protein complex has a relevant role. The G protein that is formed by three subunits (Gα, Gβ and Gγ) is a pleiotropic regulator of immune responses to different types of pathogens and developmental issues (Temple and Jones, 2007). Throughout the Thesis, we have demonstrated that Arabidopsis’ functional monomer formed by the Gβ and Gγ1/Gγ2 subunits is a key regulator of defense response, as null mutants (agb1 and agg1 agg2) are equally hypersusceptible to P. cucumerina infection. In addition we have identified several AGB1 aminoacids (Q102, T188 y R235) essentials to interact with specific effectors during the regulation of immune response (Jiang et al, sent).To determine the molecular basis of heterotrimeric G protein mediated resistance we have performed a microarray analysis with agb1-1 and wild type Col-0 plants before and after P. cucumerina challenge. A deep and exhaustive comparative transcriptomical analysis of these plants revealed that AGB1 mediated resistance does not rely on salicilic acid (SA), ethylene (ET), jasmonates (JA), abscisic acid (ABA) or triptophan derived metabolites biosynthesis. However the analysis revealed that a significant number of cell wall related genes are misregulated in the agb1 mutant after pathogen challenge when compared to wild-type plants. The analysis of cell wall composition and structure showed similar cell wall alterations between agb1 and agg1 agg2 mutants that are different from those of wild-type plants, so far the mutants present a significant reduction in xylose levels. All these results suggest that heterotrimeric G protein may regulate immune response through modifications in the cell wall composition/structure (Delgado-Cerezo et al, 2011). The characterization of Heterotrimeric G protein interactome revealed highly connected interactions between the G-protein core and proteins involved in cell wall composition or structure (Klopffleisch et al, 2011). To test the role in immunity of several effectors identified above, we have performed resistance analysis of corresponding null mutants against P. cucumerina. In order to characterize AGB1 mediated signalling pathway and identify additional effectors involved in AGB1-mediated immune response against P. cucumerina, we have performed a screening to isolate mutants with suppression of agb1 phenotype. One of the mutants, named sgb10, has been characterized during the Thesis. The mutant shows constitutive expression of SA, JA+ET-mediated defense signaling pathways to suppres agb1 hypersusceptibility. SGB10 and AGB1 proteins seem to be part of independent pathways in immunity, however its function during development remains unclear. At present, we have mapped the sgb10 mutation between At3g55010 and At3g56408 genes. This region contains 160 genes.

Hacia una teoría de la restauración arquitectónica y estudio de los centros históricos

La Tesis, formalmente, es parte de la que consta desde 1.975 en la biblioteca de la Escuela con la signatura 20024. Manteniendo el mismo título, estudia la evolución de la teoría de la restamración y del análisis de los centros históricos a través de la bibliografía publicada en los últimos veinte años y, de algunas actuaciones realizadas en Sevilla durante el mismo período. El resultado está presentado, siguiendo el orden del índice General, en cinco volúmenes: I resumen, II El desarrollo general del tema, III Apéndices, IV bibliografía publicada en los últimos veinte años y, V glosario de términos. Para identificar los orígenes y antecedentes de la teoría de la restauración arquitectónica y de su evolución, el estudio se encuentra desarrollado en cuatro capítulos: Una visión general; La restauración en España en el siglo XX hasta 1.976; Los últimos veinte años 1975 - 1.996 y, El estudio de los centros históricos. En el primero, se perfila el origen, la evolución y el estado actual de la cuestión dentro del ámbito internacional. Al respecto, se destacan las relaciones entre los hechos y las opiniones en Europa y en América. Las consecuencias de la revolución francesa, de la revolución industrial, de la segunda guerra mundial y del movimiento moderno sobre el patrimonio ya construido a través de los cambios en el marco legal; de la opinión de los más destacados profesionales que se han pronimciado sobre el tema, entre otros: Vitet, Viollet le Duc, Ruskin, Morris, Boito, Riegl, Giovannoni, Brandi. Paralelamente, también se hace referencia a la formación del arquitecto y a la participación de otras disciplinas en la restam-ación del patrimonio cultiual construido. En el segundo capítulo, se estudia el proceso de adscripción de los especialistas españoles a las corrientes internacionales de la restauración y la forma como inició la "restauración perceptiva" en los escritos de los "restauradores" que habían asumido el pensamiento de Viollet le Duc, representados por Lampérez y de los "antirrestauradores" que defendían la postura de Ruskin. La tercera vía sugerida por Boito, debido a su distanciamiento razonado de los dos anteriores, no se la encuentra identificada de manera específica en ningún autor español de esta época pero sí a través de la adopción generalizada de la casuística, del "caso por caso". Durante la República, "la elaboración teórica perderá el carácter de debate enconado que había caracterizado el desarrollo de decenios anteriores lo cual, unido a que la escasa diuación del período impide la formación de una tradición teórica, hace que las contribuciones no sean cuantiosas" Posteriormente, cuando el trabajo teórico de Torres Balbás puesto de manifiesto en centenares de artículos y en las obras de la Alhambra, permitía advertir su aporte al enriquecimiento de los principios internacionales de la restauración, sobrevino la guerra civil y con ella el inicio de un largo período de aletargamiento. Él, en 1.931 había asistido a la conferencia de Expertos para la protección realizada en Atenas para presentar su trabajo titulado: "Evolución del criterio respecto a la restauración de monimientos en la España actual". De esa reunión surgió la Carta Internacional que treinta y tres años después, serviría de referente a la Carta de Venecia, el documento de más amplia repercusión en el ámbito de la protección del patrimonio cultural edificado (arquitectura y centros históricos). La continuidad de los congresos de especialistas iniciada a fines del siglo pasado, se interrumpió en la década de los cuarenta. Debido a las consecuencias de la segunda guerra mundial se aprobó la "Convención de La Haya sobre protección de los Bienes Culturales en caso de conflicto armado". A partir de entonces, los moniunentos (la restaiuración) quedarán inmersos en luia nueva concepción, más general y amplia que, después de ser profundizada por Giannini, será adoptada en la Ley del Patrimonio Histórico Español, vigente desde 1.985. Los primeros pronimciamientos del movimiento de la arquitectm-a moderna y después las sendas Cartas de Atenas (1.931, 1.933) habían ubicado a la restaiuación en una situación perfectamente acotada dentro de la cual prolongaban su vida todas las otras corrientes: historicista, ecléctica, nacionalista, neoromántica, etc. En un lado se ubicaron los "modernos" y en el otro los "conservacionistas". Solamente a fines de los años setenta, demostradas las insuficiencias "modernas", ésta reiterativa compartiamentación tratará de ser superada. En el tercer capítulo se estudia detalladamente el aporte bibliográfico al tema y se evidencia la forma cómo, por exceso de doctrina y, coetáneamente, de una escasa teoría, terminada la dictadm-a en España, la situación del patrimonio arquitectónico seguía pareciéndose mucho a aquella descrita por Torres Balbás sesenta años antes: "un tremendo deterioro", debido a la especulación inmobiliaria y a la falta de vma política cultiu-al. El peso del régimen anterior parece haber sido tal que, pocas cosas escaparon a su control. Gracias al ambiente democrático, según la bibliografía revisada, la actitud de los especialistas en "lo nuevo" frente a "lo antiguo" también cambió. La norma, desde entonces ha perdido contundencia pero no su vigencia. Después del agotamiento terminológico al que llegó la restam-ación en los años setenta, Sola Morales introdujo, por primera vez en España ima palabra familiar entre los italianos pero novedosa en castellano: "intervención". A partir de este momento se adoptaron los principios del "restauro crítico" italiano y se provocó el cuestionamiento sobre la rehabilitación. En 1.983, por primera vez en español aparece resiunida y ordenada por Antón Capitel, una "Discusión crítica sobre las Teorías de la Restam^ación arquitectónica". Será parte constitutiva del libro publicado en 1.988 "Metamorfosis de monumentos". Emergía de un período esencialmente confuso pero de reflexión a la que se integraron los arqueólogos, historiadores, críticos, etc, debido particularmente a dos circunstancias: la infrautilización del patrimonio construido en los centros históricos y la consecuente "fiebre restauradora y rehabilitadora". En los últimos veinte años, según 524 registros publicados en España de un total de 799 que constan en el índice onomástico de la bibliografía estudiada, la notable influencia del pensamiento italiano sobre el tema de la tesis, solamente ha servido para matizar la tradición doctrinaria local, incapaz de extraer de su enorme tradición práctica, un componente teórico generador propio. Lo dicho se constata al analizar dos importantes obras ejecutadas en Sevilla durante el período de preparación del Quinto Centenario: la Cartuja y el Palacio de Manara. La primera no ha conseguido evidenciar su objetivo cultural. La restaiu"ación en el Palacio de Manara ha logrado recuperar la distribución tipológica de una importante casa señorial del centro histórico de Sevilla pero, contrariamente a lo que se proclama, tampoco tiene características para convertirse en un modelo a seguir. En el último capítulo se estudia la relación entre la restamación arquitectónica y el centro histórico. Si a éste se lo reconoce como una unidad homogénea, su protección intermediada por la intervención en sus monumentos tendría una apreciable limitación pues, esa arquitectura sin aquella connotación no podría garantizar la protección de todo el "conjunto". De esta circunstancia emerge el planeamiento como el único reciuso técnico capaz de garantizar la protección integral de la arqmtectura. Sin embargo, en España, el planeamiento de protección sigue dependiendo de la filosofía de la Ley del Suelo. No de la de Cultura. Debido a ello, todavía no es posible apreciar una postm-a de lo "antiguo" frente a lo "nuevo" en forma semejante a la conocida actitud de quienes están edificando lo "nuevo" hacia lo "antiguo". Esta es la situación que en el futuro deberá superar la "restauración" arquitectónica y la "protección" en los centros históricos para hacer propicia una reflexión teórica dinámica. Complementariamente, a manera de conclusión, entre otros puntos se ha verificado: En cantidad, en calidad y en diversidad, el contenido de los registros bibliográficos de las dos últimas décadas en España, son superiores a los de épocas anteriores pero, en cuanto a profundidad, las diferencias se hacen imperceptibles. No existe una teoría de la restam-ación tomada como un. conjunto de conocimientos especulativos independientes de su aplicación. Existen algunos componentes dispersos que, desde luego, constituyen un cuerpo doctrinal (en cuanto normativo) con indudables contenidos conceptuales que a la vez podrían constituir los fragmentos sueltos de una posible teoría. El fracaso en la delimitación del ámbito del restam-o y en la construcción de una teoría general sobre la restauración de monumentos en España no quita ni pone importancia a las intervenciones en el patrimonio edilicio con alto valor social agregado realizadas en los últimos veinte años. Eso sí, dificulta identificar una actitud profesional y académica generalizadas frente al patrimonio cultural edificado. No es posible afirmar que las intervenciones de los últimos años estén sometidas a una teoría general o específica ni tampoco decir que hay una "escuela regional" entendida como una tradición de haceres, actitudes o características resultantes commies en las restam-aciones del patrimonio arquitectónico. Obedecen al cumplimiento de la doctrina tradicional que bien podría convertirse en el pragmático empleo de un recurso artificio con connotación ética. En la restauración - a diferencia de la arquitectura de nueva planta- pareciera ser necesario y más fácil identificar la relación entre ética y estética; por lo tanto, habría una especie de obligación social de explicar la razón de ser de las obras tanto como la forma de ejecutarlas. Como conclusión, operativa y parte de ese corpus teórico -que no teoría propiamente dicha- se ha elaborado lui GLOSARIO de términos especializados sobre el tema.

The TRANSPLANTA collection of Arabidopsis lines: a resource for functional analysis of transcription factors based on their conditional overexpression.

Los factores de transcripción (FTs) son reguladores clave de la expresión génica en todos los organismos. En eucariotas los FTs con frecuencia están representados por miembros funcionalmente redundantes de familias génicas de gran tamaño. La sobreexpresión de FTs puede representar una herramienta para revelar las funciones biológicas de FTs redundantes en plantas; sin embargo, la sobreexpresión constitutiva de FTs con frecuencia conlleva diversos defectos en el desarrollo, impidiendo su caracterización funcional. Sin embargo, aproximaciones de sobreexpresión condicional podrían ayudar a solventar este problema. En el consorcio TRANSPLANTA, en el que participan varios laboratorios del CBGP, hemos generado una colección de líneas transgénicas de Arabidopsis, cada una de las cuales expresa un FT bajo el control de un promotor inducible por ?estradiol. Hasta el momento se han generado 1636 líneas homocigotas independientes que corresponden a 634 FTs diferentes, lo que representa una media de 2,6 líneas por cada FT. Como confirmación de la utilidad de esta herramienta, el tratamiento con ?estradiol de líneas que expresaban condicionalmente FTs provoca alteraciones fenotípicas tales como proliferación de pelos radiculares, senescencia inducida por oscuridad, acumulación de antocianinas y enanismo, y que corroboran fenotipos previamente descritos debidos a la sobreexpresión de dichos FTs. Rastreos realizados posteriormente con otras líneas TRANSPLANTA han permitido la identificación de FTs implicados en diferentes procesos biológicos de plantas, confirmando que la colección es una herramienta valiosa para la caracterización funcional de FTs. Las semillas de las líneas TRANSPLANTA han sido depositadas en el Nottingham Arabidopsis Stock Centre para su distribución posterior.

Caracterización funcional de los genes sgb (suppressors of agb1-2 susceptibility to pathogens): Nuevos reguladores de la respuesta de inmunidad innata de Arabidopsis thaliana

Un porcentaje importante de las pérdidas de la producción agrícola se deben a las enfermedades que causan en los cultivos los hongos necrótrofos y vasculares. Para mejorar la productividad agrícola es necesario tener un conocimiento detallado de las bases genéticas y moleculares que regulan la resistencia de las plantas a este tipo de patógenos. En Arabidopsis thaliana la resistencia frente a patógenos necrótrofos, como el hongo Plectosphaerella cucumerina BMM (PcBMM), es genéticamente compleja y depende de la activación coordinada de distintas rutas de señalización, como las reguladas por las hormonas ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA), etileno (ET) y ácido abscísico (ABA), así como de la síntesis de compuestos antimicrobianos derivados del Triptófano y de la integridad de la pared celular (Llorente et al., 2005, Hernández-Blanco et al., 2007; Delgado-Cerezo et al., 2012). Uno de los componentes claves en la regulación de la resistencia de las plantas a patógenos (incluidos hongos necrótrofos y biótrofos) es la proteína G heterotrimérica, un complejo proteico formado por tres subunidades (Gα, Gβ y Gγ), que también regula distintos procesos del desarrollo vegetal. En Arabidopsis hay un gen que codifica para la subunidad α (GPA1), otro para la β (AGB1), y tres genes para la subunidad γ (AGG1, AGG2 y AGG3). El complejo GPA1-AGB1-AGG (1-3) se activa y disocia tras la percepción de una señal específica, actuando el dímero AGB1-AGG1/2 como un monómero funcional que regula las respuestas de defensa (Delgado-Cerezo et al., 2012). Estudios transcriptómicos y análisis bioquímicos de la pared celular en los que se comparaban los mutantes agb1-2 y agg1 agg2, y plantas silvestres (Col-0) revelaron que la resistencia mediada por Gβ-Gγ1/2 no es dependiente de rutas de defensa previamente caracterizadas, y sugieren que la proteína G podría modular la composición/estructura (integridad) de la pared celular (Delgado-Cerezo et al., 2012). Recientemente, se ha demostrado que AGB1 es un componente fundamental de la respuesta inmune mediada por Pathogen- Associated Molecular Patterns (PTI), ya que los mutantes agb1-2 son incapaces de activar tras el tratamiento con PAMPs respuestas de inmunidad, como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS; Liu et al., 2013). Dada la importancia de la proteína G heterotrimérica en la regulación de la respuestas de defensa (incluida la PTI) realizamos un escrutinio de mutantes supresores de la susceptibilidad de agb1-2 al hongo necrótrofo, PcBMM, para identificar componentes adicionales de las rutas de señalización reguladas por AGB1. En este escrutinio se aislaron cuatro mutantes sgb (suppressors of agb1-2 susceptibility to pathogens), dos de los cuales, sgb10 y sgb11, se han caracterizado en la presente Tesis Doctoral. El mutante sgb10 es un segundo alelo nulo del gen MKP1 (At3g55270) que codifica la MAP quinasa-fosfatasa 1 (Bartels et al., 2009). Este mutante presenta lesiones espontáneas en plantas adultas y una activación constitutiva de las principales rutas de defensa (SA, JA y ET, y de metabolitos secundarios, como la camalexina), que explicaría su elevada resistencia a PcBMM y Pseudomonas syringae. Estudios epistáticos sugieren que la resistencia mediada por SGB10 no es dependiente, si no complementaria a la regulada por AGB1. El mutante sgb10 es capaz de restablecer en agb1-2 la producción de ROS y otras respuestas PTI (fosforilación de las MAPK6/3/4/11) tras el tratamiento con PAMPs tan diversos como flg22, elf18 y quitina, lo que demuestra el papel relevante de SGB10/MKP1 y de AGB1 en PTI. El mutante sgb11 se caracteriza por presentar un fenotipo similar a los mutantes irregular xylem (e.g. irx1) afectado en pared celular secundaria: irregularidades en las células xilemáticas, reducción en el tamaño de la roseta y altura de planta, y hojas con un mayor contenido de clorofila. La resistencia de sgb11 a PcBMM es independiente de agb1-2, ya que la susceptibilidad del doble mutante sgb11 agb1-2 es intermedia entre la de agb1-2 y sgb11. El mutante sgb11 no revierte la deficiente PTI de agb1-2 tras el tratamiento con flg22, lo que indica que está alterado en una ruta distinta de la regulada por SGB10. sgb11 presenta una sobreactivación de la ruta del ácido abscísico (ABA), lo que podría explicar su resistencia a PcBMM. La mutación sgb11 ha sido cartografiada en el cromosoma III de Arabidopsis entre los marcadores AthFUS6 (81,64cM) y nga6 (86,41cM) en un intervalo de aproximadamente 200 kb, que comprende genes, entre los que no se encuentra ninguno previamente descrito como IRX. El aislamiento y caracterización de SGB11 apoya la relevancia de la proteína G heterotrimérica en la regulación de la interconexión entre integridad de la pared celular e inmunidad. ABSTRACT A significant percentage of agricultural losses are due to diseases caused by necrotrophic and vascular fungi. To enhance crop yields is necessary to have a detailed knowledge of the genetic and molecular bases regulating plant resistance to these pathogens. Arabidopsis thaliana resistance to necrotrophic pathogens, such as Plectosphaerella cucumerina BMM (PcBMM) fungus, is genetically complex and depends on the coordinated activation of various signaling pathways. These include those regulated by salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), ethylene (ET) and abscisic acid (ABA) hormones and the synthesis of tryptophan-derived antimicrobial compounds and cell wall integrity (Llorente et al., 2005, Hernández-Blanco et al., 2007; Delgado-Cerezo et al., 2012). One key component in the regulation of plant resistance to pathogens (including biotrophic and necrotrophic fungi) is the heterotrimeric G-protein. This protein complex is formed by three subunits (Gα, Gβ and Gγ), which also regulates various plant developmental processes. In Arabidopsis only one gene encodes for subunits α (GPA1) and β (AGB1), and three genes for subunit γ (AGG1, AGG2 y AGG3). The complex GPA1- AGB1-AGG(1-3) is activated and dissociates after perception of an specific signal, AGB1- AGG1/2 acts as a functional monomer regulating defense responses (Delgado-Cerezo et al., 2012). Comparative transcriptomic studies and biochemical analyses of the cell wall of agb1-2 and agg1agg2 mutant and wild plants (Col-0), showed that Gβ-Gγ1/2-mediated resistance is not dependent on previously characterized defense pathways. In addition, it suggests that G protein may modulate the composition/structure (integrity) of the plant cell wall (Delgado-Cerezo et al., 2012). Recently, it has been shown that AGB1 is a critical component of the immune response mediated by Pathogen-Associated Molecular Patterns (PTI), as agb1-2 mutants are unable to activate immune responses such as oxygen reactive species (ROS) production after PAMPs treatment (Liu et al., 2013). Considering the importance of the heterotrimeric G protein in regulation of defense responses (including PTI), we performed a screening for suppressors of agb1-2 susceptibility to the necrotrophic fungus PcBMM. This would allow the identification of additional components of the signaling pathways regulated by AGB1. In this search four sgb mutants (suppressors of agb1-2 susceptibility to pathogens) were isolated, two of which, sgb10 and sgb11, have been characterized in this PhD thesis. sgb10 mutant is a second null allele of MKP1 gene (At3g55270), which encodes the MAP kinase-phosphatase 1 (Bartels et al., 2009). This mutant exhibits spontaneous lesions in adult plants and a constitutive activation of the main defense pathways (SA, JA and ET, and secondary metabolites, such as camalexin), which explains its high resistance to Pseudomonas syringae and PcBMM. Epistatic studies suggest that SGB10- mediated resistance is not dependent, but complementary to the regulated by AGB1. The sgb10 mutant is able to restore agb1-2 ROS production and other PTI responses (MAPK6/3/4/11 phosphorylation) upon treatment with PAMPs as diverse as, flg22, elf18 and chitin, demonstrating the relevant role of SGB10/MKP1 and AGB1 in PTI. sgb11 mutant is characterized by showing a similar phenotype to irregular xylem mutants (e.g. irx1), affected in secondary cell wall: irregular xylems cells, rosette size reduction and plant height, and higher chlorophyll content on leaves. The resistance of sgb11 to PcBMM is independent of agb1-2, as susceptibility of the double mutant agb1-2sgb11 is intermediate between agb1-2 and sgb11. The sgb11 mutant does not revert the deficient PTI response in agb1-2 after flg22 treatment, indicating that is altered in a pathway different to the one regulated by SGB10. sgb11 presents an over-activation of the abscisic acid pathway (ABA), which could explain its resistance to PcBMM. The sgb11 mutation has been mapped on chromosome III of Arabidopsis, between AthFUS6 (81.64 cM) and nga6 (86.41 cM) markers, in 200 kb interval, which does not include previously known IRX genes. The isolation and characterization of SGB11 supports the importance of heterotrimeric G protein in the regulation of the interconnection between the cell wall integrity and immunity.

Un método de comprobación de secciones en losas de hormigón armado con familias de armaduras en direcciones arbitrarias. Parte I: Lajas y membranas

Las armaduras en estructuras bidimensionales de hormigón (losas y láminas) se suelen disponer en dos direcciones, típicamente ortogonales. Sin embargo, a veces, particularmente en zonas en las que las tensiones principales son elevadas, se disponen más de dos familias de armaduras y si la geometría del contorno de la estructura no es regular o no es rectangular es preciso colocar familias de armaduras formando ángulos oblicuos entre sí. En general, las direcciones de las tensiones principales en un punto de una estructura bidimensional no coinciden con las de las armaduras, lo que implica una incertidumbre acerca del trabajo de éstas. Esta problemática que aparece en el diseño usual de las estructuras de hormigón armado y pretensado, no suele estar recogida en la mayoría de las instrucciones. En particular, el tratamiento que presenta la norma española HE acerca del armado de las estructuras y elementos distintos de los monodimensionales, es decir, de la viga, es muy escaso. Este trabajo, que se ha dividido en dos partes, presenta un tratamiento unificado de comprobación de las armaduras en estructuras bidimensionales. En esta primera parte se recoge su aplicación a estructuras, tipos laja y membrana, sometidas a esfuerzos de extensión, es decir, axiles y rasantes, contenidos en su plano medio en el caso de lajas o en su plano tangente a la superficie media en el punto de comprobación, si se trata de una membrana. Como es usual, los esfuerzos, que se determinan a partir de un cálculo elástico y lineal, se mayoran mediante los pertinentes coeficientes de seguridad para obtener los llamados esfuerzos de cálculo. En este articulo, las armaduras en el punto en el que se comprueba la estructura se disponen con la máxima generalidad, es decir, una o varias familias formando ángulos arbitrarios en planta, y colocadas bien en el plano medio o simétricamente en planos paralelos equidistantes del anterior y separados de las caras superior e inferior de la estructura por los mismos recubrimientos. La segunda parte de este trabajo, que representa una extensión de la metodología al caso general de flexión-extensión, es objeto de una siguiente publicación. La metodología en este trabajo tiene en cuenta las ecuaciones, dadas por la elasticidad, de equilibrio, compatibilidad y constitutivas entre los esfuerzos conocidos y las tensiones y deformaciones en ambos materiales, hormigón y acero. Naturalmente, la ecuación constitutiva del hormigón no considera su resistencia a tracción, y por concreción se utiliza la conocida parábola rectángulo con posibilidad de rama descendente. Para el acero se supone para la relación tensiones-deformaciones un diagrama bilineal, es decir, se tiene en cuenta el posible endurecimiento. El cálculo, que se lleva a cabo mediante un simple programa de computador, permite obtener en pocos segundos las curvas de las tensiones y de las deformaciones en cada una de las familias de barras, así como de las tensiones principales en el hormigón en función del factor de amplificación de los esfuerzos. De esta forma se deduce el nivel de seguridad que se alcanza en un punto de la estructura de hormigón armado.

Caracterización dinámica del glaciar Hurd combinando observaciones de campo y simulaciones numéricas

El objetivo fundamental de esta tesis es la caracterización de la morfología y del estado de deformaciones y tensiones del Glaciar Hurd (Isla Livingston, Archipiélago de las Shetland del Sur, Antártida), mediante una combinación de observaciones de campo, registros de georradar y simulaciones numéricas. La morfología y el estado de deformaciones y tensiones actuales son la expresión de la evolución dinámica del glaciar desde tiempos pretéritos hasta recientes, y su análisis nos dará las pautas con las cuales ser capaces de predecir, con el apoyo de las simulaciones numéricas, su evolución futura. El primer aspecto que se aborda es el estudio de las estructuras que pueden observarse en la superficie del glaciar. Describimos las distintas técnicas utilizadas (medidas de campo, fotointerpretación de ortofotografías, análisis geoquímico de cenizas volcánicas, etc.) y presentamos el análisis e interpretación de los resultados morfo-estructurales, así como la correlación, mediante análisis geoquímicos (fluorescencia de rayos X), entre las cenizas volcánicas que extruyen en la superficie del Glaciar Hurd y las del volcán Decepción, origen de las cenizas. Esto nos permite realizar una datación de las mismas como Tefra 1, correspondiente a la erupción de 1970, Tefra 2, correspondiente a las erupciones pre-1829, y el conjunto Tefra 3, asociado a las erupciones más antiguas. En segundo lugar nos ocupamos de las estructuras presentes en el interior del glaciar, cuya herramienta de detección fundamental es el georradar. Identificadas estas estructuras internas, las vinculamos con las observadas en la superficie del glaciar. También hemos estudiado la estructura hidrotérmica del glaciar, obteniendo una serie de evidencias adicionales de su carácter politérmico. Entre éstas se contaban, hasta ahora, las basadas en el valor del parámetro de rigidez de la relación constitutiva del hielo determinada por ajuste de modelos dinámicos y observaciones realizados por Otero (2008) y las basadas en las velocidades de las ondas de radar en el hielo determinadas con el método de punto medio común por Navarro y otros (2009). Las evidencias adicionales que aportamos en esta tesis son: 1) la presencia de estructuras típicas de régimen compresivo en la zona terminal del glaciar y de cizalla en los márgenes del mismo, y 2) la presencia de un estrato superficial de hielo frío (por encima de otro templado) en la zona de ablación de los tres lóbulos del Glaciar Hurd –Sally Rocks, Argentina y Las Palmas–, que alcanzan espesores de 70, 50 y 40 m, respectivamente. Este estrato de hielo frío está probablemente congelado al lecho subglaciar en la zona terminal (Molina y otros, 2007; esta tesis). Por último, nos ocupamos de la simulación numérica de la dinámica glaciar. Presentamos el modelo físico-matemático utilizado, discutimos sus condiciones de contorno y cómo éstas se miden en los trabajos de campo, y describimos el procedimiento de resolución numérica del sistema de ecuaciones parciales del modelo. Presentamos los resultados para los campos de velocidades, deformaciones y tensiones, comparando estos resultados con las estructuras observadas. También incluimos el análisis de las elipses de deformación acumulativa, que proporcionan información sobre las estructuras a las que puede dar lugar la evolución del estado de deformaciones y tensiones a las que se ve sometido el hielo según avanza, lentamente, desde la cabecera hasta la zona terminal del glaciar, con tiempos de tránsito de hasta 1.250 años, recogiendo así la historia de deformaciones en el glaciar. Concluyendo, ponemos de manifiesto en esta tesis que las medidas de campo de las estructuras y niveles de cenizas, las medidas de georradar y las simulaciones numéricas de la dinámica glaciar, realizadas de forma combinada, permiten caracterizar el régimen actual de velocidades, deformaciones y tensiones del glaciar, entender su evolución en el pasado y predecir su evolución futura. ABSTRACT The main objective of this thesis is to characterize the morphology and the state of strains and stresses of Hurd Glacier (Livingston Island, South Shetland Islands archipelago, Antarctica) through a combination of field observations, ground-penetrating radar measurements and numerical simulations. The morphology and the current state of strain and stresses are the expression of the dynamic evolution of the glacier from the past to recent times, and their analysis gives us the guidelines to be able to predict, with the support of numerical simulations, its future evolution. The first subject addressed is the study of structures that can be observed on the glacier surface. We describe the different techniques used (field measurements, photointerpretation of orthophotos, geochemical analysis of volcanic ashes, etc.) and we present the analysis and interpretation of the morpho-structural results, as well as the correlation with geochemical analysis (XRF) between the volcanic ashes extruded to the surface of Hurd Glacier and those of Deception Island volcano, from which the ashes originate. This allows us dating the ashes as Tephra 1, corresponding to the 1970 eruption, Tephra 2, corresponding to the pre-1829 eruptions, and the Tephra 3 group, associated with older eruptions. Secondly we focus on the study of the structures present within the glacier, which are detected with the help of ground-penetrating radar. Once identified, we link these internal structures with those observed on the glacier surface. We also study the hydrothermal structure of the glacier, getting a series of additional evidences of its polythermal structure. Among the evidences available so far, we can mention those based on the value of the stiffness parameter of the constitutive relation of ice, determined by fitting dynamic models to observations, as done by Otero (2008), and those based on the velocity of propagation of the radar waves through the glacier ice, measured using the common midpoint method, as done by Navarro et al. (2009). The additional evidences that we provide in this thesis are: 1) the presence of structures typical of compressive regime in the terminal zone of the glacier, together with shear at its margins, and 2) the presence of a surface layer of cold ice (overlying a layer of temperate ice) in the ablation zone of the three lobes of Hurd Glacier –Sally Rocks, Argentina and Las Palmas–, reaching thicknesses of 70, 50 and 40 m, respectively. This cold layer is probably frozen to the subglacial bed in the terminal zone (Molina and others 2007; this thesis). Finally, we deal with the numerical simulation of glacier dynamics. We present the physical-mathematical model, discuss its boundary conditions and how they are measured in the field work, and describe the method of numerical solution of the model’s partial differential equations. We present the results for the velocity, strain and stress fields, comparing these results with the observed structures. We also include an analysis of the ellipses of cumulative deformation, which provide information about the structures that can result from the evolution of the strain and stress regime of the glacier ice as it moves slowly from the head to the snout of the glacier, with transit times of up to 1,250 years, so picking the history of deformation of the glacier. Summarizing, we show in this thesis that field measurements of structures and ash layers, ground-penetrating radar measurements and numerical simulations of glacier dynamics, performed in combination, allow us to characterize the current regime of velocities, strains and stresses of the glacier, to understand its past evolution and to predict its future evolution.

Integración de modelos numéricos de glaciares y procesado de datos de georradar en un sistema de información geográfica

Los modelos de termomecánica glaciar están definidos mediante sistemas de ecuaciones en derivadas parciales que establecen los principios básicos de conservación de masa, momento lineal y energía, acompañados por una ley constitutiva que define la relación entre las tensiones a las que está sometido el hielo glaciar y las deformaciones resultantes de las mismas. La resolución de estas ecuaciones requiere la definición precisa del dominio (la geometría del glaciar, obtenido a partir de medidas topográficas y de georradar), así como contar con un conjunto de condiciones de contorno, que se obtienen a partir de medidas de campo de las variables implicadas y que constituyen un conjunto de datos geoespaciales. El objetivo fundamental de esta tesis es desarrollar una serie de herramientas que nos permitan definir con precisión la geometría del glaciar y disponer de un conjunto adecuado de valores de las variables a utilizar como condiciones de contorno del problema. Para ello, en esta tesis se aborda la recopilación, la integración y el estudio de los datos geoespaciales existentes para la Península Hurd, en la Isla Livingston (Antártida), generados desde el año 1957 hasta la actualidad, en un sistema de información geográfica. Del correcto tratamiento y procesamiento de estos datos se obtienen otra serie de elementos que nos permiten realizar la simulación numérica del régimen termomecánico presente de los glaciares de Península Hurd, así como su evolución futura. Con este objetivo se desarrolla en primer lugar un inventario completo de datos geoespaciales y se realiza un procesado de los datos capturados en campo, para establecer un sistema de referencia común a todos ellos. Se unifican además todos los datos bajo un mismo formato estándar de almacenamiento e intercambio de información, generándose los metadatos correspondientes. Se desarrollan asimismo técnicas para la mejora de los procedimientos de captura y procesado de los datos, de forma que se minimicen los errores y se disponga de estimaciones fiables de los mismos. El hecho de que toda la información se integre en un sistema de información geográfica (una vez producida la normalización e inventariado de la misma) permite su consulta rápida y ágil por terceros. Además, hace posible efectuar sobre ella una serie de operaciones conducentes a la obtención de nuevas capas de información. El análisis de estos nuevos datos permite explicar el comportamiento pasado de los glaciares objeto de estudio y proporciona elementos esenciales para la simulación de su comportamiento futuro. ABSTRACT Glacier thermo-mechanical models are defined by systems of partial differential equations stating the basic principles of conservation of mass, momentum and energy, accompanied by a constitutive principle that defines the relationship between the stresses acting on the ice and the resulting deformations. The solution of these equations requires an accurate definition of the model domain (the geometry of the glacier, obtained from topographical and ground penetrating radar measurements), as well as a set of boundary conditions, which are obtained from measurements of the variables involved and define a set of geospatial data. The main objective of this thesis is to develop tools able to provide an accurate definition of the glacier geometry and getting a proper set of values for the variables to be used as boundary conditions of our problem. With the above aim, this thesis focuses on the collection, compilation and study of the geospatial data existing for the Hurd Peninsula on Livingston Island, Antarctica, generated since 1957 to present, into a geographic information system. The correct handling and processing of these data results on a new collection of elements that allow us to numerically model the present state and the future evolution of Hurd Peninsula glaciers. First, a complete inventory of geospatial data is developed and the captured data are processed, with the aim of establishing a reference system common to all collections of data. All data are stored under a common standard format, and the corresponding metadata are generated to facilitate the information exchange. We also develop techniques for the improvement of the procedures used for capturing and processing the data, such that the errors are minimized and better estimated. All information is integrated into a geographic information system (once produced the standardization and inventory of it). This allows easy and fast viewing and consulting of the data by third parties. Also, it is possible to carry out a series of operations leading to the production of new layers of information. The analysis of these new data allows to explain past glacier behavior, and provides essential elements for explaining its future evolution.

Modelling of landslides propagation with SPH : effects of rheology and pore water pressure

El estudio desarrollado en este trabajo de tesis se centra en la modelización numérica de la fase de propagación de los deslizamientos rápidos de ladera a través del método sin malla Smoothed Particle Hydrodynamics (SPH). Este método tiene la gran ventaja de permitir el análisis de problemas de grandes deformaciones evitando operaciones costosas de remallado como en el caso de métodos numéricos con mallas tal como el método de los Elementos Finitos. En esta tesis, particular atención viene dada al rol que la reología y la presión de poros desempeñan durante estos eventos. El modelo matemático utilizado se basa en la formulación de Biot-Zienkiewicz v - pw, que representa el comportamiento, expresado en términos de velocidad del esqueleto sólido y presiones de poros, de la mezcla de partículas sólidas en un medio saturado. Las ecuaciones que gobiernan el problema son: • la ecuación de balance de masa de la fase del fluido intersticial, • la ecuación de balance de momento de la fase del fluido intersticial y de la mezcla, • la ecuación constitutiva y • una ecuación cinemática. Debido a sus propiedades geométricas, los deslizamientos de ladera se caracterizan por tener una profundidad muy pequeña frente a su longitud y a su anchura, y, consecuentemente, el modelo matemático mencionado anteriormente se puede simplificar integrando en profundidad las ecuaciones, pasando de un modelo 3D a 2D, el cual presenta una combinación excelente de precisión, sencillez y costes computacionales. El modelo propuesto en este trabajo se diferencia de los modelos integrados en profundidad existentes por incorporar un ulterior modelo capaz de proveer información sobre la presión del fluido intersticial a cada paso computacional de la propagación del deslizamiento. En una manera muy eficaz, la evolución de los perfiles de la presión de poros está numéricamente resuelta a través de un esquema explicito de Diferencias Finitas a cada nodo SPH. Este nuevo enfoque es capaz de tener en cuenta la variación de presión de poros debida a cambios de altura, de consolidación vertical o de cambios en las tensiones totales. Con respecto al comportamiento constitutivo, uno de los problemas principales al modelizar numéricamente deslizamientos rápidos de ladera está en la dificultad de simular con la misma ley constitutiva o reológica la transición de la fase de iniciación, donde el material se comporta como un sólido, a la fase de propagación donde el material se comporta como un fluido. En este trabajo de tesis, se propone un nuevo modelo reológico basado en el modelo viscoplástico de Perzyna, pensando a la viscoplasticidad como a la llave para poder simular tanto la fase de iniciación como la de propagación con el mismo modelo constitutivo. Con el fin de validar el modelo matemático y numérico se reproducen tanto ejemplos de referencia con solución analítica como experimentos de laboratorio. Finalmente, el modelo se aplica a casos reales, con especial atención al caso del deslizamiento de 1966 en Aberfan, mostrando como los resultados obtenidos simulan con éxito estos tipos de riesgos naturales. The study developed in this thesis focuses on the modelling of landslides propagation with the Smoothed Particle Hydrodynamics (SPH) meshless method which has the great advantage of allowing to deal with large deformation problems by avoiding expensive remeshing operations as happens for mesh methods such as, for example, the Finite Element Method. In this thesis, special attention is given to the role played by rheology and pore water pressure during these natural hazards. The mathematical framework used is based on the v - pw Biot-Zienkiewicz formulation, which represents the behaviour, formulated in terms of soil skeleton velocity and pore water pressure, of the mixture of solid particles and pore water in a saturated media. The governing equations are: • the mass balance equation for the pore water phase, • the momentum balance equation for the pore water phase and the mixture, • the constitutive equation and • a kinematic equation. Landslides, due to their shape and geometrical properties, have small depths in comparison with their length or width, therefore, the mathematical model aforementioned can then be simplified by depth integrating the equations, switching from a 3D to a 2D model, which presents an excellent combination of accuracy, computational costs and simplicity. The proposed model differs from previous depth integrated models by including a sub-model able to provide information on pore water pressure profiles at each computational step of the landslide's propagation. In an effective way, the evolution of the pore water pressure profiles is numerically solved through a set of 1D Finite Differences explicit scheme at each SPH node. This new approach is able to take into account the variation of the pore water pressure due to changes of height, vertical consolidation or changes of total stress. Concerning the constitutive behaviour, one of the main issues when modelling fast landslides is the difficulty to simulate with the same constitutive or rheological model the transition from the triggering phase, where the landslide behaves like a solid, to the propagation phase, where the landslide behaves in a fluid-like manner. In this work thesis, a new rheological model is proposed, based on the Perzyna viscoplastic model, thinking of viscoplasticity as the key to close the gap between the triggering and the propagation phase. In order to validate the mathematical model and the numerical approach, benchmarks and laboratory experiments are reproduced and compared to analytical solutions when possible. Finally, applications to real cases are studied, with particular attention paid to the Aberfan flowslide of 1966, showing how the mathematical model accurately and successfully simulate these kind of natural hazards.

Modelización de la rotura y fluidificación en geomateriales y geoestructuras

La rotura de las geoestructuras puede ser causada por cambios en las tensiones efectivas debidos bien por cargas externas (terremotos, por ejemplo), bien por variación de las presiones intersticiales (lluvia), o cambios en la geometría (erosión), así como por una disminución de las propiedades resistentes de los materiales (meteorización, ataque químico, etc). El caso particular de los deslizamientos es interesante, existiendo diversas clasificaciones que tienen en cuenta su forma, velocidad de propagación, etc. Dos de estos casos son los deslizamientos propiamente dichos y los flujos. En el primer caso, la deformación se concentra en zonas de pequeño espesor, que se idealiza como una superficie (superficie de rotura). La cinemática de esta rotura se puede considerar como el movimiento relativo de dos masas cuyas deformaciones no son grandes. Este mecanismo está usualmente asociado a materiales sobreconsolidados que presentan reblandecimiento. Los flujos se producen generalmente en materiales de baja densidad y estructura metaestable, con tendencia a compactar, de forma que se generan presiones intersticiales que aumentan el ángulo de rozamiento movilizado, pudiéndose llegar en algunos casos a la licuefacción. Este mecanismo de rotura se conoce como rotura difusa, y no ha sido tan estudiado como el de localización a pesar de se trata frecuentemente de roturas de tipo catastrófico. De hecho, el suelo pasa de un estado sólido a un estado fluidificado, con una gran movilidad. Es importante para el ingeniero predecir tanto el comportamiento de las geoestructuras bajo las cargas de cálculo como las condiciones en las que se producirá la rotura. De esta manera, en algunos casos, se podrán reforzar las zonas más débiles aumentando así su seguridad. En otros casos, no se podrá realizar este refuerzo (grandes deslizamientos como avalanchas, lahares, etc), pero sí se podrán conocer las consecuencias de la rotura: velocidad de propagación, alcance, espesores, etc. La modelización de estos problemas es compleja, ya que aparecen dificultades en los modelos matemáticos, constitutivos o reológicos y numéricos. Dado que en los geomateriales aparece una interacción fuerte entre el esqueleto sólido y los fluidos intersticiales, esto debe ser tenido en cuenta en los modelos matemáticos. En este trabajo se describirán, pues, el desarrollo y aplicación de técnicas avanzadas de modelización; matemática, constitutiva/reológica y numérica. Se dedicará especial atención a los problemas de transición entre suelos y suelos fluidificados, que hoy en día se estudian en una gran mayoría de los casos con modelos diferentes. Así por ejemplo, se emplean modelos constitutivos para el comportamiento previo a la rotura, y reológicos para los materiales fluidificados. En lo que respecta a los modelos matemáticos, existen formulaciones nuevas en velocidades (o desplazamientos), tensiones, y presiones de aire y agua intersticial, de los que se pueden obtener modelos simplificados integrados en profundidad para deslizamientos rápidos. Respecto de los modelos constitutivos, es interesante la teoría de la Plasticidad Generalizada (modelo básico de Pastor-Zienkiewicz y extensiones a suelos no saturados). Se estudiará la extensión de estos modelos elastoplásticos a la viscoplasticidad (Perzyna y consistente), explorando la posibilidad de emplearlos tanto antes como después de la rotura. Finalmente, en lo que a modelos numéricos se refiere, se describirá la implementación de los modelos matemáticos y constitutivos desarrollados en (i) modelos clásicos de elementos finitos, como el GeHoMadrid desarrollado en los grupo investigador M2i al que pertenece el autor de este trabajo, (ii) Métodos de tipo Taylor Galerkin, y (iii) métodos sin malla como el SPH y el Material Point Model. Estos modelos se aplicarán, principalmente a (i) Licuefacción de estructuras cimentadas en el fondo marino (ii) presas de residuos mineros (iii) deslizamientos rápidos de laderas.

Expresión de la resistencia en plantas de tomate a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica)

La resistencia genética mediada por los genes R es uno de los sistemas de defensa de las plantas frente a patógenos y se activa una vez que los patógenos han superado la defensa basal que otorgan la cutícula y pared celular. Los mecanismos de resistencia genética se inician a su vez, por el reconocimiento de productos derivados de genes de avirulencia de los patógenos (avr) por parte de las proteínas R. Tanto la respuesta de defensa basal como la respuesta de defensa por genes R están influenciadas por patrones de regulación hormonal, que incluye a las principales hormonas vegetales ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET). En tomate (Solanum lycopersicum) uno de los genes R es el gen MiG1, que confiere resistencia a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica, M. incognita y M. arenaria). Uno de los eventos más importantes que caracterizan a la respuesta de resistencia es la reacción hipersensible (HR), que está mediada por la activación temprana de una serie de sistemas enzimáticos, entre los que destaca el de las peroxidasas (PRXs) Clase III. Su función es importante tanto para limitar el establecimiento y expansión del nematodo, al generar ambientes altamente tóxicos por su contribución en la producción masiva de ROS, como por su implicación en la síntesis y depósito de lignina generando barreras estructurales en el sitio de infección. Además de estos mecanismos de defensa asociados a la resistencia constitutiva, las plantas pueden desarrollar resistencia sistémica adquirida (SAR) que en la naturaleza ocurre, en ocasiones, en una fase posterior a que la planta haya sufrido el ataque de un patógeno. Así mismo hay diferentes productos de origen químico como el benzotiadiazol o BTH (ácido S-metil benzol-(1,2,3)-tiadiozole-7-carbónico ester) que pueden generar esta misma respuesta SAR. Como resultado, la planta adquiere resistencia sistémica frente a nuevos ataques de patógenos. En este contexto, el presente trabajo aborda en primer lugar el análisis comparativo, mediante microarrays de oligonucleótidos, de los transcriptomas de los sistemas radicales de plantas de tomate de 8 semanas de edad de dos variedades, una portadora del gen de resistencia MiG1 (Motelle) y otra carente del mismo y, por tanto, susceptible (Moneymaker), antes y después de la infección por M. javanica. Previo a la infección se observó que la expresión de un gran número de transcritos era más acusada en la variedad resistente que en la susceptible, entre ellos el propio gen MiG1 o los genes PrG1 (o P4), LEJA1 y ER24, lo que indica que, en ausencia de infección, las rutas hormonales del SA, JA y ET están más activas en la raíz de la variedad resistente. Por el contrario, un número mucho menor de transcritos presentaban su expresión más reducida en Motelle que en Moneymaker, destacando un gen de señalización para sintetizar la hormona giberelina (GA). La infección por M. javanica causa importantes cambios transcripcionales en todo el sistema radical que modifican sustancialmente las diferencias basales entre plantas Motelle y Moneymaker, incluida la sobreexpresión en la variedad resistente de los transcritos de MiG1, que se reduce parcialmente, mientras que las rutas hormonales del SA y el JA continuan más activas que en la susceptible (evidente por los genes PrG1 y LEJA1). Además, los cambios asociados a la infección del nematodo se evidencian por las grandes diferencias entre los dos tiempos post-infección considerados, de tal forma que en la fase temprana (2 dpi) de la interacción compatible predomina la sobreexpresión de genes de pared celular y en la tardía (12 dpi) los relacionados con el ARN. En el análisis de la interacción incompatible, aunque también hay muchas diferencias entre ambas fases, hay que destacar la expresión diferencial común de los genes loxA y mcpi (sobrexpresados) y del gen loxD (reprimido) por su implicación en defensa en otras interacciones planta-patógeno. Cabe destacar que entre las interacciones compatible e incompatible hubo muy pocos genes en común. En la etapa temprana de la interacción compatible destacó la activación de genes de pared celular y la represión de la señalización; en cambio, en la interacción incompatible hubo proteínas principalmente implicadas en defensa. A los 12 días, en la interacción compatible los genes relacionados con el ARN y la pared celular se sobreexpresaban principalmente, y se reprimían los de proteínas y transporte, mientras que en la incompatible se sobreexpresaron los relacionados con el estrés, el metabolismo secundario y el de hormonas y se reprimieron los de ARN, señalización, metabolismo de hormonas y proteínas. Por otra parte, la técnica de silenciamiento génico VIGS reveló que el gen TGA 1a está implicado en la resistencia mediada por el gen MiG1a M. javanica. Así mismo se evaluó el transcriptoma de todo el sistema radical de la variedad susceptible tras la aplicación del inductor BTH, y se comparó con el transcriptoma de la resistente. Los resultados obtenidos revelan que el tratamiento con BTH en hojas de Moneymaker ejerce notables cambios transcripcionales en la raíz; entre otros, la activación de factores de transcripción Myb (THM16 y THM 27) y del gen ACC oxidasa. Las respuestas inducidas por el BTH parecen ser de corta duración ya que no hubo transcritos diferenciales comunes a las dos fases temporales de la infección comparadas (2 y 12 dpi). El transcriptoma de Moneymaker tratada con BTH resultó ser muy diferente al de la variedad resistente Motelle, ambas sin infectar, destacando la mayor expresión en el primero del gen LeEXP2, una expansina relacionada con defensa frente a nematodos. Las respuestas inducidas por los nematodos en Moneymaker-BTH también fueron muy distintas a las observadas previamente en la interacción incompatible mediada por MiG1, pues sólo se detectaron 2 genes sobreexpresados comunes a ambos eventos. Finalmente, se abordó el estudio de la expresión diferencial de genes que codifican PRXs y su relación con la resistencia en la interacción tomate/M. javanica. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio del análisis del transcriptoma de tomate de la interacción compatible, obtenido en un estudio previo a partir de tejido radical infectado en distintos tiempos de infección. Se han identificado 16 unigenes de PRXs con expresión diferencial de los cuales 15 se relacionan por primera vez con la respuesta a la infección de nematodos. La mayoría de los genes de PRXs identificados, 11, aparecen fuertemente reprimidos en el sitio de alimentación, en las células gigantes (CG). Dada la implicación directa de las PRXs en la activación del mecanismo de producción de ROS, la supresión de la expresión génica local de genes de PRXs en el sitio de establecimiento y alimentación pone de manifiesto la capacidad del nematodo para modular y superar la respuesta de defensa de la planta de tomate en la interacción compatible. Posteriormente, de estos genes identificados se han elegido 4: SGN-U143455, SGN-U143841 y SGN-U144042 reprimidos en el sitio de infección y SGN-U144671 inducido, cuyos cambios de expresión se han determinado mediante análisis por qRT-PCR y de hibridación in situ en dos tiempos de infección (2 dpi y 4 dpi) y en distintos tejidos radicales de tomate resistente y susceptible. Los patrones de expresión obtenidos demuestran que en la interacción incompatible la transcripción global de los 4 genes estudiados se dispara en la etapa más temprana en el sitio de infección, detectándose la localización in situ de transcritos en el citoplasma de las células corticales de la zona meristemática afectadas por el nematodo. A 4 dpi se observó que los niveles de expresión en el sitio de infección cambian de tendencia y los genes SGN-U144671 y SGN-U144042 se reprimen significativamente. Los diferentes perfiles de expresión de los genes PRXs en los dos tiempos de infección sugieren que su inducción en las primeras 48 horas es crucial para la respuesta de defensa relacionada con la resistencia frente a la invasión del nematodo. Por último, al analizar el tejido radical sistémico, se detectó una inducción significativa de la expresión en la fase más tardía de la infección del gen SGN-U144042 en el genotipo susceptible y del SGN-U143841 en ambos genotipos. En este estudio se describe por primera vez la inducción de la expresión sistémica de genes de PRXs en tomate durante la interacción compatible e incompatible con M. javanica lo que sugiere su posible implicación funcional en la respuesta de defensa SAR activada por la infección previa del nematodo. ABSTRACT Plants defend themselves from pathogens by constitutive and/or induced defenses. A common type of induced defense involves plant resistance genes (R), which are normally activated in response to attack by specific pathogen species. Typically, a specific plant R protein recognizes a specific pathogen avirulence (avr) compound. This initiates a complex biochemical cascade inside the plant that results in synthesis of antipathogen compounds. This response can involve chemical signaling, transcription, translation, enzymes and metabolism, and numerous plant hormones such as salicylic acid (SA), jasmonates (JA) and ethylene (ET). Induced plant defense can also activate Class III peroxidases (PRXs), which produce reactive oxygen species (ROS), regulate extracellular H2O2, and play additional roles in plant defense. R-gene activation and the resulting induced defense often remain localized in the specific tissues invaded by the plant pathogen. In other cases, the plant responds by signaling the entire plant to produce defense compounds (systemic induction). Plant defense can also be induced by the exogenous application of natural or synthetic elicitors, such as benzol-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothionic acid. There is much current scientific interest in R-genes and elicitors, because they might be manipulated to increase agricultural yield. Scientists also are interested in systemic induction, because this allows the entire plant to be defended. In this context, one of the aims of this investigation was the transcriptoma analysis of the root systems of two varieties of tomato, the resistant variety (Motelle) that carrier MiG1 and the susceptible (Moneymaker) without MiG1, before and after infection with M. javanica. The overexpression was more pronounced in the transcriptoma of the resistant variety compared with susceptible, before infection, including the MiG1 gene, PrG1 (or P4) genes, LEJA1 and ER24, indicating that hormone SA, JA and ET are active in the resistant variety. Moreover, GA hormone presents an opposite behavior. M. javanica infection causes significant transcriptional changes in both compatible (Moneymaker-M. javanica) and incompatible (Motelle-M. javanica) interaction. In the incompatible transcriptome root system, was notably reduced the expression of the MiG1 gene, and a continuity in the expression of the hormonal pathways of SA and JA. In other hand, transcriptional profile changes during compatible interaction were associated with nematode infection. The large differences between the two times point infection considered (2 dpi and 12 dpi) indicates an overexpression of cell wall related genes in the first phase, and conversely an overexpression of RNA genes in the late phase. Transcriptoma analysis of incompatible interaction, although there were differences between the two phases, should be highlighted the common differential gene expression: loxA and mcpi (overexpressed) and loxD gene (suppressed), as they are involved in defenses in other plant-pathogen interactions. The VIGS tool has provided evidence that TGA 1a is involved in MiG1 mediated resistance to M. javanica. Likewise, the systemic application of BTH was assessed and compared with susceptible and resistant variety. Root system transcriptoma of BTH treatment on leaves showed the activation of Myb transcription factors (THM16 and THM27), the ACC oxidase gene. and the LeEXP2 gene, encoding for an expansin enzyme, related with defense against nematodes. The activation appears to be reduced by subsequent infection and establishment of nematodes. To assist in elucidate the role of tomato PRXs in plant defence against M. javanica, the transcriptome obtained previously from isolated giant cells (GC) and galls at 3 and 7 dpi from the compatible interaction was analysed. A total of 18 different probes corresponding to 16 PRX encoding genes were differentially expressed in infection site compared to the control uninfected root tissues. Most part of them (11) was down-regulated. These results yielded a first insight on 15 of the PRX genes responding to tomato–Meloidogyne interaction and confirm that repression of PRX genes might be crucial for feeding site formation at the initial stages of infection. To study the involvement of PRX genes in resistance response, four genes have been selected: SGN-U143455, SGN-U143841 and SGN-U144042 consistently down-regulated and SGN-U144671 consistently up-regulated at infection site in compatible interaction. The expression changes were determined by qRT-PCR and in situ location at 2 dpi and 4 dpi, and in different root tissues of resistant and susceptible plants. Early upon infection (2 dpi), the transcripts levels of the four genes were strongly increased in infected tissue of resistant genotype. In situ hybridization showed transcript accumulation of them in meristem cortical cells, where the nematode made injury. The results obtained provide strong evidence that early induction of PRX genes is important for defence response of the resistance against nematode invasion. Moreover, the induction patterns of SGN-U144042 gene observed at 4 dpi in distal noninfected root tissue into the susceptible genotype and of SGN-U143841 gene in both genotypes suggest a potential involvement of PRX in the systemic defence response.

Functional characterization of YODA, a mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) that regulates a novel innate immunity pathway in Arabidopsis thaliana

Las cascadas de señalización mediadas por proteína quinasas activadas por mitógeno (MAP quinasas) son capaces de integrar y transducir señales ambientales en respuestas celulares. Entre estas señales se encuentran los PAMPs/MAMPs (Pathogen/Microbe-Associated Molecular Patterns), que son moléculas de patógenos o microorganismos, o los DAMPs (Damaged-Associated Molecular Patterns), que son moléculas derivadas de las plantas producidas en respuesta a daño celular. Tras el reconocimiento de los PAMPs/DAMPs por receptores de membrana denominados PRRs (Pattern Recognition Receptors), como los receptores con dominio quinasa (RLKs) o los receptores sin dominio quinasa (RLPs), se activan respuestas moleculares, incluidas cascadas de MAP quinasas, que regulan la puesta en marcha de la inmunidad activada por PAMPs (PTI). Esta Tesis describe la caracterización funcional de la MAP quinasa quinasa quinasa (MAP3K) YODA (YDA), que actúa como un regulador clave de la PTI en Arabidopsis. Se ha descrito previamente que YDA controla varios procesos de desarrollo, como la regulación del patrón estomático, la elongación del zigoto y la arquitectura floral. Hemos caracterizado un alelo mutante hipomórfico de YDA (elk2 o yda11) que presenta una elevada susceptibilidad a patógenos biótrofos y necrótrofos. Notablemente, plantas que expresan una forma constitutivamente activa de YDA (CA-YDA), con una deleción en el dominio N-terminal, presentan una resistencia de amplio espectro frente a diferentes tipos de patógenos, incluyendo hongos, oomicetos y bacterias, lo que indica que YDA juega un papel importante en la regulación de la resistencia de las plantas a patógenos. Nuestros datos indican que esta función es independiente de las respuestas inmunes mediadas por los receptores previamente caracterizados FLS2 y CERK1, que reconocen los PAMPs flg22 y quitina, respectivamente, y que están implicados en la resistencia de Arabidopsis frente a bacterias y hongos. Hemos demostrado que YDA controla la resistencia frente al hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina y el patrón estomático mediante su interacción genética con la RLK ERECTA (ER), un PRR implicado en la regulación de estos procesos. Por el contrario, la interacción genética entre ER y YDA en la regulación de otros procesos de desarrollo es aditiva en lugar de epistática. Análisis genéticos indicaron que MPK3, una MAP quinasa que funciona aguas abajo de YDA en el desarrollo estomático, es un componente de la ruta de señalización mediada por YDA para la resistencia frente a P. cucumerina, lo que sugiere que el desarrollo de las plantas y la PTI comparten el módulo de transducción de MAP quinasas asociado a YDA. Nuestros experimentos han revelado que la resistencia mediada por YDA es independiente de las rutas de señalización reguladas por las hormonas de defensa ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido abscísico o etileno, y también es independiente de la ruta de metabolitos secundarios derivados del triptófano, que están implicados en inmunidad vegetal. Además, hemos demostrado que respuestas asociadas a PTI, como el aumento en la concentración de calcio citoplásmico, la producción de especies reactivas de oxígeno, la fosforilación de MAP quinasas y la expresión de genes de defensa, no están afectadas en el mutante yda11. La expresión constitutiva de la proteína CA-YDA en plantas de Arabidopsis no provoca un aumento de las respuestas PTI, lo que sugiere la existencia de mecanismos de resistencia adicionales regulados por YDA que son diferentes de los regulados por FLS2 y CERK1. En línea con estos resultados, nuestros datos transcriptómicos revelan una sobre-representación en plantas CA-YDA de genes de defensa que codifican, por ejemplo, péptidos antimicrobianos o reguladores de muerte celular, o proteínas implicadas en la biogénesis de la pared celular, lo que sugiere una conexión potencial entre la composición e integridad de la pared celular y la resistencia de amplio espectro mediada por YDA. Además, análisis de fosfoproteómica indican la fosforilación diferencial de proteínas relacionadas con la pared celular en plantas CA-YDA en comparación con plantas silvestres. El posible papel de la ruta ER-YDA en la regulación de la integridad de la pared celular está apoyado por análisis bioquímicos y glicómicos de las paredes celulares de plantas er, yda11 y CA-YDA, que revelaron cambios significativos en la composición de la pared celular de estos genotipos en comparación con la de plantas silvestres. En resumen, nuestros datos indican que ER y YDA forman parte de una nueva ruta de inmunidad que regula la integridad de la pared celular y respuestas defensivas, confiriendo una resistencia de amplio espectro frente a patógenos. ABSTRACT Plant mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades transduce environmental signals and developmental cues into cellular responses. Among these signals are the pathogen- or microbe-associated molecular patterns (PAMPs or MAMPs) and the damage-associated molecular patterns (DAMPs). These PAMPs/DAMPs, upon recognition by plant pattern recognition receptors (PRRs), such as Receptor-Like Kinases (RLKs) and Receptor-Like Proteins (RLPs), activate molecular responses, including MAPK cascades, which regulate the onset of PAMP-triggered immunity (PTI). This Thesis describes the functional characterization of the MAPK kinase kinase (MAP3K) YODA (YDA) as a key regulator of Arabidopsis PTI. YDA has been previously described to control several developmental processes, such as stomatal patterning, zygote elongation and inflorescence architecture. We characterized a hypomorphic, non-embryo lethal mutant allele of YDA (elk2 or yda11) that was found to be highly susceptible to biotrophic and necrotrophic pathogens. Remarkably, plants expressing a constitutive active form of YDA (CA-YDA), with a deletion in the N-terminal domain, showed broad-spectrum resistance to different types of pathogens, including fungi, oomycetes and bacteria, indicating that YDA plays a relevant function in plant resistance to pathogens. Our data indicated that this function is independent of the immune responses regulated by the well characterized FLS2 and CERK1 RLKs, which are the PRRs recognizing flg22 and chitin PAMPs, respectively, and are required for Arabidopsis resistance to bacteria and fungi. We demonstrate that YDA controls resistance to the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina and stomatal patterning by genetically interacting with ERECTA (ER) RLK, a PRR involved in regulating these processes. In contrast, the genetic interaction between ER and YDA in the regulation of other ER-associated developmental processes was additive, rather than epistatic. Genetic analyses indicated that MPK3, a MAP kinase that functions downstream of YDA in stomatal development, also regulates plant resistance to P. cucumerina in a YDA-dependent manner, suggesting that the YDA-associated MAPK transduction module is shared in plant development and PTI. Our experiments revealed that YDA-mediated resistance was independent of signalling pathways regulated by defensive hormones like salicylic acid, jasmonic acid, abscisic acid or ethylene, and of the tryptophan-derived metabolites pathway, which are involved in plant immunity. In addition, we showed that PAMP-mediated PTI responses, such as the increase of cytoplasmic Ca2+ concentration, reactive oxygen species (ROS) burst, MAPK phosphorylation, and expression of defense-related genes are not impaired in the yda11 mutant. Furthermore, the expression of CA-YDA protein does not result in enhanced PTI responses, further suggesting the existence of additional mechanisms of resistance regulated by YDA that differ from those regulated by the PTI receptors FLS2 and CERK1. In line with these observations, our transcriptomic data revealed the over-representation in CA-YDA plants of defensive genes, such as those encoding antimicrobial peptides and cell death regulators, and genes encoding cell wall-related proteins, suggesting a potential link between plant cell wall composition and integrity and broad spectrum resistance mediated by YDA. In addition, phosphoproteomic data revealed an over-representation of genes encoding wall-related proteins in CA-YDA plants in comparison with wild-type plants. The putative role of the ER-YDA pathway in regulating cell wall integrity was further supported by biochemical and glycomics analyses of er, yda11 and CA-YDA cell walls, which revealed significant changes in the cell wall composition of these genotypes compared with that of wild-type plants. In summary, our data indicate that ER and YDA are components of a novel immune pathway that regulates cell wall integrity and defensive responses, which confer broad-spectrum resistance to pathogens.

Factores anatómicos, dendrométricos y climáticos implicados en la producción de resina de Pinus pinaster AIT. : aplicación a la mejora de los métodos de resinación

Pinus pinaster Ait. es la conífera con mayor área de distribución en la Península Ibérica y es, a día de hoy, la única especie resinada en nuestro país. La inducción del flujo de resina al exterior para su recolección a través de distintos tipos de heridas ha sido practicada desde hace miles de años por distintas culturas. En todos los casos, las técnicas desarrolladas se basan en la estimulación del característico sistema de defensa de las pináceas. En los últimos siete años se viene observando una tendencia de incremento sustancial de la superficie resinada en España, acompañada por avances tecnológicos dirigidos a la mecanización y mejora de estimulantes. El aprovechamiento resinero se perfila como un sector estratégico en la generación de empleo rural y la conservación de ecosistemas. La industria resinera demanda métodos de extracción más eficaces, una selvicultura adecuada y actualizada, y condiciones laborales de los resineros más dignas con objeto de llegar a ser competitiva en el mercado internacional. Este trabajo se centra en ampliar el conocimiento sobre el sistema de defensa de P. pinaster, concretamente sobre las estructuras y procesos que pueden afectar a la producción de resina. Se analizan las relaciones entre las características anatómicas del xilema, destacando las relacionadas con los canales resiníferos, las variables dendrométricas y dasométricas de la masa y el flujo de resina (objetivo 1). Se estudia cómo estas relaciones son moduladas por las heridas de resinación dependiendo de la técnica de resinación aplicada (objetivo 2), el clima y el balance hídrico del suelo (objetivo 3). El material vegetal, las muestras de suelo y los datos de producción de resina y climáticos usados en esta tesis han sido recogidos en tres montes de utilidad pública; MUP 101 en Armuña, MUP 108 en Melque de Cercos y MUP 117 en Nieva (en esta última solo se recogieron los datos de producciones), todos ellos pinares monoespecíficos de P. pinaster localizados en la denominada Tierra de Pinares Segoviana. En los árboles de nuestro estudio se han aplicado cuatro métodos de resinación: método de pica de corteza con estimulante y método mecanizado con estimulante, ambos en sentido ascendente y descendente. En los trabajos realizados para el análisis de la influencia de la anatomía constitutiva en la producción de resina (objetivo 1) y el efecto del clima (objetivo 3), se obtuvieron muestras del xilema de 26 árboles resinados en Melque de Cercos y Armuña y 12 árboles control sin resinar. Para caracterizar los pies estudiados, se midió la altura, diámetro normal y porcentaje de copa viva. Las muestras de tejido fueron recogidas en una zona del tronco a una distancia del límite de la herida considerada en la bibliografía como no afectada (anatomía constitutiva). Para el análisis de las alteraciones anatómicas inducidas por la herida (objetivo 2), se recogieron muestras en ocho de los individuos en los que se habían realizado los distintos métodos de resinación descritos y en cinco árboles control. Se obtuvieron ocho muestras de tejido distribuidas en la parte superior, inferior, lateral y centro de la herida de cada uno de los árboles resinados. Para establecer las diferencias en la producción de resina según el método de resinación, se analizaron las producciones de 561 árboles resinados en 2012 con estos cuatro métodos en Nieva. Los principales resultados de estos trabajos muestran que la producción de resina está ligada al volumen de canales (axiales y radiales) y a la frecuencia de canales radiales existentes en el árbol antes de efectuar ninguna herida (sistema constitutivo). De esta manera, los árboles grandes productores de resina mostraron una red de canales más densa que aquellos con producciones medias. Una vez realizada la herida de resinación, observamos una disminución del ancho del anillo de crecimiento y del tamaño medio de los canales axiales a la vez que se incrementaba la frecuencia y área ocupada por mm2 de anillo de estos canales. Estos cambios perduraron en el árbol durante al menos tres años y fueron distintos dependiendo de la localización en el entorno de la herida y del método de resinación. Las respuestas más intensas a la herida se observaron el año siguiente a la realización de la misma, en dirección axial, para las distancias más próximas al límite de la herida y para los métodos de resinación en sentido ascendente. Además, se ha constatado que como consecuencia de las heridas de resinación se produjeron cambios en la anatomía del xilema en zonas alejadas de la herida, tanto en el año de la herida como años posteriores. Es decir, se observó una respuesta sistémica del árbol. Respecto al papel del clima como regulador de la respuesta del árbol, se ha evidenciado que la temperatura, la radiación y la ETP influyeron en la producción de resina, no solo durante la campaña de resinación, sino también durante los meses anteriores. El déficit hídrico favoreció la producción y la formación de canales axiales pero, a partir de un determinado umbral, esa relación se invirtió y las lluvias estivales incrementaron la producción. Algunas de estas variables climáticas se asociaron a cambios en el tamaño y frecuencia de las estructuras secretoras, las cuales posiblemente modulan la respuesta defensiva de la planta. La dendrometría del árbol (evaluada a través del diámetro normal, altura y porcentaje de copa viva), la densidad de la masa y el tipo de suelo influyeron en el potencial de producción de resina de P. pinaster. Árboles más vigorosos, parcelas con menores densidades y suelos con más capacidad para la retención de agua y nutrientes presentaron producciones mayores. Estos trabajos se complementan en anexos con una caracterización del sistema socio-ecológico del pinar en resinación. En ese trabajo se identifican sus potenciales servicios ecosistémicos y se evalúa su grado de vinculación con el aprovechamiento resinero con objeto de valorar su funcionalidad y aproximar una valoración económica de modo que sea posible apreciar la importancia económica de los mismos. Para concluir, podemos resaltar que son necesarios más trabajos de carácter científico para avanzar en la comprensión de los procesos anatómicos y fisiológicos que regulan la secreción de resina en P. pinaster y sus interacciones con el medio. Esto permitiría avances certeros hacia el desarrollo de métodos de extracción más eficaces, una selvicultura óptima, el reconocimiento de los beneficios socio-ecológicos y económicos del aprovechamiento y, de manera general, una bibliografía amplia y fiable para la consulta y desarrollo de futuras mejoras que posibiliten la reactivación y conservación de la resinación como aprovechamiento rentable. ABSTRACT Pinus pinaster Ait. is the most widespread conifer in Spain and is now the only species tapped for its oleoresin. External induction of resin secretion, based on the defense system of Pinus trees, has been performed by humans since Classical times through various methods. The socio-economic implication of this practice in Spain justifies a new approach to improve tapping methodology and understand the effects of this activity on the tree. In the last five years, sharp increases in the price of natural resins, accompanied by technological advances directed toward mechanization, have made resin tapping a strategic activity for rural development and forest conservation. The resin industry demands more efficient tapping methods and forest management plans as a way to increase competitiveness in a global market. In this way, this work focuses on the study of the defense system of P. pinaster, with the aim to understand the effects of anatomical and physiological characteristics and environmental conditions on resin yield. The relationships between anatomical variables -with special focus on resin canals-, dendrometric and dasometric variables, and resin yield will be evaluated (objective 1). The tapping wound effects (objective 2) and the intra- and inter-annual variability of climate conditions and soil water availability influence (objective 3) on resin yield will be also studied. The plant and soil material and the resin yield and climatic data used in this thesis have been collected in stands of three public forests of P. pinaster; Armuña, Melque de Cercos and Nieva, located in Segovia (Central Spain). Trees were tapped using two different methods: mechanized or traditional tool, in both upwards and downwards direction. Twenty-six tapped trees of contrasting resin yield classes and twelve non-tapped (control) trees, growing in two locations (Armuña y Melque de Cercos) with the same climate but different stand density and soil characteristics, were selected for studying the role of tree size, xylem anatomy at distal parts aside from the tapping wound (objective 1) and climate influence (objective 3) on resin yield. Concerning the tree defenses induced by the tapping wound (objective 2), the xylem of eight trees, tapped with the two described methods in both upwards and downwards direction, were analyzed. From each tapped tree, eight cores were collected at different locations and varying distances from the tapping wound. In each core, a histological analysis was made. Growth ring width, earlywood and latewood width, and axial canal frequency, area, mean size and location were measured. The effect of the tapping method on resin yield was assessed in 561 P. pinaster tapped trees in a stand in Nieva. In tissues not affected by the tapping wound, the frequency of radial resin canals and the total volume of resin canals were related to resin yield. The frequency of radial canals and the resin yield were strongly related to tree diameter and percentage of live crown. High area of axial resin canals per mm2 was related to high yielding trees, but only in the location with higher plant density and poorer soil quality. In tapped trees, an increase in axial canal frequency and area was found during the three years following the start of tapping activity, suggesting that canal formation is a systemic induced response to wounding. The highest mean annual resin yield was found using the traditional tool in upwards direction, which also induced the highest increase in axial canal frequency and area. The lowest yield was found for mechanized tapping, which showed no differences between the upwards and downwards directions. The strongest induction of systemic induced responses in terms of resin canal frequency and area was detected one year after tapping for upwards tapping. This suggests the involvement of signaling processes that spread mainly upwards, and the importance of adaptive processes as a defense against periodic insect attacks. Intra-annual variation in resin yield was strongly correlated with temperature, solar radiation, potential evapotranspiration and soil water deficit. Inter-annual variation in resin yield and resin canal abundance were correlated with temperature and water deficit in spring, but above a certain threshold of cumulated water deficit in summer rainfall favored resin yield. Under adverse climate scenarios where resource optimization is desirable, a reduced tapping season during the warmest months (June–September) would be advisable, assuming a very small production loss relative to traditional tapping season. Similarly, in years with a rainy summer and/or dry spring, a slightly longer tapping season could be suggested, as resin yield increases after these events. Tree diameter and percentage of live crown, and radial resin canal frequency could be useful criteria for estimating resin yields in P. pinaster. Vigorous trees in lower density stands and growing up in good quality soils will be the most productive. These conclusions could be applied to improve tapping management and breeding programs. These works are complemented with socio-ecological characterization, the identification of the main ecosystem services and an assessment of the possible economic impact derived from the tapping practice. To conclude, more scientific studies are necessary for understanding the anatomical and physiological processes behind resin synthesis and their interactions with the environment. This would afford further progresses towards an extensive and reliable bibliography and improved tapping methods and optimal selvicultural guide lines.