Effects of increasing levels of pea hulls in the diet on productive performance, development of the gastrointestinal tract, and nutrient retention of broilers from one to eighteeen days of age

The effects of inclusion of pea hulls (PH) in the diet on growth performance, development of the gastrointestinal tract and nutrient retention were studied in broilers from 1 to 18d of age. There were a control diet based on low fibre ingredients (69.3 total dietary fibre (16.1g crude fibre/kg)) and three additional diets that resulted from the dilution of the basal diet with 25, 50 and 75g PH/kg (81.2, 93.2, and 105.1g total dietary fibre/kg diet, respectively). Each treatment was replicated six times and the experimental unit was a cage with 12 chicks. Growth performance, development of the gastrointestinal tract and the coefficients of total tract apparent retention (CTTAR) of nutrients were recorded at 6, 12 and 18d of age. In addition, jejunal morphology was measured at 12 and 18d and the coefficients of apparent ileal digestibility (CAID) of nutrients at 18d of age. Pea hulls inclusion affected all the parameters studied. The inclusion of 25 and 50g PH/kg diet improved growth performance as compared to the control diet. The relative weight (g/kg body weight) of proventriculus (P≤0.01), gizzard (P≤0.001) and ceca (P≤0.05) increased linearly as the level of PH in the diet increased. The inclusion of PH affected quadratically (P≤0.01) villus height:crypt depth ratio with the highest value shown at 25g PH/kg. In general, the CTTAR and CAID of nutrients increased linearly and quadratically (P≤0.05) with increasing levels of PH, showing maximum values with PH level between 25 and 50g/kg diet. We conclude that the size of the digestive organs increases with increasing levels of PH in the diet. In general, the best performance and nutrient digestibility values were observed with levels of PH within the range of 25 and 50g/kg. Therefore, young broilers have a requirement for a minimum amount of dietary fibre. When pea hulls are used as a source of fibre, the level of total dietary fibre required for optimal performance is within the range of 81.2–93.2g/kg diet (25.6–35.0g crude fibre/kg diet). An excess of total dietary fibre (above 93.2g/kg diet) might reduce nutrient digestibility and growth performance to values similar to those observed with the control diet.

Estructura de una red esencial de señalización que regula la homeostasis iónica en plantas

Las plantas son organismos sésiles que han desarrollado la capacidad para detectar variaciones sutiles en su ambiente y producir respuestas adaptativas mediante rutas de señalización. Los estímulos causados por el estrés biótico y abiótico son numerosos y dependiendo del tiempo de exposición y su intensidad, pueden reducir la tasa de crecimiento de las plantas y la producción. Los cambios en la concentración del calcio citosólico libre constituyen una de las primeras reacciones intracelulares a las situaciones de estrés abiótico. En esta situación, el calcio actúa como segundo mensajero y las variaciones en su concentración son descodificadas por proteínas de unión a calcio. Las más conocidas son las manos-EF y los dominios C2. Los dominios C2 han sido descritos como dominios de unión a lípidos dependientes de calcio. Estos dominios se consideran proteínas periféricas solubles en agua que se asocian de manera reversible a los lípidos de la membrana mediante una o dos regiones funcionales: el sitio de unión a calcio y el sitio polibásico. A pesar de que se conoce la estructura molecular de algunos dominios C2, se desconocen aspectos relacionados como las reglas que dirigen su forma de interaccionar con los diferentes fosfolípidos y proteínas, la posición que ocupan en la bicapa lipídica y su papel en la transmisión de señales. En esta tesis se ha estudiado una proteína de Arabidopsis thaliana (At3g17980) representativa de una nueva familia de proteínas con dominios C2, que consiste únicamente de un dominio C2. Esta proteína, llamada AtC2.1, ha sido clonada en el vector pETM11, expresada en E. coli y purificada a homogeneidad en dos pasos cromatográficos. Se obtuvieron cristales de AtC2.1 de buena calidad mediante técnicas de difusión de vapor. La proteína fue co-cristalizada con calcio, fosfocolina (POC) y el fosfolípido 1,2-dihexanoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (PSF). Se recogieron ocho conjuntos de datos de difracción de rayos X empleando radiación sincrotrón. Los cristales difractaron hasta 1.6 Å de resolución. Siete de ellos pertenecían al grupo ortorrómbico P212121, con las dimensiones de la celdilla unidad a = 35.3, b = 88.9, c = 110.6 Å, y un cristal pertenecía al grupo espacial monoclínico C2, con a = 124.84, b = 35.27, c = 92.32 Å y = 121.70º. La estructura se resolvió mediante la técnica MR-SAD utilizando el cinc como dispersor anómalo. La estructura cristalina mostró que la molécula forma un dímero en el que cada protómero se pliega como un dominio C2 típico, con la topología tipo II y presenta una inserción de 43 aminoácidos que la diferencia de los dominios C2 conocidos. El mapa de densidad electrónica mostró dos átomos de calcio por protómero. Se resolvieron las estructuras de AtC2.1 en complejo con POC o PSF. En ambos complejos, el análisis cristalográfico detectó máximos de densidad electrónica en la región correspondiente al sitio polibásico formado por las hebras 2, 3 5 y el lazo 3. Éstos se interpretaron correctamente como dos moléculas de POC y un átomo de cinc, en un complejo, y como la cabeza polar del PSF en el otro. AtC2.1 define un sitio de interacción con lípidos dependiente de cinc. En conclusión, en este trabajo se presenta la estructura tridimensional de AtC2.1, miembro representativo de una familia de proteínas de Arabidopsis thaliana, identificadas como proteínas que interaccionan con los receptores de ABA. Estas proteínas están constituidas únicamente por un dominio C2. El análisis conjunto de los datos biofísicos y cristalográficos muestra que AtC2.1 es un sensor de calcio que une lípidos usando dos sitios funcionales. Estos datos sugieren un mecanismo de inserción en membrana dependiente de calcio que trae consigo la disociación de la estructura dimérica y, por consiguiente, un cambio en las propiedades de superficie de la molécula. Este mecanismo proporciona las bases del reconocimiento y transporte de los receptores de ABA y/o otras moléculas a la membrana celular. Plants are sessile organisms that have developed the capacity to detect slight variations of their environment. They are able to perceive biotic and abiotic stress signals and to transduce them by signaling pathways in order to trigger adaptative responses. Stress factors are numerous and, depending on their exposition time and their concentration, can reduce plant growth rate, limiting the productivity of crop plants. Changes in the cytosolic free calcium concentration are observed as one of the earliest intracellular reactions to abiotic stress signals. Calcium plays a key role as a second messenger, and calcium concentration signatures, called calcium signals, are decodified by calcium binding proteins. The main calcium binding structures are the EF-hand motif and the C2 domains. C2 domain is a calcium dependent lipid-binding domain of approximately 130 amino acids. C2 domain displays two functional regions: the Ca-binding region and the polybasic cluster. Both of them can interact with the membrane phospholipids. Despite the number of C2 domain 3D structures currently available, questions about how they interact with the different target phospholipids, their precise spatial position in the lipid bilayer, interactions with other proteins and their role in transmitting signals downstream, have not yet been explored. In this work we have studied an uncharacterized protein from Arabidopsis thaliana (At3g17980) consisting of only a single C2 domain, as member of a new protein C2-domain family. This protein called AtC2.1 was cloned into the pETM11 vector and expressed in E. coli, allowing the purification to homogeneity in two chromatographic steps. Good quality diffracting crystals were obtained using vapor-diffusion techniques. Crystals were co-crystalized with calcium; phosphocholine (POC) and/or the phospholipid 1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (PSF). Eight data set were collected with synchrotron radiation. Crystals diffracted up to 1.6 Å resolution and seven of them belong to the orthorhombic space group P212121, with unit-cell parameters a = 35.3, b = 88.9, c = 110.6 Å. Another crystal was monoclinic, space group C2, with a = 124.84, b = 35.27, c = 92.32 Å and = 121.70º. The structural model was solved by MR-SAD using Zn2+ as anomalous scatterer. The crystal structure shows that the molecule is a dimer. Each monomer was folded as a canonical C2 domain with the topology II with a 43 residues insertion. The electron density map reveals two calcium ions per molecule. Structures of AtC2.1, complexed with POC and PSF, have been solved. Well-defined extra electron densities were found, in both complexes, within the concave surface formed by strands 2, 3, 5 and loop 3 of AtC2.1. These densities were clearly explained by the presence of the two POC molecules, one zinc atom and head groups of PSF, occupying the cavity of the polybasic site. AtC2.1 defines a new metal dependent lipid-binding site into the polybasic site. In conclusion, in this thesis it is presented the molecular structure of AtC2.1, a representative member of a family of Arabidopsis thaliana C2 domain proteins, of unknown function, but identified as a molecular interacting unit of the ABA receptors. The joint analyses of the biophysical and crystallographic data show that AtC2.1 is a calcium sensor that binds lipids in two sites and suggest a model of calcium-dependent membrane insertion mechanism that will involve either dimer dissociation or a strong rearrangement of the dimeric structure. This mechanism may be the basis for the recognition and delivery of ABA receptors or other protein molecules to cell membranes.

Molecular basis of salt tolerance in Physcomitrella Patens model plant: potassium homeostasis and physiological roles of chx transporters

El suelo salino impone un estrés abiótico importante que causa graves problemas en la agricultura ya que la mayoría de los cultivos se ven afectados por la salinidad debido a efectos osmóticos y tóxicos. Por ello, la contaminación y la escasez de agua dulce, la salinización progresiva de tierras y el aumento exponencial de la población humana representan un grave problema que amenaza la seguridad alimentaria mundial para las generaciones futuras. Por lo tanto, aumentar la tolerancia a la salinidad de los cultivos es un objetivo estratégico e ineludible para garantizar el suministro de alimentos en el futuro. Mantener una óptima homeostasis de K+ en plantas que sufren estrés salino es un objetivo importante en el proceso de obtención de plantas tolerantes a la salinidad. Aunque el modelo de la homeostasis de K+ en las plantas está razonablemente bien descrito en términos de entrada de K+, muy poco se sabe acerca de los genes implicados en la salida de K+ o de su liberación desde la vacuola. En este trabajo se pretende aclarar algunos de los mecanismos implicados en la homeostasis de K+ en plantas. Para ello se eligió la briofita Physcomitrella patens, una planta no vascular de estructura simple y de fase haploide dominante que, entre muchas otras cualidades, hacen que sea un modelo ideal. Lo más importante es que no sólo P. patens es muy tolerante a altas concentraciones de Na+, sino que también su posición filogenética en la evolución de las plantas abre la posibilidad de estudiar los cambios claves que, durante el curso de la evolución, se produjeron en las diversas familias de los transportadores de K+. Se han propuesto varios transportadores de cationes como candidatos que podrían tener un papel en la salida de K+ o su liberación desde la vacuola, especialmente miembros de la familia CPA2 que contienen las familias de transportadores KEA y CHX. En este estudio se intenta aumentar nuestra comprensión de las funciones de los transportadores de CHX en las células de las plantas usando P. patens, como ya se ha dicho. En esta especie, se han identificado cuatro genes CHX, PpCHX1-4. Dos de estos genes, PpCHX1 y PpCHX2, se expresan aproximadamente al mismo nivel que el gen PpACT5, y los otros dos genes muestran una expresión muy baja. La expresión de PpCHX1 y PpCHX2 en mutantes de Escherichia coli defectivos en el transporte de K+ restauraron el crecimiento de esta cepa en medios con bajo contenido de K+, lo que viii sugiere que la entrada de K+ es energizada por un mecanismo de simporte con H+. Por otra parte, estos transportadores suprimieron el defecto asociado a la mutación kha1 en Saccharomyces cerevisiae, lo que sugiere que podrían mediar un antiporte en K+/H+. La proteína PpCHX1-GFP expresada transitoriamente en protoplastos de P. patens co-localizó con un marcador de Golgi. En experimentos similares, la proteína PpCHX2-GFP localizó aparentemente en la membrana plasmática y tonoplasto. Se construyeron las líneas mutantes simples de P. patens ΔPpchx1 y ΔPpchx2, y también el mutante doble ΔPpchx2 ΔPphak1. Los mutantes simples crecieron normalmente en todas las condiciones ensayadas y mostraron flujos de entrada normales de K+ y Rb+; la mutación ΔPpchx2 no aumentó el defecto de las plantas ΔPphak1. En experimentos a largo plazo, las plantas ΔPpchx2 mostraron una retención de Rb+ ligeramente superior que las plantas silvestres, lo que sugiere que PpCHX2 promueve la transferencia de Rb+ desde la vacuola al citosol o desde el citosol al medio externo, actuando en paralelo con otros transportadores. Sugerimos que transportadores de K+ de varias familias están involucrados en la homeostasis de pH de orgánulos ya sea mediante antiporte K+/H+ o simporte K+-H+.ix ABSTRACT Soil salinity is a major abiotic stress causing serious problems in agriculture as most crops are affected by it. Moreover, the contamination and shortage of freshwater, progressive land salinization and exponential increase of human population aggravates the problem implying that world food security may not be ensured for the next generations. Thus, a strategic and an unavoidable goal would be increasing salinity tolerance of plant crops to secure future food supply. Maintaining an optimum K+ homeostasis in plants under salinity stress is an important trait to pursue in the process of engineering salt tolerant plants. Although the model of K+ homeostasis in plants is reasonably well described in terms of K+ influx, very little is known about the genes implicated in K+ efflux or release from the vacuole. In this work, we aim to clarify some of the mechanisms involved in K+ homeostasis in plants. For this purpose, we chose the bryophyte plant Physcomitrella patens, a nonvascular plant of simple structure and dominant haploid phase that, among many other characteristics, makes it an ideal model. Most importantly, not only P. patens is very tolerant to high concentrations of Na+, but also its phylogenetic position in land plant evolution opens the possibility to study the key changes that occurred in K+ transporter families during the course of evolution. Several cation transporter candidates have been proposed to have a role in K+ efflux or release from the vacuole especially members of the CPA2 family which contains the KEA and CHX transporter families. We intended in this study to increase our understanding of the functions of CHX transporters in plant cells using P. patens, in which four CHX genes have been identified, PpCHX1-4. Two of these genes, PpCHX1 and PpCHX2, are expressed at approximately the same level as the PpACT5 gene, but the other two genes show an extremely low expression. PpCHX1 and PpCHX2 restored growth of Escherichia coli mutants on low K+-containing media, suggesting they mediated K+ uptake that may be energized by symport with H+. In contrast, these genes suppressed the defect associated to the kha1 mutation in Saccharomyces cerevisiae, which suggest that they might mediate K+/H+ antiport. PpCHX1-GFP protein transiently expressed in P. patens protoplasts co-localized with a Golgi marker. In similar experiments, the PpCHX2-GFP protein appeared to localize to tonoplast and plasma x membrane. We constructed the ΔPpchx1 and ΔPpchx2 single mutant lines, and the ΔPpchx2 ΔPphak1 double mutant. Single mutant plants grew normally under all the conditions tested and exhibited normal K+ and Rb+ influxes; the ΔPpchx2 mutation did not increase the defect of ΔPphak1 plants. In long-term experiments, ΔPpchx2 plants showed a slightly higher Rb+ retention than wild type plants, which suggests that PpCHX2 mediates the transfer of Rb+ from either the vacuole to the cytosol or from the cytosol to the external medium in parallel with other transporters. We suggest that K+ transporters of several families are involved in the pH homeostasis of organelles by mediating either K+/H+ antiport or K+-H+ symport.

Factores nutricionales que influyen sobre las variables productivas y el desarrollo del tracto gastrointestinal en pollitas comerciales rubias = Nutritional factors affecting productive performance and gastrointestinal tract traits in commercial brown-egg laying pullets

El objetivo general de esta Tesis doctoral fue estudiar la influencia de diversos factores nutricionales sobre los parámetros productivos y el desarrollo del tracto digestivo de pollitas rubias destinadas a la producción de huevos comerciales. Para alcanzar este objetivo se realizaron tres experimentos donde se estudió el cereal principal, el tamaño de partícula del cereal y el nivel de energía y la presentación de los piensos. En el experimento 1 se estudió la influencia del cereal (piensos con enzimas) y la presentación del pienso sobre los parámetros productivos y las características del tracto digestivo en 576 pollitas rubias de 1 a 120 d de edad. De 1 a 45 d de la edad, se utilizaron 4 piensos experimentales organizados de forma factorial con 2 cereales al 50% de inclusión (maíz vs. trigo) y 2 presentaciones del pienso (harina vs. gránulo de 2- mm de diámetro). Cada tratamiento se replicó 6 veces (24 pollitas por réplica). De 46 a 120 d de edad todas las dietas (maíz o trigo) se ofrecieron en harina y por tanto, la única diferencia entre tratamientos fue el cereal utilizado. De 1 a 120 d de edad, las pollitas que recibieron los piensos basados en maíz tuvieron una ganancia de peso vivo (PV) superior (P < 0,05) que las que recibieron los piensos basados en trigo, pero el índice de conversión (IC) fue similar para ambos grupos. De 1 a 45 d de edad, las pollitas alimentadas con gránulo consumieron más pienso (P < 0,001) y tuvieron una ganancia de peso superior (P < 0,001) que las pollitas alimentadas con harina. Gran parte de los efectos beneficiosos de la granulación sobre los parámetros productivos se mantuvieron al final de la prueba (120 d de edad). A los 45 d de edad, el peso relativo de la molleja (PR; g/kg PV) fue superior (P < 0,01) en pollitas alimentadas con maíz que en pollitas alimentadas con trigo. La alimentación en gránulo redujo el PR del tracto gastro intestinal (TGI) y de la molleja (P < 0,001), así como la longitud relativa (LR; cm/kg PV) del intestino delgado (P< 0.01) a ambas edades (45 y 120 d de edad). El tipo de cereal utilizado no afectó al pH del contenido de la molleja a 120 d de edad pero fué inferior (P < 0,01) en las pollitas que recibieron el pienso en harina de 1 a 45 d de la edad que en las que recibieron el pienso en gránulo. Se concluye que el trigo puede substituir al maíz en piensos para pollitas si se acepta una ligera reducción en la ganancia de peso. Asímismo, la alimentación en gránulo de 1 a 45 d de edad aumentó la ganancia de peso a esta edad y al final de la prueba, así como el pH de la molleja a 120 d de edad. La presentación del pienso en gránulo redujo el PR de la molleja y la LR del TGI a 120 d de edad. En el experimento 2 se utilizaron un total de 864 pollitas rubias Hy-Line de 1 d de edad para estudiar la influencia del cereal de la dieta (500 g de maíz o trigo/kg) y el tamaño de partícula del mismo (molienda con molino de martillos con un diámetro de criba de 6, 8, o 10-mm) sobre los parámetros productivos y las características del TGI de 1 a 120 d de edad. Cada uno de los 6 tratamientos se replicó 6 veces (24 pollitas por réplica). De 1 a 45 d de edad, la ganancia de PV aumentó (P< 0,001) y el IC se mejoró (P < 0,05) al reducir el tamaño de partícula del cereal, pero no se observaron diferencias en el periodo crecimiento de 45 a 120 d de edad. A los 45 d de vida, las pollitas alimentadas con maíz tendieron (P < 0,10) a tener un mayor PR del TGI y del proventrículo y una mayor LR del intestino delgado que las pollitas alimentadas con trigo. Asímismo, el PR del TGI a esta edad, aumentó (P < 0,05) a medida que aumentaba el tamaño de partícula del cereal utilizado. A los 120 d de edad, el tratamiento no afectó el PR de ninguno de los órganos del TGI ni al pH de la molleja. Sin embargo, la LR del intestino delgado fue superior (P < 0,05) para las pollitas alimentadas con trigo que para las pollitas alimentadas con maíz. La LR del TGI se redujó (P < 0,05) al aumentar el tamaño de partícula del cereal. Se concluye que el trigo puede incluirse 500 g/kg en piensos de pollitas de 1 a 120 días de edad y que el tamaño de partícula de los cereales afecta el crecimiento de las pollitas durante los primeros 45 d de vida, pero no después. Por lo tanto, se recomienda moler el cereal utilizado al inicio del período de recría (1 a 45 d de edad) con una criba de diámetro igual o inferior a 8 mm. En el experimento 3 se utilizaron un total de 1.152 pollitas rubias Hy-Line de 1 d de edad para estudiar la influencia del nivel de energía de la dieta y la presentación del pienso sobre la productividad y las características del TGI. De 1 a 45 d de edad se utilizaron 6 piensos organizados de forma factorial con 3 concentraciones energéticas (baja: 11,44 MJ; media: 12,05 MJ y alta: 12,66 MJ/kg) y 2 presentaciones del pienso (harina vs. gránulo). De 45 a 120 d todos los piensos experimentales se suministraron en forma de harina y por tanto, la única diferencia entre tratamientos fue el nivel de EMAn utilizado. Cada uno de los 6 tratamientos se replicó 8 veces y la unidad experimental fue la jaula con 24 pollitas. De 1 a 120 d de edad, la ganancia de PV y el IC mejoraron a medida que aumentó la EMAn del pienso (P < 0,001). Las pollitas alimentadas con gránulo de 1 a 45 d de edad comieron mas y tuvieron una ganancia de peso superior (P < 0,001) que las alimentadas con harina. En el global de la prueba, la ganancia de PV fue mayor (P < 0,01) para las pollitas alimentadas con piensos en gránulo. A los 45 d de edad, el PR de todos los segmentos del TGI estudiados fue inferior para las pollitas alimentadas con piensos de alta energía que para las pollitas alimentadas con piensos de media o baja energía. A 120 d de edad, el PR de la molleja fue superior (P < 0,01) para las pollitas alimentadas con piensos de baja energía que con los otros piensos. Sin embargo, la LR del TGI no se vió afectada por el nivel de energía de los piensos. A los 45 d de edad, la alimentación con gránulo redujo el PR del proventrículo (P < 0,05), de la molleja (P < 0,001) y del TGI (P < 0.001), así como la LR del intestino delgado (P < 0,05) y de los ciegos (P < 0,001). A pesar de que las pollitas solo recibieron los piensos en gránulo durante los primeros 45 d de vida, la alimentación con gránulos redujo el PR de la molleja y del proventrículo a 120 d de edad. Se concluye que la alimentación con gránulos durante los primeros 45 d de vida mejora el consumo de pienso y el PV de las pollitas a 120 d de edad. Un aumento del nivel de energía de la dieta de 12,0 a 12,7 MJ/kg mejora los parámetros productivos de 1 a 120 d de edad pero reduce el tamaño del proventrículo y de la molleja. En base de estos resultados concluimos que maíz y trigo con enzimas pueden utilizarse indistintamente en piensos para pollitas de 1 a 120 d de edad con sólo una ligera disminución del PV final con trigo. La granulación y la reducción del tamaño de partícula del cereal del pienso de primera edad (1 a 45 d de vida) y el uso de piensos de alta densidad energética, mejoran los PV a 120 d de edad. Por lo tanto, es recomendable moler los cereales con cribas de no más de 8-mm de diámetro. También, la granulación del pienso y el uso de piensos de alta energía (pobres en fibra bruta) pueden reducir el desarrollo del TGI especialmente de la molleja, lo que puede perjudicar el consumo posterior de pienso durante el inicio del ciclo de puesta. ABSTRACT The general objective of this Thesis was to study the effect of different nutritional factors on productive performance and the development of the gastrointestinal tract (GIT) of commercial brown egg-laying pullets from 1 to 120 d of age. In this respect, the influence of type and particle size of the cereal, and feed form, and energy content of the die,t were studied in 3 experiments. In experiment 1, the influence of the main cereal and feed form of the diet on performance and GIT traits was studied in 576 brown-egg laying pullets from 1 to 120 d of age. From 1 to 45 d of age, 4 diets arranged factorially with 2 cereals (maize vs. wheat) and 2 feed forms (mash vs. pellets) were used. Each treatment was replicated 6 times (24 pullets per replicate). From 46 to 120 d of age, all diets were offered in mash form and therefore, the only difference among diets was the cereal used. Cumulatively, pullets fed the maize diets had higher body weight (BW) gain (P< 0.05) but similar feed conversion ratio (FCR) than pullets fed the wheat diets. From 1 to 45 d of age, pullets fed pellets consumed more feed (P < 0.001) and had higher BW gain (P < 0.001) than pullets fed mash. Most of the beneficial effects of pelleting on productive performance of the birds were still evident at 120 d of age. At 45 d of age, gizzard relative weight (RW; g/kg BW) was higher (P < 0.01) in pullets fed maize than in pullets fed wheat. Feeding pellets reduced the RW of the GIT and the gizzard (P < 0.001) as well as the relative length (RL; cm/kg BW) of the small intestine (SI, P < 0.01) at both ages. The pH of the gizzard contents at 120 d of age was not affected by the main cereal of the diet, but was lower in pullets fed mash from 1 to 45 d of age (P < 0.01) than in pullets fed pellets. We conclude that wheat supplemented with enzymes can be used in substitution of maize in pullet diets with only a slight reduction in BW gain at 120 d of age. Also, feeding pellets from 1 to 45 d of age increased BW gain and pH of the gizzard, and reduced the RW of the gizzard and the RL of the GIT at 120 d of age. In experiment 2, a total of 864 brown-egg laying pullets was used to study the effects of the main cereal of the diet (500 g maize or wheat/kg) and particle size of the cereal (hammer milled to pass through a 6, 8, and 10-mm screen) on growth performance and GIT traits from 1 to 120 d of age. Each of the 6 treatments was replicated 6 times (24 pullets per replicate). Type of cereal did not affect pullet performance at any age. From 1 to 45 d of age, BW gain was increased (P < 0.001) and FCR was improved (P < 0.05) as the particle size of the cereal was reduced, but no effects were observed after this age. At 45 d of age, pullets fed maize tended (P < 0.10) to have a heavier RW of the GIT and proventriculus and a higher relative length (RL, cm/kg BW) of the SI than pullets fed wheat. Also at this age, the RW of the GIT increased (P < 0.05) with increases in particle size of the cereal. At 120 d of age, dietary treatment did not affect the RW of any of the organs studied or gizzard pH, but the RL of the SI was higher (P < 0.05) for pullets fed wheat than for pullets fed maize. Also, the RL of the SI was reduced (P < 0.05) as the particle size of the cereal increased. We conclude that 500 g wheat/kg can be included in pullet feeds from 1 to 120 d of age, and that particle size of the cereal affects pullet performance during the first 45 d of life but not thereafter. Therefore, it is recommended to grind the cereal used in this period with a screen size of no more than 8-mm. In experiment 3, a total of 1,152 one-day-old Hy-Line Brown egg laying pullets were used to study the influence of the energy content of the diet and feed form on productive performance and on several GIT traits. From 1 to 45 d of age, there were 6 diets arranged factorially with 3 concentrations of AMEn (low: 11.66 MJ/kg, medium: 12.05 MJ/kg and high: 12.66 MJ/kg) of the diet and 2 feed forms (mash vs. pellets). From 45 to 120 d all diets were fed in mash form and therefore, the only difference among treatments in this period was the energy content of the diets. Each of the 6 treatments was replicated 8 times and the experimental unit was formed by 24 pullets. Cumulatively, BW gain and FCR improved as the AMEn of the diet increased (P < 0.001). Also, pullets fed pellets from 1 to 45 d of age had higher feed intake and BW gain (P < 0.001) in this period and higher cumulative BW gain (P < 0.01) than pullets fed mash. At 45 d of age, the RWof all the segments of the GIT was lower for pullets fed the high- than for pullets fed the medium- or low- energy diets. At 120 d of age, the RW of the gizzard was higher (P < 0.01) for pullets fed the low energy diets than for pullets fed the other diets. However, the RL of the GIT was not affected by the energy content of the diet. Feeding pellets reduced the RW of the proventriculus (P < 0.05), gizzard (P < 0.001), and GIT (P < 0.001), as well as the RL of the small intestine (P < 0.05) and the ceaca (P < 0.001) at 45 d of age. The effects of feeding pellets on RW of gizzard and proventriculus were still evident at 120 d of age. We concluded that feeding pellets from 1 to 45 d of age improved feed intake and BW of pullets at 120 d of age and that an increase in the energy content of the diet increased pullet performance at all ages but reduced the RW of the proventriculus and gizzard. We conclude that maize and wheat can be used indistinctly in diets for egg laying pullets from 1 to 120 d of age, with only a slight reduction in final BW when wheat is used. Also, particle size of the cereal affects pullet performance during the first 45 d of life but not thereafter. Pelleting of the feeds, and grinding the cereal with a screen size of no more than 8-mm from 1 to 45 d of age, and the use of high density energy diets are recommended in order to achieve adequate target BW at 120 d of age. However, pelleting of the feed, very fine grinding, and the use of high AMEn diets might hinder the development of the GIT, especially that of the gizzard, which might affect feed intake of laying hens especially at the beginning of the production cycle.

Transport of Pru p 3 across gastrointestinal epithelium - an essential step towards the induction of food allergy?

Background Since intestinal absorption of food protein can trigger an allergic reaction, the effect of plant food allergen on intestinal epithelial cell permeability and its ability to cross the epithelial monolayer was evaluated. Objective To study the interaction of Pru p 3 with intestinal epithelium, its natural entrance, analyzing transport kinetics and cellular responses that trigger. Methods This was achieved using Pru p 3, the peach LTP, as a model. Enterocytic monolayers were established by culturing Caco 2 cells, as a model of enterocytes, on permeable supports that separate the apical and basal compartments. Pru p 3 was added to the apical compartment, the transepithelial resistance (TEER) was measured, and the transport was quantified. Results The peach allergen that crossed the cell monolayer was detected in the cell fraction and in the basal medium by immunodetection with specific antibodies and the quantity was measured by ELISA assay. Pru p 3 was able to cross the monolayer without disturbing the integrity of the tight junctions. This transport was significantly higher than that of a non-allergenic peach LTP, LTP1, and occurred via lipid raft pathway. The incubation of Caco 2 cells with Pru p 3 and LTP1 produced the expression of epithelial-specific cytokines TSLP, IL33 and IL25. Conclusion These results suggest that Pru p 3 was able to cross the cell monolayer by the transcellular route and then induce the production of Th2 cytokines. The results of the present study represent a step towards clarifying the importance of Pru p 3 as a sensitizer. Clinical relevance The capacity of food allergens to cross the intestinal monolayer could explain their high allergenic capacity and its fast diffusion through the body associating to severe symptoms.

Análisis molecular de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel y eficiencia simbiótica en Rhizobium leguminosarum

Los suelos ultramáficos, que poseen elevadas concentraciones de níquel, cobalto y cromo de manera natural, son fuente de bacterias resistentes a altas concentraciones de metales. Se realizó la caracterización físico-química de seis suelos ultramáficos del suroeste europeo, seleccionándose un suelo de la región de Gorro, Italia, como el más adecuado para aislar bacterias endosimbióticas resistentes a metales. A partir de plantas-trampa de guisante y lenteja inoculados con suspensiones de ese suelo, se obtuvieron 58 aislados de Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) que fueron clasificados en 13 grupos según análisis de PCR-RAPDs. Se determinó la resistencia a cationes metálicos [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] de una cepa representante de cada grupo, así como la secuencia de los genomas de las cepas que mostraron altos niveles (UPM1137 y UPM1280) y bajos niveles (UPM1131 y UPM1136) de tolerancia a metales. Para identificar mecanismos de resistencia a metales se realizó una mutagénesis al azar en dicha cepa mediante la inserción de un minitransposón. El análisis de 4313 transconjugantes permitió identificar 14 mutantes que mostraron una mayor sensibilidad a Ni(II) que la cepa silvestre. Se determinó el punto de inserción del minitransposón en todos ellos y se analizaron en más detalle dos de los mutantes (D2250 y D4239). En uno de los mutantes (D2250), el gen afectado codifica para una proteína que presenta un 44% de identidad con dmeF (divalent efflux protein) de Cupriavidus metallidurans. Cadena arriba de dmeF se identificó un gen que codifica una proteína con un 39% de identidad con el regulador RcnR de Escherichia coli. Se decidió nombrar a este sistema dmeRF, y se generó un mutante en ambos genes en la cepa Rlv SPF25 (Rlv D15). A partir de experimentos de análisis fenotípico y de regulación se pudo demostrar que el sistema dmeRF tiene un papel relevante en la resistencia a Ni(II) y sobre todo a Co(II) en células en vida libre y en simbiosis con plantas de guisante. Ambos genes forman un operón cuya expresión se induce en respuesta a la presencia de Ni(II) y Co(II). Este sistema se encuentra conservado en distintas especies del género Rhizobium como un mecanismo general de resistencia a níquel y cobalto. Otro de los mutantes identificados (D4239), tiene interrumpido un gen que codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC. Aunque inicialmente fue identificado por su sensibilidad a níquel, experimentos posteriores demostraron que su elevada sensibilidad a metales era debida a su sensibilidad al medio TY, y más concretamente a la triptona presente en el medio. En otros medios de cultivo el mutante no está afectado específicamente en su tolerancia a metales. Este mutante presenta un fenotipo simbiótico inusual, siendo inefectivo en guisantes y efectivo en lentejas. Análisis de complementación y de mutagénesis dirigida sugieren que el fenotipo de la mutación podría depender de otros factores distintos del gen portador de la inserción del minitransposón. ABSTRACT Ultramafic soils, having naturally high concentrations of nickel, cobalt and chrome, are potential sources of highly metal-resistant bacteria. A physico-chemical characterization of six ultramafic soils from the European southwest was made. A soil from Gorro, Italy, was chosen as the most appropriated for the isolation of heavy-metal-resistant endosymbiotic bacteria. From pea and lentil trap plants inoculated with soil suspensions, 58 isolates of Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) were obtained and classified into 13 groups based on PCR-RAPDs analysis. The resistance to metallic cations [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] was analyzed in a representative strain of each group. From the results obtained in the resistance assays, the Rlv UPM1137 strain was selected to identify metal resistance mechanism. A random mutagenesis was made in UPM1137 by using minitransposon insertion. Analysis of 4313 transconjugants allowed to identify 14 mutants with higher sensitivity to Ni(II) than the wild type strain. The insertion point of the minitransposon was determined in all of them, and two mutants (D2250 and D4239) were studied in more detail. In one of the mutants (D2250), the affected gene encodes a protein with 44% identity in compared with DmeF (divalent efflux protein) from Cupriavidus metallidurans. Upstream R. leguminosarum dmeF, a gene encoding a protein with 39% identity with RcnR regulator from E. coli was identified. This protein was named DmeR. A mutant with both genes in the dmeRF deleted was generated and characterized in Rlv SPF25 (Rlv D15). From phenotypic and regulation analysis it was concluded that the dmeRF system is relevant for Ni(II) and specially Co(II) tolerance in both free living and symbiotic forms of the bacteria. This system is conserved in different Rhizobium species like a general mechanism for nickel and cobalt resistance. Other of the identified mutants (D4239) contains the transposon insert on a gene that encodes for an AraC-like transcriptional regulator. Although initially this mutant was identified for its nickel sensitivity, futher experiments demonstrated that its high metal sensitivity is due to its sensitivity to the TY medium, specifically for the tryptone. In other media the mutant is not affected specifically in their tolerance to metals. This mutant showed an unusual symbiotic phenotype, being ineffective in pea and effective in lentil. Complementation analysis and directed mutagenesis suggest that the mutation phenotype could depend of other factors different from the insertion minitransposon gene.

Molecular physiology of nickel and cobalt homeostasis in Rhizobium leguminosarum.

Transition metals such as Fe, Cu, Mn, Ni, or Co are essential nutrients, as they are constitutive elements of a significant fraction of cell proteins. Such metals are present in the active site of many enzymes, and also participate as structural elements in different proteins. From a chemical point of view, metals have a defined order of affinity for binding, designated as the Irving-Williams series (Irving and Williams, 1948) Mg2+ menor que Mn2+ menor que Fe2+ menor que Co2+ menor que Ni2+ menor que Cu2+mayor queZn2+ Since cells contain a high number of different proteins harbouring different metal ions, a simplistic model in which proteins are synthesized and metals imported into a ?cytoplasmic soup? cannot explain the final product that we find in the cell. Instead we need to envisage a complex model in which specific ligands are present in definite amounts to leave the right amounts of available metals and protein binding sites, so specific pairs can bind appropriately. A critical control on the amount of ligands and metal present is exerted through specific metal-responsive regulators able to induce the synthesis of the right amount of ligands (essentially metal binding proteins), import and efflux proteins. These systems are adapted to establish the metal-protein equilibria compatible with the formation of the right metalloprotein complexes. Understanding this complex network of interactions is central to the understanding of metal metabolism for the synthesis of metalloenzymes, a key topic in the Rhizobium-legume symbiosis. In the case of the Rhizobium leguminosarum bv viciae (Rlv) UPM791 -Pisum sativum symbiotic system, the concentration of nickel in the plant nutrient solution is a limiting factor for hydrogenase expression, and provision of high amounts of this element to the plant nutrient solution is required to ensure optimal levels of enzyme synthesis (Brito et al., 1994).

Identificación y análisis funcional de genes implicados en la homeostasis de níquel en la bacteria endosimbiótica de leguminosas Rhizobium leguminosarum

La asociación Rhizobium-leguminosa constituye una interacción planta-microorganismo particularmente beneficiosa a nivel medioambiental debido a su capacidad promotora del crecimiento vegetal en condiciones de deficiencia de nitrógeno. Se ha demostrado que una excesiva concentración de metales pesados en el suelo afecta negativamente la competitividad bacteriana y al desarrollo de interacciones diazotróficas eficientes (Chaudri et al., 2000; Pereira et al., 2006). Por otro lado, el suministro de metales como Fe, Mo, Ni o Cu es fundamental para la biosíntesis de enzimas bacterianas relacionadas con el proceso de fijación de nitrógeno que ocurre en el interior de los nódulos de las leguminosas (Moreau et al., 1995). Con objeto de identificar sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel en bacterias endosimbióticas, se ha llevado a cabo una mutagénesis mediante inserción aleatoria de un minitransposón derivado de Tn5 en Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM1137, una cepa capaz de resistir elevadas concentraciones de níquel y cobalto. Como resultado de esta mutagénesis se han obtenido 14 mutantes incapaces de crecer en medios suplementados con NiCl2. La localización de la inserción en estos mutantes muestra que una elevada proporción de los genes afectados codifican proteínas de membrana o proteínas secretadas. En paralelo, se ha obtenido la secuencia del genoma de la cepa UPM1137, lo que permite realizar estudios in silico comparando los genomas disponibles de varias cepas de R. leguminosarum bv. viciae, que presentan una menor sensibilidad a metales. El análisis bioinformático de los genomas secuenciados y la caracterización fenotípica de los mutantes obtenidos permitirá identificar potenciales sistemas de resistencia y su contribución a la homeostasis de metales.

Identification and functional characterization of Rhizobium leguminosarum bv. viciae genetic systems involved in nickel homeostasis.

A collection of Rhizobium leguminosarum bv. viciae strains isolated from ultramafic and contaminated soils in Italy and Germany, respectively, was analyzed for resistance to nickel and cobalt ions. These assays led to the identification of strain UPM1137, which is able to grow at high concentrations of nickel and cobalt. In order to identify genetic systems involved in the homeostasis to these metals, a random mutagenesis was carried out in UPM1137 by inserting a Tn5-derivative minitransposon. As a result 4313 transconjugants were obtained, being 39 of them (0.90%) unable to grow at 1.5 mM NiCl2. The identification of the transposon insertion site in these mutants showed that the disrupted genes encode proteins belonging to different functional categories, where the secreted and membrane proteins were the most numerous. The analysis of heavy metal resistance and phenotypes in symbiotic and free –living cells will define the contribution of these genes to metal homeostasis.

Identificación y caracterización funcional de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel en Rhizobium leguminosarum bv. viciae

La homeostasis de metales como níquel, cobalto, cobre o zinc es un proceso delicado en procariotas. Estos metales de transición son, por un lado imprescindibles para el mantenimiento del metabolismo celular, pero por otro muy tóxicos a elevadas concentraciones. Por este motivo, los microorganismos han desarrollado mecanismos para regular su concentración intracelular, tales como bombas de flujo de metales, secuestradores intra y extracelulares o enzimas detoxificadoras.

Improvement of root architecture under abiotic stress through control of auxin homeostasis in Arabidopsis and Brassica crops

Auxin plays an important role in many aspects of plant development including stress responses. Here we briefly summarize how auxin is involved in salt stress, drought (i.e. mostly osmotic stress), waterlogging and nutrient deficiency in Brassica plants. In addition, some mechanisms to control auxin levels and signaling in relation to root formation (under stress) will be reviewed. Molecular studies are mainly described for the model plant Arabidopsis thaliana, but we also like to demonstrate how this knowledge can be transferred to agriculturally important Brassica species, such as Brassica rapa, Brassica napus and Brassica campestris. Moreover, beneficial fungi could play a role in the adaptation response of Brassica roots to abiotic stresses. Therefore, the possible influence of Piriformospora indica will also be covered since the growth promoting response of plants colonized by P. indica is also linked to plant hormones, among them auxin.