Spatio-temporal dynamics of viruses are differentially affected by parasitoids depending on the mode of transmission by their insect vectors.

Relationships between agents in multitrophic systems are complex and very specific. Insect-transmitted plant viruses are completely dependent on the behaviour and distribution patterns of their vectors. The presence of natural enemies may directly affect aphid behaviour and spread of plant viruses, as the escape response of aphids might cause a potential risk for virus dispersal. The spatio-temporal dynamics of Cucumber mosaic virus (CMV) and Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV), transmitted by Aphis gossypii in a non-persistent and persistent manner, respectively, were evaluated at short and long term in the presence and absence of the aphid parasitoid, Aphidius colemani. SADIE methodology was used to study the distribution patterns of both the virus and its vector, and their degree of association. Results suggested that parasitoids promoted aphid dispersion at short term, which enhanced CMV spread, though consequences of parasitism suggest potential benefits for disease control at long term. Furthermore, A. colemani significantly limited the spread and incidence of the persistent virus CABYV at long term. The impact of aphid parasitoids on the dispersal of plant viruses with different transmission modes is discussed.

Insect growth regulators as potential insecticides to control olive fruit fly (Bactrocera oleae Rossi): insect toxicity bioassays and molecular docking approach

Olive fruit fly, Bactrocera oleae (Rossi), is a key pest in olive orchards, causing serious economic damage. To date, the pest has already developed resistance to the insecticides commonly applied to control it. Thus, in searching for new products for an accurate resistance management programme, targeting the ecdysone receptor (EcR)might provide alternative compounds for use in such programmes. RESULTS: Residual contact and oral exposure in the laboratory of B. oleae adults to the dibenzoylhydrazine-based compounds methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 showed different results. Methoxyfenozide and tebufenozide did not provoke anynegative effectsontheadults,but RH-5849 killed98-100%of the treated insects15 days after treatment. Theligand-binding domain (LBD) of the EcR of B. oleae (BoEcR-LBD) was sequenced, and a homology protein model was constructed. Owing to a restricted extent of the ligand-binding cavity of the BoEcR-LBD, docking experiments with the three tested insecticides showed a severe steric clash in the case of methoxyfenozide and tebufenozide, while this was not the case with RH-5849. CONCLUSION: IGR molecules similar to the RH-5849 molecule, and different from methoxyfenozide and tebufenozide, might have potential in controlling this pest.

Integration of physical, chemical and biological tactics against insect pests and virus diseases in horticultural crops

Actualmente, la gestión de sistemas de Manejo Integrado de Plagas (MIP) en cultivos hortícolas tiene por objetivo priorizar los métodos de control no químicos en detrimento del consumo de plaguicidas, según recoge la directiva europea 2009/128/CE ‘Uso Sostenible de Plaguicidas’ (OJEC, 2009). El uso de agentes de biocontrol como alternativa a la aplicación de insecticidas es un elemento clave de los sistemas MIP por sus innegables ventajas ambientales que se utiliza ampliamente en nuestro país (Jacas y Urbaneja, 2008). En la región de Almería, donde se concentra el 65% de cultivo en invernadero de nuestro país (47.367 ha), MIP es la principal estrategia en pimiento (MAGRAMA, 2014), y comienza a serlo en otros cultivos como tomate o pepino. El cultivo de pepino, con 8.902 ha (MAGRAMA, 2013), tiene un protocolo semejante al pimiento (Robledo et al., 2009), donde la única especie de pulgón importante es Aphis gossypii Glover. Sin embargo, pese al continuo incremento de la superficie de cultivo agrícola bajo sistemas MIP, los daños originados por virosis siguen siendo notables. Algunos de los insectos presentes en los cultivos de hortícolas son importantes vectores de virus, como los pulgones, las moscas blancas o los trips, cuyo control resulta problemático debido a su elevada capacidad para transmitir virus vegetales incluso a una baja densidad de plaga (Holt et al., 2008; Jacas y Urbaneja, 2008). Las relaciones que se establecen entre los distintos agentes de un ecosistema son complejas y muy específicas. Se ha comprobado que, pese a que los enemigos naturales reducen de manera beneficiosa los niveles de plaga, su incorporación en los sistemas planta-insecto-virus puede desencadenar complicadas interacciones con efectos no deseables (Dicke y van Loon, 2000; Jeger et al., 2011). Así, los agentes de biocontrol también pueden inducir a que los insectos vectores modifiquen su comportamiento como respuesta al ataque y, con ello, el grado de dispersión y los patrones de distribución de las virosis que transmiten (Bailey et al., 1995; Weber et al., 1996; Hodge y Powell, 2008a; Hodge et al., 2011). Además, en ocasiones el control biológico por sí solo no es suficiente para controlar determinadas plagas (Medina et al., 2008). Entre los métodos que se pueden aplicar bajo sistemas MIP están las barreras físicas que limitan la entrada de plagas al interior de los invernaderos o interfieren con su movimiento, como pueden ser las mallas anti-insecto (Álvarez et al., 2014), las mallas fotoselectivas (Raviv y Antignus, 2004; Weintraub y Berlinger, 2004; Díaz y Fereres, 2007) y las mallas impregnadas en insecticida (Licciardi et al., 2008; Martin et al., 2014). Las mallas fotoselectivas reducen o bloquean casi por completo la transmisión de radiación UV, lo que interfiere con la visión de los insectos y dificulta o impide la localización del cultivo y su establecimiento en el mismo (Raviv y Antignus, 2004; Weintraub, 2009). Se ha comprobado cómo su uso puede controlar los pulgones y las virosis en cultivo de lechuga (Díaz et al., 2006; Legarrea et al., 2012a), así como la mosca blanca, los trips y los ácaros, y los virus que estos transmiten en otros cultivos (Costa y Robb, 1999; Antignus et al., 2001; Kumar y Poehling, 2006; Doukas y Payne, 2007a; Legarrea et al., 2010). Sin embargo, no se conoce perfectamente el modo de acción de estas barreras, puesto que existe un efecto directo sobre la plaga y otro indirecto mediado por la planta, cuya fisiología cambia al desarrollarse en ambientes con falta de radiación UV, y que podría afectar al ciclo biológico de los insectos fitófagos (Vänninen et al., 2010; Johansen et al., 2011). Del mismo modo, es necesario estudiar la compatibilidad de esta estrategia con los enemigos naturales de las plagas. Hasta la fecha, los estudios han evidenciado que los agentes de biocontrol pueden realizar su actividad bajo ambientes pobres en radiación UV (Chyzik et al., 2003; Chiel et al., 2006; Doukas y Payne, 2007b; Legarrea et al., 2012c). Otro método basado en barreras físicas son las mallas impregnadas con insecticidas, que se han usado tradicionalmente en la prevención de enfermedades humanas transmitidas por mosquitos (Martin et al., 2006). Su aplicación se ha ensayado en agricultura en ciertos cultivos al aire libre (Martin et al., 2010; Díaz et al., 2004), pero su utilidad en cultivos protegidos para prevenir la entrada de insectos vectores en invernadero todavía no ha sido investigada. Los aditivos se incorporan al tejido durante el proceso de extrusión de la fibra y se liberan lentamente actuando por contacto en el momento en que el insecto aterriza sobre la malla, con lo cual el riesgo medioambiental y para la salud humana es muy limitado. Los plaguicidas que se emplean habitualmente suelen ser piretroides (deltametrina o bifentrín), aunque también se ha ensayado dicofol (Martin et al., 2010) y alfa-cipermetrina (Martin et al., 2014). Un factor que resulta de vital importancia en este tipo de mallas es el tamaño del poro para facilitar una buena ventilación del cultivo, al tiempo que se evita la entrada de insectos de pequeño tamaño como las moscas blancas (Bethke y Paine, 1991; Muñoz et al., 1999). Asimismo, se plantea la necesidad de estudiar la compatibilidad de estas mallas con los enemigos naturales. Es por ello que en esta Tesis Doctoral se plantea la necesidad de evaluar nuevas mallas impregnadas que impidan el paso de insectos de pequeño tamaño al interior de los invernaderos, pero que a su vez mantengan un buen intercambio y circulación de aire a través del poro de la malla. Así, en la presente Tesis Doctoral, se han planteado los siguientes objetivos generales a desarrollar: 1. Estudiar el impacto de la presencia de parasitoides sobre el grado de dispersión y los patrones de distribución de pulgones y las virosis que éstos transmiten. 2. Conocer el efecto directo de ambientes pobres en radiación UV sobre el comportamiento de vuelo de plagas clave de hortícolas y sus enemigos naturales. 3. Evaluar el efecto directo de la radiación UV-A sobre el crecimiento poblacional de pulgones y mosca blanca, y sobre la fisiología de sus plantas hospederas, así como el efecto indirecto de la radiación UV-A en ambas plagas mediado por el crecimiento de dichas planta hospederas. 4. Caracterización de diversas mallas impregnadas en deltametrina y bifentrín con diferentes propiedades y selección de las óptimas para el control de pulgones, mosca blanca y sus virosis asociadas en condiciones de campo. Estudio de su compatibilidad con parasitoides. ABSTRACT Insect vectors of plant viruses are the main agents causing major economic losses in vegetable crops grown under protected environments. This Thesis focuses on the implementation of new alternatives to chemical control of insect vectors under Integrated Pest Management programs. In Spain, biological control is the main pest control strategy used in a large part of greenhouses where horticultural crops are grown. The first study aimed to increase our knowledge on how the presence of natural enemies such as Aphidius colemani Viereck may alter the dispersal of the aphid vector Aphis gossypii Glover (Chapter 4). In addition, it was investigated if the presence of this parasitoid affected the spread of aphid-transmitted viruses Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus) and Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV, Polerovirus) infecting cucumber (Cucumis sativus L). SADIE methodology was used to study the distribution patterns of both the virus and its vector, and their degree of association. Results suggested that parasitoids promoted aphid dispersal in the short term, which enhanced CMV spread, though consequences of parasitism suggested potential benefits for disease control in the long term. Furthermore, A. colemani significantly limited the spread and incidence of the persistent virus CABYV in the long term. The flight activity of pests Myzus persicae (Sulzer), Bemisia tabaci (Gennadius) and Tuta absoluta (Meyrick), and natural enemies A. colemani and Sphaerophoria rueppellii (Weidemann) under UV-deficient environments was studied under field conditions (Chapter 5). One-chamber tunnels were covered with cladding materials with different UV transmittance properties. Inside each tunnel, insects were released from tubes placed in a platform suspended from the ceiling. Specific targets were located at different distances from the platform. The ability of aphids and whiteflies to reach their targets was diminished under UV-absorbing barriers, suggesting a reduction of vector activity under this type of nets. Fewer aphids reached distant traps under UV-absorbing nets, and significantly more aphids could fly to the end of the tunnels covered with non-UV blocking materials. Unlike aphids, differences in B. tabaci captures were mainly found in the closest targets. The oviposition of lepidopteran T. absoluta was also negatively affected by a UV-absorbing cover. The photoselective barriers were compatible with parasitism and oviposition of biocontrol agents. Apart from the direct response of insects to UV radiation, plant-mediated effects influencing insect performance were investigated (Chapter 6). The impact of UV-A radiation on the performance of aphid M. persicae and whitefly B. tabaci, and growth and leaf physiology of host plants pepper and eggplant was studied under glasshouse conditions. Plants were grown inside cages covered by transparent and UV-A-opaque plastic films. Plant growth and insect fitness were monitored. Leaves were harvested for chemical analysis. Pepper plants responded directly to UV-A by producing shorter stems whilst UV-A did not affect the leaf area of either species. UV-A-treated peppers had higher content of secondary metabolites, soluble carbohydrates, free amino acids and proteins. Such changes in tissue chemistry indirectly promoted aphid performance. For eggplants, chlorophyll and carotenoid levels decreased with supplemental UVA but phenolics were not affected. Exposure to supplemental UV-A had a detrimental effect on whitefly development, fecundity and fertility presumably not mediated by plant cues, as compounds implied in pest nutrition were unaltered. Lastly, the efficacy of a wide range of Long Lasting Insecticide Treated Nets (LLITNs) was studied under laboratory and field conditions. This strategy aimed to prevent aphids and whiteflies to enter the greenhouse by determining the optimum mesh size (Chapter 7). This new approach is based on slow release deltamethrin- and bifenthrin-treated nets with large hole sizes that allow improved ventilation of greenhouses. All LLITNs produced high mortality of M. persicae and A. gossypii although their efficacy decreased over time with sun exposure. It was necessary a net with hole size of 0.29 mm2 to exclude B. tabaci under laboratory conditions. The feasibility of two selected nets was studied in the field under a high insect infestation pressure in the presence of CMV- and CABYV-infected cucumber plants. Besides, the compatibility of parasitoid A. colemani with bifenthrin-treated nets was studied in parallel field experiments. Both nets effectively blocked the invasion of aphids and reduced the incidence of both viruses, however they failed to exclude whiteflies. We found that our LLITNs were compatible with parasitoid A. colemani. As shown, the role of natural enemies has to be taken into account regarding the dispersal of insect vectors and subsequent spread of plant viruses. The additional benefits of novel physicochemical barriers, such as photoselective and insecticide-impregnated nets, need to be considered in Integrated Pest Management programs of vegetable crops grown under protected environments.

Control of insect vectors and plant viruses in protected crops by novel pyrethroid-treated nets

Long-lasting insecticide-treated nets (LLITNs) constitute a novel alternative that combines physical and chemical tactics to prevent insect access and the spread of insect-transmitted plant viruses in protected enclosures. This approach is based on a slow-release insecticide-treated net with large hole sizes that allow improved ventilation of greenhouses. The efficacy of a wide range of LLITNs was tested under laboratory conditions against Myzus persicae, Aphis gossypii and Bemisia tabaci. Two nets were selected for field tests under a high insect infestation pressure in the presence of plants infected with Cucumber mosaic virus and Cucurbit aphid-borne yellows virus. The efficacy of Aphidius colemani, a parasitoid commonly used for biological control of aphids, was studied in parallel field experiments.

Fenología y capacidad de dispersión de Monochamus galloprovincialis (Olivier 1795) en la Península Ibérica = Phenology and dispersal ability of Monochamus galloprovincialis (Olivier 1795) at Iberian Peninsula

La aparición y avance de la enfermedad del marchitamiento del pino (Pine Wilt Desease, PWD), causada por Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda; Aphelenchoididae), el nematodo de la madera del pino (NMP), en el suroeste de Europa, ha puesto de manifiesto la necesidad de estudiar la fenología y la dispersión de su único vector conocido en Europa, Monochamus galloprovincialis (Col., Cerambycidae). El análisis de 12 series de emergencias entre 2010 y 2014, registradas en Palencia, València y Teruel, con material procedente de diversos puntos de la península ibérica, demostró una alta variabilidad en la fenología de M. galloprovincialis y la divergencia térmica respecto de las poblaciones portuguesas. Para éstas, el establecimiento de los umbrales térmicos de desarrollo de las larvas post-dormantes del vector (12,2 y 33,5ºC) permitió la predicción de la emergencia mediana para la fecha en la que se acumulaban de 822 grados-día. Ninguna de las series analizadas en este trabajo necesitó de dichos grados-día estimados para la emergencia mediana. Asimismo, la emergencia se adelantó en las regiones más calurosas, mientras que se retrasó en las zonas más templadas. Más allá de la posible variabilidad entre poblaciones locales peninsulares, se detectaron indicios de que la diferencia en la acumulación de calor durante el otoño puede afectar el grado de maduración de las larvas invernantes, y su posterior patrón temporal de emergencia. Por último, también fueron observados comportamientos de protandria en las emergencias. Respecto a la fenología de su vuelo, entre los años 2010 y 2015, fueron ejecutados un total de 8 experimentos de captura de M. galloprovincialis mediante trampas cebadas con atrayentes en diferentes regiones (Castellón, Teruel, Segovia y Alicante) permitiendo el seguimiento del periodo de vuelo. Su análisis permitió constatar la disminución de las capturas y el acortamiento del periodo de vuelo con la altitud, el inicio del vuelo en el mes de mayo/junio a partir de los 14ºC de temperatura media diaria, la influencia de las altas temperaturas en la disminución de las capturas estivales (potencial causante de perfiles bimodales en las curvas de vuelo en las zonas menos frías), la evolución de la proporción de sexos a lo largo del periodo de vuelo (que muestra una mayor captura de hembras al inicio y de machos al final) y el comportamiento diurno y ligado a las altas temperaturas del vuelo circadiano del insecto. Dos redes de muestreo sistemático de insectos saproxílicos instaladas en la Comunitat Valencia (Red MUFFET, 15 parcelas, año 2013) y en Murcia (Red ESFP, 20 parcelas, años 2008-2010) permitieron el estudio de la comunidad de insectos relacionada con M. galloprovincialis. Cada una de las parcelas contaba con una trampa cebada con atrayentes y una estación meteorológica. El registro de más de 250 especies de coleópteros saproxílicos demostró el potencial que tiene el empleo de redes de trampas vigía para la detección temprana de organismos exóticos, además de permitir la caracterización y evaluación de las comunidades de entomofauna útil, representando una de las mejores herramientas de la gestión integrada de plagas. En este caso, la comunidad de saproxílicos estudiada mostró ser muy homogénea respecto a la variación ambiental de las zonas de muestreo, y que pese a las pequeñas variaciones entre las comunidades de los diferentes ecosistemas, el rol que M. galloprovincialis desempeña en ellas a lo largo de todo el gradiente estudiado es el mismo. Con todo, el análisis mediante redes de interacción mostró su relevancia ecológica al actuar de conector entre los diferentes niveles tróficos. Por último, un total de 12 experimentos de marcaje-liberación-recaptura desarrollados entre 2009 y 2012 en Castellón, Teruel, Valencia y Murcia permitieron evaluar el comportamiento dispersivo de M. galloprovincialis. Las detecciones mediante trampas cebadas de los insectos liberados se dieron por lo menos 8 días después de la emergencia. La abundancia de población pareció relacionada con la continuidad, la naturalización de la masa, y con la afección previa de incendios. La dispersión no estuvo influida por la dirección ni la intensidad de los vientos dominantes. La abundancia de material hospedante (en lo referente a las variables de masa y a los índices de competencia) influyó en la captura del insecto en paisajes fragmentados, aunque la ubicación de las trampas optimizó el número de capturas cuando se ubicaron en el límite de la masa y en zonas visibles. Por último también se constató que M. galloprovincialis posee suficiente capacidad de dispersión como para recorrer hasta 1500 m/día, llegando a alcanzar distancias máximas de 13600m o de 22100 m. ABSTRACT The detection and expansion of the Pine Wilt Desease (PWD), caused by Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda; Aphelenchoididae), Pine Wood Nematode (PWN), in southwestern Europe since 1999, has triggered off the study of the phenology and the dispersion of its unique vector in the continent, Monochamus galloprovincialis (Coleoptera, Cerambycidae). The analysis of 12 emergence series between 2010 and 2014 registered in Palencia, Teruel and Valencia (Spain), registered from field colonized material collected at several locations of the Iberian Peninsula, showed a high variability in the emergence phenology of M. galloprovincialis. In addition, these patterns showed a very acute thermal divergence regarding a development model fitted earlier in Portugal. Such model forecasted the emergence of 50% of M. galloprovincialis individuals in the Setúbal Peninsula (Portugal) when an average of 822 degree-days (DD) were reached, based on the accumulation of heat from the 1st of March until emergence and lower and upper thresholds of 12.2 ºC and 33,5 °C respectively. In our results, all analyzed series needed less than 822 DD to complete the 50% of the emergence. Also, emergency occurred earlier in the hottest regions, while it was delayed in more temperate areas. Beyond the possible variability between local populations, the difference in the heat accumulation during the fall season may have affected the degree of maturation of overwintering larvae, and subsequently, the temporal pattern of M. galloprovincialis emergences. Therefore these results suggest the need to differentiate local management strategies for the PWN vector, depending on the location, and the climatic variables of each region. Finally, protandrous emergence patterns were observed for M. galloprovincialis in most of the studied data-sets. Regarding the flight phenology of M. galloprovincialis, a total of 8 trapping experiments were carried out in different regions of the Iberian Peninsula (Castellón, Teruel, Segovia and Alicante) between 2010 and 2015. The use of commercial lures and traps allowed monitoring of the flight period of M. galloprovincialis. The analyses of such curves, helped confirming different aspects. First, a decline in the number of catches and a shortening of the flight period was observed as the altitude increased. Flight period was recorded to start in May / June when the daily average temperature went over 14 ° C. A significant influence of high temperatures on the decrease of catches in the summer was found in many occasions, which frequently lead to a bimodal profile of the flight curves in warm areas. The evolution of sex ratio along the flight period shows a greater capture of females at the beginning of the period, and of males at the end. In addition, the circadian response of M. galloprovincialis to lured traps was described for the first time, concluding that the insect is diurnal and that such response is linked to high temperatures. Two networks of systematic sampling of saproxylic insects were installed in the Region of Valencia (Red MUFFET, 15 plots, 2013) and Murcia (Red ICPF, 20 plots, 2008-2010). These networks, intended to serve the double purpose of early-detection and long term monitoring of the saproxylic beetle assemblies, allowed the study of insect communities related to M. galloprovincialis. Each of the plots had a trap baited with attractants and a weather station. The registration of almost 300 species of saproxylic beetles demonstrated the potential use of such trapping networks for the early detection of exotic organisms, while at the same time allows the characterization and evaluation of useful entomological fauna communities, representing one of the best tools for the integrated pest management. In this particular case, the studied community of saproxylic beetles was very homogeneous with respect to environmental variation of the sampling areas, and despite small variations between communities of different ecosystems, the role that M. galloprovincialis apparently plays in them across the studied gradient seems to be the same. However, the analysis through food-webs showed the ecological significance of M. galloprovincialis as a connector between different trophic levels. Finally, 12 mark-release-recapture experiments were carried out between 2009 and 2012 in Castellón, Teruel, Valencia and Murcia (Spain) with the aim to describe the dispersive behavior of M. galloprovincialis as well as the stand and landscape characteristics that could influence its abundance and dispersal. No insects younger than 8 days were caught in lured traps. Population abundance estimates from mark-release-recapture data, seemed related to forest continuity, naturalization, and to prior presence of forest fires. On the other hand, M. galloprovincialis dispersal was not found to be significantly influenced by the direction and intensity of prevailing winds. The abundance of host material, very related to stand characteristics and spacing indexes, influenced the insect abundance in fragmented landscapes. In addition, the location of the traps optimized the number of catches when they were placed in the edge of the forest stands and in visible positions. Finally it was also found that M. galloprovincialis is able to fly up to 1500 m / day, reaching maximum distances of up to 13600 m or 22100 m.