Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Mecanismos implicados en las etapas iniciales de infección en la cancrosis de los cítricos provocada por Xanthomonas citri subsp. citri

La cancrosis o chancro bacteriano de los cítricos (CBC) causada por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii, afecta a un gran número de especies dentro de la familia de las rutáceas, especialmente cítricos. Esta enfermedad produce graves pérdidas económicas allí donde está presente, principalmente porque la comercialización de cítricos desde las zonas afectadas hacía zonas libres de cancrosis, está sujeta a fuertes medidas cuarentenarias. La cancrosis se encuentra distribuida a nivel mundial pero no se ha localizado ni en la Unión Europea ni en ningún área del Mediterráneo. Se han descrito tres tipos de cancrosis en función de la gama de huésped y de las características fenotípicas y genotípicas de las bacterias que las producen. La más extendida es la cancrosis tipo A producida por Xcc, dentro de la cual se distinguen los subtipos Aw y A*, originarios de Florida y Sudeste Asiático, respectivamente, que de forma natural solo son capaces de producir enfermedad en lima mejicana. En este trabajo se presentan estudios sobre mecanismos implicados en las primeras etapas de la infección, como la quimiotaxis y formación de biopelículas, en la cancrosis de los cítricos. La quimiotaxis es el proceso por el cual las bacterias se dirigen hacia zonas favorables para su supervivencia y desarrollo. Los perfiles quimiotácticos obtenidos frente a distintas fuentes de carbono, así como los estudios en relación al contenido de proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs), permitieron agrupar a las cepas de Xanthomonas estudiadas en este trabajo, de acuerdo a la enfermedad producida y a su gama de huésped. Todas las cepas mostraron quimiotaxis positiva frente a extractos de hoja y apoplasto de diferentes especies, sin embargo, Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac) y X. campestris pv. campestris (Xc) manifestaron respuestas más específicas frente a extractos de apoplasto de hojas de naranjo dulce, lima y col china, respectivamente. Dicho resultado nos permite asociar el mecanismo de quimiotaxis con la capacidad de las cepas de Xanthomonas para colonizar estos huéspedes de forma específica. Las cepas estudiadas fueron capaces de realizar movimiento tipo swimming, twitching y sliding en distintos medios, siendo el movimiento swimming el único en el que se encontraron diferencias entre las cepas de Xcc con distinta gama de huésped. En este trabajo se ha estudiado además la formación de biopelículas en superficies bióticas y abióticas, un mecanismo importante tanto para la supervivencia en superficie vegetal como para el desarrollo de la infección. Las cepas de Xanthomonas estudiadas fueron capaces de formar biopelículas in vitro, siendo mayor en un medio que simula el apoplasto y que contiene una baja concentración de nutrientes en comparación con medios que contenían alta concentración de nutrientes. La formación de biopelículas en superficie vegetal se encontró relacionada, en las cepas patógenas de cítricos, con la capacidad para infectar un tejido o huésped determinado. Se han caracterizado algunos de los componentes de la matriz extracelular producida por Xcc, que compone hasta un 90% de las bipoelículas. Entre ellos destaca el ADN extracelular, que tiene un papel como adhesina en las primeras etapas de formación de biopelículas y estructural en biopelículas maduras. Además, se han identificado el pilus tipo IV como componente importante en las biopelículas, que también participa en motilidad. Finalmente, se han realizado estudios sobre la expresión de genes implicados en motilidad bacteriana y formación de biopelículas que han confirmado las diferencias existentes entre cepas de Xcc de amplia y limitada gama de huésped, así como el papel que juegan elementos como el pilus tipo IV o el flagelo en estos procesos. ABSTRACT Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and X. fuscans subsp. aurantifolii are the causal agents of Citrus Bacterial Canker (CBC) which is one of the most important citrus diseases. CBC affects all Citrus species as well as other species from Rutaceae family. CBC produces strong economic losses; furthermore the commercialization of plants and fruits is restricted from infested to citrus canker free areas. The disease is worldwide distributed in tropical and subtropical areas, however it is not present in the European Union. Three types of CBC have been described according to the host range and phenotypic and genotypic characteristics. CBC type A caused by Xcc is he widest distributed. Within CBC A type two subtypes Aw and A* were described from Florida and Iran respectively, both infecting only Mexican lime. Herein mechanisms connected to early events in the citrus bacterial canker disease such as chemotaxis and biofilm formation, were studied. Chemotaxis allows bacteria to move towards the more suitable environments for its survival, host colonization and infection. Studies performed on citrus pathogenic Xanthomonas and X. campestris pv. campestris (Xc), a crucifer pathogen, have shown different chemotactic profiles towards carbon compound as well as different MCPs profile, which clustered strains according to host range and disease caused. Every strain showed positive chemotaxis toward leaf extracts and apoplastic fluids from sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage leaves. However, a more specific response was found for strains Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis and Xc towards sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage apoplastic fluids, respectively. These results relate chemotaxis with the higher ability of those strains to specifically colonize their proper host. Xanthomonas strains studied were able to perform swimming, sliding and twitching motilities. The ability to swim was variable among CBC strains and seemed related to host range. Biofilm formation is an important virulence factor for Xcc because it allows a better survival onto the plant surface as well as facilitates the infection process. The studied Xanthomonas strains were able to form biofilm in vitro, on both nutrient rich and apoplast mimicking media, furthermore the biofilm formation by all the strains was higher in the apoplast mimicking media. The ability to form biofilm in planta by Xcc and Xac strains was dependent of the host and the tissue colonized. The wide host range CBC strain was able to form biofilm onto several citrus leaves and fruits, however the limited host range CBC strain produced biofilm solely onto Mexican lime leaves and fruits. Furthermore Xac strain, which solely infects leaves of young plants, was not able to develop biofilms on fruits. Some components of the extracellular matrix produced by Xcc strains have been characterized. Extracellular DNA acted as an adhesin at the very early stages of biofilm formation and as structural component of mature biofilm for citrus pathogenic Xanthomonas. Furthermore type IV pilus has been identified as a component of the extracellular matrix in biofilm and motility. Transcriptional studies of genes related with biofilm formation and motility have confirmed the differential behavior found among wide and limited host range CBC strains as well as the role of type IV pili and flagellum on those processes.