Clones Identification and Genetic Characterization of Garnacha Grapevine by Means of Different PCR-Derived Marker Systems

This study uses PCR-derived marker systems to investigate the extent and distribution of genetic variability of 53 Garnacha accessions coming from Italy, France and Spain. The samples studied include 28 Italian accessions (named Tocai rosso in Vicenza area; Alicante in Sicily and Elba island; Gamay perugino in Perugia province; Cannonau in Sardinia), 19 Spanish accessions of different types (named Garnacha tinta, Garnacha blanca, Garnacha peluda, Garnacha roja, Garnacha erguida, Garnacha roya) and 6 French accessions (named Grenache and Grenache noir). In order to verify the varietal identity of the samples, analyses based on 14 simple sequence repeat (SSR) loci were performed. The presence of an additional allele at ISV3 locus (151 bp) was found in four Tocai rosso accessions and in a Sardinian Cannonau clone, that are, incidentally, chimeras. In addition to microsatellite analysis, intravarietal variability study was performed using AFLP, SAMPL and M-AFLP molecular markers. AFLPs could discriminate among several Garnacha samples; SAMPLs allowed distinguishing few genotypes on the basis of their geographic origin, whereas M-AFLPs revealed plant-specific markers, differentiating all accessions. Italian samples showed the greatest variability among themselves, especially on the basis of their different provenance, while Spanish samples were the most similar, in spite of their morphological diversity.

Utilización del cultivo plurianual de pataca (Helianthus tuberosus L.) para la producción de hidratos de carbono fermentables a partir de los tallos

La pataca (Helianthus tuberosus L.) es una especie de cultivo con un alto potencial en la producción de hidratos de carbono de reserva en forma de polifructanos, especialmente inulina, que se acumulan temporalmente en los tallos en forma de polisacáridos para translocarse posteriormente a los tubérculos, donde son almacenados. Aunque tradicionalmente el producto de interés del cultivo son los tubérculos, que acumulan gran cantidad de hidratos de carbono fermentables (HCF) cuando se recogen al final del ciclo de desarrollo, en este trabajo se pretende evaluar el potencial de la pataca como productor de HCF a partir de los tallos cosechados en el momento de máximo contenido en HCF, mediante un sistema de cultivo plurianual. Se han realizado los siguientes estudios: i) Determinación del momento óptimo de cosecha en ensayos con 12 clones ii) Potencial del cultivo plurianual de la pataca en términos de producción anual de biomasa aérea y de HCF en cosechas sucesivas, iii) Ensayos de conservación de la biomasa aérea, iv) Estimación de los costes de las dos modalidades de cultivo de pataca para producción de HCF y v) Estimación de la sostenibilidad energética de la producción de bioetanol mediante la utilización de los subproductos. Para la determinación del momento óptimo de la cosecha de la biomasa aérea se ensayaron 12 clones de diferente precocidad en Madrid; 4 tempranos (Huertos de Moya, C-17, Columbia y D-19) y 8 tardíos (Boniches, China, K-8, Salmantina, Nahodka, C-13, INIA y Violeta de Rennes). El máximo contenido en HCF tuvo lugar en el estado fenológico de botón floral-flor que además coincidió con la máxima producción de biomasa aérea. De acuerdo con los resultados obtenidos, la cosecha de los clones tempranos se debería realizar en el mes de julio y en los clones tardíos en septiembre, siendo éstos últimos más productivos. La producción media más representativa entre los 12 clones, obtenida en el estado fenológico de botón floral fue de 23,40 t ms/ha (clon INIA), con un contenido medio en HCF de 30,30 % lo que supondría una producción potencial media de 7,06 t HCF/ha. La producción máxima en HCF se obtuvo en el clon Boniches con 7,61 t/ha y 22,81 t ms/ha de biomasa aérea. En el sistema de cultivo plurianual la cantidad de tallos por unidad de superficie aumenta cada año debido a la cantidad de tubérculos que van quedando en el terreno, sobre todo a partir del 3er año, lo que produce la disminución del peso unitario de los tallos, con el consiguiente riesgo de encamado. El aclareo de los tallos nacidos a principios de primavera mediante herbicidas tipo Glifosato o mediante una labor de rotocultor rebaja la densidad final de tallos y mejora los rendimientos del cultivo. En las experiencias de conservación de la biomasa aérea se obtuvo una buena conservación por un período de 6 meses de los HCF contenidos en los tallos secos empacados y almacenados bajo cubierta. Considerando que el rendimiento práctico de la fermentación alcohólica es de 0,5 l de etanol por cada kg de azúcar, la producción potencial de etanol para una cosecha de tallos de 7,06 t de HCF/ha sería de 3.530 l/ha. El bagazo producido en la extracción de los HCF de la biomasa aérea supondría 11,91 t/ha lo que utilizado para fines térmicos supone más de 3 veces la energía primaria requerida en el proceso de producción de etanol, considerando un poder calorífico inferior de 3.832,6 kcal/kg. Para una producción de HCF a partir de la biomasa aérea de 7,06 t/ha y en tubérculos al final del ciclo de 12,11 t/ha, los costes de producción estimados para cada uno de ellos fueron de 184,69 €/t para los HCF procedentes de la biomasa aérea y 311,30 €/t para los de tubérculos. Como resultado de este trabajo se puede concluir que la producción de HCF a partir de la biomasa aérea de pataca en cultivo plurianual, es viable desde un punto de vista técnico, con reducción de los costes de producción respecto al sistema tradicional de cosecha de tubérculos. Entre las ventajas técnicas de esta modalidad de cultivo, cabe destacar: la reducción de operaciones de cultivo, la facilidad y menor coste de la cosecha, y la posibilidad de conservación de los HCF en la biomasa cosechada sin mermas durante varios meses. Estas ventajas, compensan con creces el menor rendimiento por unidad de superficie que se obtiene con este sistema de cultivo frente al de cosecha de los tubérculos. Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) (JA) is a crop with a high potential for the production of carbohydrates in the form of polyfructans, especially inulin, which are temporarily accumulated in the stems in the form of polysaccharides. Subsequently they are translocated to the tubers, where they are finally accumulated. In this work the potential of Jerusalem artichoke for fermentable carbohydrates from stems that are harvested at their peak of carbohydrates accumulation is assessed as compared to the traditional cultivation system that aims at the production of tubers harvested at the end of the growth cycle. Tubers are storage organs of polyfructans, namely fermentable carbohydrates. Studies addressed in this work were: i) Determination of the optimum period of time for stem harvesting as a function of clone precocity in a 12-clone field experiment; ii) Study of the potential of JA poly-annual crop regarding the annual yield of aerial biomass and fermentable carbohydrates (HCF) over the years; iii) Tests of storage of the aerial biomass, iv) Comparative analysis of the two JA cultivation systems for HCF production: the poly-annual system for aerial biomass harvesting versus the annual cultivation system for tubers and v) Estimation of the energy sustainability of the bioethanol production by using by-products of the production chain. In order to determine the best period of time for aerial biomass harvesting twelve JA clones of different precocity were tested in Madrid: four early clones (Huertos de Moya, C-17, Columbia and D-19) and eight late clones (Boniches, China, K-8 , Salmantina, Nahodka, C-13, INIA and Violeta de Rennes). Best time was between the phenological stages of floral buds (closed capitula) and blossom (opened capitula), period in which the peak of biomass production coincides with the peak of HCF accumulation in the stems. According to the results, the early clones should be harvested in July and the late ones in September, being the late clones more productive. The clone named INIA was the one that exhibited more steady yields in biomass over the 12 clones experimented. The average potential biomass production of this clone was 23.40 t dm/ha when harvested at the floral buds phenological stage; mean HCF content is 30.30%, representing 7.06 t HCF/ha yield. However, the highest HCF production was obtained for the clone Boniches, 7.61 t HCF/ha from a production of 22.81 t aerial biomass/ha. In the poly-annual cultivation system the number of stems per unit area increases over the years due to the increase in the number of tubers that are left under ground; this effect is particularly important after the 3rd year of the poly-annual crop and results in a decrease of the stems unit weight and a risk of lodging. Thinning of JA shoots in early spring, by means of an herbicide treatment based on glyphosate or by means of one pass with a rotary tiller, results in a decrease of the crop stem density and in higher crop yields. Tests of biomass storing showed that the method of keeping dried stems packed and stored under cover results in a good preservation of HCF for a period of six months at least. Assuming that the fermentation yield is 0.5 L ethanol per kg sugars and a HCF stem production of 7.06 t HCF/ha, the potential for bioethanol is estimated at 3530 L/ha. The use of bagasse -by-product of the process of HCF extraction from the JA stems- for thermal purposes would represent over 3 times the primary energy required for the industrial ethanol production process, assuming 11.91 t/ha bagasse and 3832.6 kcal/kg heating value. HCF production costs of 7.06 t HCF/ha yield from aerial biomass and HCF production costs of 12.11 t HCF/ha from tubers were estimated at 184.69 €/t HCF and 311.30 €/t HCF, respectively. It can be concluded that the production of HCF from JA stems, following a poly-annual cultivation system, can be feasible from a technical standpoint and lead to lower production costs as compared to the traditional annual cultivation system for the production of HCF from tubers. Among the technical advantages of the poly-annual cultivation system it is worth mentioning the reduction in crop operations, the ease and efficiency of harvesting operations and the possibility of HCF preservation without incurring in HCF losses during the storage period, which can last several months. These advantages might compensate the lower yield of HCF per unit area that is obtained in the poly-annual crop system, which aims at stems harvesting, versus the annual one, which involves tubers harvesting.

Estudios de eficiencia en el uso de la luz y estimaciones de biomasa en cultivos energéticos de Salix sp. en Central New York, USA

La productividad es un factor importante que influye en la viabilidad económica de un cultivo energético de sauce y maximizarla se convierte en un tema primordial. Esta investigación está directamente relacionada con dicha característica. La productividad varía según los clones cultivados, que pueden ser mejorados y seleccionados genéticamente. Los programas genéticos requieren de una información previa (productividad media en función del porte y número de los tallos, características de las hojas, resistencia a las plagas, etc.) que ayudará a obtener clones más productivos y resistentes. Por ello, nuestra investigación consta de dos estudios: (1) Evaluación de la eficiencia del uso de la luz o LUE (Light Use Efficiency). El incremento de biomasa y la eficiencia del uso de la luz (LUE) fue estudiado en 15 clones del genero Salix durante los meses de junio a septiembre de 2011 en Belleville (Central New York, USA). Los objetivos de este estudio fueron: (1) Evaluar la eficiencia del uso de la luz en la explicación a la variación en la producción de biomasa y (2) Determinar si existen diferencias significativas entre clones evaluando el índice de área foliar (LAI) y algunos componentes de las hojas (N, P, K,…). Se concluye que la variación de biomasa está relacionada con la cantidad de luz interceptada y con la eficiencia de su uso. Dicha información debe de ser transferida para ayudar a mejorar genéticamente los futuros clones a comercializar, con el fin de maximizar la productividad y aumentar la resistencia a plagas. (2) Estimación de biomasa a través de modelos de regresión. Los estudios de investigación relacionados con la productividad requieren estimaciones no destructivas de la biomasa aérea. Sin embargo, el nivel de precisión requerido y la inversión de tiempo son excesivos para operaciones comerciales con grandes extensiones (plantaciones de 10.000 ha). Por esta razón, se estudia el nivel de especificidad (específico, intermedio y general) en la toma de datos de campo sobre los mismos 15 clones (12 de ellos se pueden agrupar en 5 grupos según su genotipo origen) del genero Salix, empleados en el estudio anterior. Para todos los niveles estudiados se observaron diferencias significativas. Pero desde nuestro punto de vista, las diferencias obtenidas no son relevantes. Para validar los modelos finalmente seleccionados se calcularon los porcentajes de error entre la biomasa estimada por los modelos de regresión calculados y la biomasa real obtenida tras los pesajes de biomasa, todo ello se realizó para cada clon según nivel de especificidad. ABSTRACT Productivity is an important factor in the economic viability of a willow crop´s, therefore, maximize it becomes a major factor. This study is directly related to this feature. Productivity, among other factors, may vary depending on different clones, which can be improved and selected genetically. Genetic programs require prior information (average productivity, size and number of stems, leaf characteristics, resistance to pests, etc.) to help you get more productive clones resistant to local pests. Our research consists of two studies: (1) Evaluation of the efficiency of use of light (LUE, Light Use Efficiency). The increase of biomass and light use efficiency (LUE) was tested on 15 clones of the genus Salix during June and September 2011 in Belleville (Central New York, USA). The objectives of this study were: (1) evaluate the light use efficiency and its relationship with the variation in biomass production and (2) determine whether there are significant differences between clones evaluating the leaf area index (LAI) and some traits of the leaves (N, P, K). We studied the correlation with the light use efficiency. It is concluded that the variation of biomass was related to the amount of light intercepted and its efficiency. Such information must be transferred to help improve future genetically clones to market in order to maximize productivity and increase resistance to pests. (2) Estimation of biomass through regression models. Research studies related to productivity estimates require precision and non destructive biomass. However, the level of accuracy required and the investment of time are excessive for large commercial operations with extensions (plantations of 10,000 ha). Precisely for this reason, we study the level of specificity (specific, intermediate and general) in making field data on the same 15 clones (12 of them can be grouped into five groups according to their genotype origin) of the genus Salix, employees in the previous study. For all levels studied some significant differences were observed. But from our practical standpoint, the differences are not relevant. Finally, to validate the selected models, we calculated the percent of bias between estimated biomass (by the regression models) and real biomass obtained after the weighing of biomass, all this process was done for each clone by level of specificity.

Embryogenic suspensions of adult cork oak: the first step towards mass propagation.

Abstract Protocols have been established to clone adult cork oak trees by somatic embryogenesis using semisolid medium. However, for economically viable mass propagation, embryogenic cultures in liquid medium need to be developed. In this study, suspension cultures were initiated from embryo clusters obtained by secondary embryogenesis on a gelled medium lacking plant growth regulators. After 6 days of culture, these embryo clusters generated high cell density suspensions that also contained small organized structures (embryos and embryogenic clumps). As the culture duration increased, tissue necrosis and fewer embryogenic structures were observed and the establishment of suspension cultures failed. An alternative method was found adequate for initiation of embryogenic suspensions: embryo clusters from gelled medium were briefly shaken in liquid medium and detached cells and embryogenic masses of 41?800 lm were used as inoculum. Maintenance of embryogenic suspensions was achieved using a low-density inoculum (43 mg l-1) by subculturing four embryogenic clumps of 0.8?1.2 mm per 70 ml of medium. Proliferation ability was maintained for almost 1 year through ten consecutive subcultures. The initiation and maintenance protocols first developed for a single genotype were effective when tested on 11 cork oak genotypes.

Plant regeneration from an endangered valuable cork oak tree by somatic embryogenesis.

Among the several applications of in vitro tissue culture techniques, the conservation of plant germplasm is one of the most widely used. The cork oak is one of the principal tree species in the Western Mediterranean región. Within this área, the Balearic Islands are considered to be a glacial refuge, and therefore a reservoir of genetic resources. A singular tree has been found in the small Minorca Island population. The haplotype of this tree is of Tyrrhenian origin, showing a past link between Minorca and Sardinia. Moreover, this tree do not bear a deletion within an ITS from ribosimic nuclear DNA, which is fairly common in many populations of this species, and indicates that ir may be the descendant of a very ancient population. This tree is currently in a precarious condition, and it has not produced acorns in the last years. Hence there is a clear need of vegetative propagation to conserve this genotype. We have previously developed methods to clone adult cork oak tres by somatic embryogenesis, and therefore the aim of the present work was to clone this singular tree. There braches from the corwn were collected in November 2004, and methods previously described were carried out. By February 2005 somatic embryogenesis was obtained from leaves of the tree with percentages on induction ranging from 17 to 54% depending on the branch, which may show a novel source of variation that requires further study. Spontaneously matured somatic embryos germinated at 46% in average, and the first somatic seedlings from the Alfavaret's cork oak tree were obtained. Therefore, this study shows one of the most relevant applications of somatic embryogenesis: the plant regeneration of valuable genotypes for the in situ and ex situ conservation of forest genetic resources.

Uncovering cold disruption of the circadian clock in poplar

Dormancy is an adaptive mechanism that allows woody plants to survive at low temperatures during the winter. Disruption of circadian clock genes in winter or under low temperatures, both in long days as in short days, were described in our group few years ago (Ramos et al., 2005). Basic mechanisms of the circadian clock function are similar in herbaceous as well as in woody plants although there are differences in their response to low temperatures (Bieniawska et al., 2008). Woody plants growing in daylight conditions should have a specific transcriptional control above the circadian clock genes, which is responsible of their constitutive transcriptional activation observed under low temperatures conditions. In order to understand this regulatory process, we are analyzing the behavior of a circadian clock gene in poplar. To this aim, we have isolated its promoter region and fused to the luciferase reporter gene. This construct has been transformed into Populus tremula x P. alba 717-1B4 INRA clone. Here we present the characterization of these transgenic lines under different conditions of light and temperature.

CsRAV1: a candidate gene for improving lignocellulosic biomass yield

Fast-growing tree species of Populus spp.,Salix spp. and Eucalyptus spp. are cultivated to produce wood in a short time. Poplars are cultivated with cycles of 15-18 years to obtain saw timber and peeler logs, but when grown as short -rotation coppice(SRC) to produce biomass, planting density increases and rotation is considerably reduced (3-5 years). In this regard, research efforts are focused in the identification of traits and loci that allow the generation of improved SRC biomass-yielding genotypes. Biomass yield is a highly complex trait as it is the combined outcome of many other complex traits, each under separate polygenic control. Among profitable biomass yield-related traits are the amount of sylleptic branching and the length of winter dormancy. In poplar and in a few other Salicaceae species some lateral buds grow out sylleptically, the same season in which they form without the need of an intervening rest period. Sylleptic branching in poplar increases branch number, leaf area and general growth of the tree in its early years, and is a reasonable predictor of coppice yield. On the other hand, the length of winter dormancy determines the extent of the growth period. Our group has characterized the RAV1 gene of Castanea sativa (CsRAV1), encoding a transcription factor of the subfamily RAV (Related to ABI3/VP1). CsRAV1 expression shows a marked seasonal pattern, being higher in autumn and winter both in stems and buds. We generated transgenic lines of the hybrid clone Populus tremulax P. alba INRA 717 1B4 constitutively expressing CsRAV 1. These CsRAV1-expressing poplars develop sylleptic branches only a few weeks after potting. In addition to the sylleptic branching phenotype, these trees show phenological features that could give rise to an extended growth period. We are currently assessing the phenotype and behavior of these transgenic trees in a field trial, and ultimately, we will evaluate the impact on lignocellulosic biomass quality and production.

Estudio de los efectos en el viñedo de la modificación del déficit hídrico continuo en los periodos anterior y posterior al envero (cv. Cabernet Sauvignon; Vitis vinifera L.)

En regiones semiáridas, con veranos cálidos, evapotranspiraciones elevadas, humedades relativas bajas, además de precipitaciones intermitentes y escasas (400 mm al año) que reducen la recarga del perfil en invierno, se puede ver afectada la productividad y sostenibilidad de los viñedos. Por eso en estas zonas puede ser necesario utilizar el riego suplementario para mantener la calidad y aumentar la productividad. En este marco de circunstancias es en el que se desarrolla la mayoría de la viticultura española, y en concreto en la zona centro donde se realizó el estudio. Con este trabajo se pretende estudiar la influencia del agua del riego, con distintas dosis y aplicada en diferentes fases de crecimiento y maduración de la baya, en la producción y calidad de la uva. Se estudió la influencia del déficit moderado continuo aplicado antes y después de envero, en el aprovechamiento de los recursos ambientales y en la respuesta del cv. Cabernet Sauvignon. El ensayo se desarrolló en 2010 y 2011 en la finca “La Alcoholera”, perteneciente a bodegas LICINIA S.L., ubicada en la localidad de Chinchón, Comunidad de Madrid, España. Durante 2010 y 2011 se realizaron estudios en cepas del cv. Cabernet Sauvignon (clon 15), injertadas sobre 41B y plantadas en 2005. Con poda corta en Cordón Royat unilateral de 80 cm de altura, y cuya vegetación alcanzó una altura de 97 cm. Las cepas del ensayo fueron conducidas verticalmente en espaldera (VSP), con 10 yemas por metro lineal. Las plantas dentro de la fila fueron separadas 1 m y la distancia de la calle fue de 3 m. La orientación de las filas norte – sur. Se plantearon cuatro tratamientos experimentales con diferentes dosis y momento de aplicación del riego. - T: Testigo. Déficit ligero, con un aporte continuado de agua desde floración (420 mm). - DMc: Déficit moderado continuo. Manejo del riego convencional, empezando en pre-envero (154 mm) - DM1: Déficit moderado a partir de pre-envero. Aporte de riego continuado desde floración reduciéndose la dosis de riego en pre-envero (312 mm). - DM2: Déficit moderado hasta pre-envero. Se empezó a regar a partir de preenvero (230 mm). Se observó que bajo condiciones de estrés hídrico leve, el crecimiento se reduce disminuyendo la migración de fotoasimilados hacia los órganos vegetativos. Generando menor área foliar en las plantas sometidas a déficit hídrico moderado entre floración y cuajado. Disminuyendo su consumo. En maduración la humedad del suelo dependió principalmente del riego aplicado y del consumo de la planta; dicho consumo dependió a la vez del desarrollo foliar del canopy y de la necesidad hídrica de la vid. El aumento del déficit hídrico disminuyó el contenido de agua en el suelo, lo que provocó diferencias en el estado hídrico y en el intercambio gaseoso de las hojas. En condiciones de déficit moderado, la fotosíntesis se encontró altamente correlacionada con el potencial hídrico foliar medido a mediodía solar. Además en condiciones de déficit moderado continuo la disponibilidad hídrica, la demanda atmosférica y el nivel de hidratación de las hojas, interaccionaron de forma compleja en la regulación estomática de las hojas, condicionando el intercambio gaseoso y la eficiencia en el uso del agua. Al aumentar el volumen de agua aplicado el peso de madera de poda por metro de fila fue superior. Las diferencias encontradas en el rendimiento fueron debidas a las diferencias en el peso de baya. El cual estuvo condicionado por la estrategia de riego, ya que, el déficit hídrico moderado antes de envero fue más crítico para el rendimiento que el déficit impuesto durante la madurez. Por otro lado, la biomasa dependió de la actividad fisiológica de la planta, la cual fue altamente dependiente de la disponibilidad hídrica. Déficit hídrico moderado aplicado de cuajado a envero, generó bayas más pequeñas y aumentó la relación hollejo:pulpa. El déficit moderado aplicado después de envero favoreció la acumulación de IPT y antocianos extraíbles, mejorando la calidad de la uva, pero disminuyó la acidez de la baya. El riego aplicado de envero a vendimia desaceleró la concentración de azúcares en bayas que fueron sometidas a déficit antes de pre-envero. ABSTRACT Mediterranean climate is characterized by hot summers, high evapotranspiration rates, and scarce precipitations (400 mm per year) during grapevine cycle. These extremely dry conditions affect vineyard productivity and sustainability. Supplementary irrigation is needed practice in order to maintain yield and quality. Almost all Spanish grape growing regions are characterized by these conditions, especially in the center region, where this trial was performed. The main objective of this work is to study the influence of water irrigation on yield and quality. For this aim, different levels of irrigation (mm of water applied) were applied during different stages of growth and berry maturity of Caberent Sauvignon grapevines. The work was conducted from 2010 to 2011 and located in Licinia (40º 12´ N, 3º 28´ W), Madrid, Spain. The cultivar utilized was Cabernet Sauvignon, clone 15 grafted onto rootstock 41B, planted in 2005. The vineyard was oriented north-south, with spacing on 3 meters between rows and 1 meter between plants. Vines were spurpruned to 10 buds per meter and trained in unilateral cordon with a height of 80 cm. Shoots were positioned vertically (VSP). Considering the amount of water and the moment of the application, four experimental treatments were applied: - T: Control sample. Slight deficit (420 mm) applied from bloom to maturity. - DMc: Continuous moderate deficit. Traditional irrigation: application of 154 mm of water from pre-veraison to maturity. - DM1: Deficit moderate from pre-veraison. Irrigation of 312 mm of water from bloom to pre-veraison. - DM2: Deficit moderate to pre-veraison. Irrigation of 230 mm of water from preveraison to maturity Under moderated water stress conditions it was seen than leaf growth decreases due to the reduction of migration of photo-assimilates to vegetative organs. Vines with moderate water deficit between flowering and ripening develop less leaf area and decrease its water consumption. During maturation of berries, soil moisture depends on irrigation and plant consumption. This consumption further depends on vegetation development and on the vine needs for water. By increasing water deficit, the water content in the soil decreases. This causes differences in leaf water status and in the gases exchange. Under moderate deficit conditions, photosynthesis was found highly correlated with midday leaf water potential. Further, atmospheric demand and the level of leaves hydration interact in complex ways in the stomatal regulation, which affects leaf gas exchange and the efficiency of water use. The amount of water applied is directly proportional to pruning weight. Changes in berry weight cause differences in yield ratios. The differences in berry weights are conditioned by the irrigation strategy, the moderate water deficit before veraison influences more than the deficit applied from veraison. Biomass generated for the plant depends on its physiological activity, which is highly related to the water availability. Moderate water deficit applied from fruit set to ripening generates smaller berries, increasing the pulp/skin ratio. Moderate deficit applied after veraison promotes the accumulation of extractables anthocyans and TPI. Despite this treatment improves color parameters of the grapes, it decreases its total acidity. Irrigation applied from veraison to harvest slows down sugar accumulation in berries compared to those under deficit before veraison conditions.

Unearthing the roots of degradation of Quercus pyrenaica coppices: an integrative perspective from clonal structure to carbon budgets

Quercus pyrenaica es una especie rebrotadora de raíz intensa e históricamente aprovechada en monte bajo para la obtención de leñas, carbón y pastos. Debido al éxodo rural y a la aparición de nuevas fuentes energéticas, este aprovechamiento fue abandonado en la década de 1970. Desde entonces, las bajas producciones de madera y bellota y el puntisecado de los pies evidencian el generalizado estancamiento de estas masas. Uno de los mayores retos actuales de la selvicultura en el ámbito mediterráneo es encontrar usos alternativos para estos montes abandonados, siendo la conversión a monte alto una de las alternativas preferidas. Se han realizado resalveos de conversión, sin embrago, éstos se aplican sin un conocimiento integral de las causas de la degradación. En esta tesis doctoral, estudiamos un hipotético desequilibrio entre la parte radical y la parte aérea (R:S) de las cepas de rebollo como causa subyacente de su decaimiento. En una parcela experimental, aprovechada al menos desde el siglo XII, se realizaron análisis genéticos a priori para elucidar la estructura genética del rodal, y así estudiar la influencia del tamaño clonal en el funcionamiento de las cepas. Las cepas de mayor tamaño presentaron un menor crecimiento diametral de sus pies, así como mayores tasas de respiración radical, estimadas a partir de flujos internos de CO2 a través del xilema (FT) y de los flujos de CO2 del suelo. Estos resultados sugieren que el desequilibrio R:S aumenta con el tamaño clonal, dado que la eliminación periódica de órganos aéreos, al mismo tiempo que las raíces permanecen intactas, da lugar a un gran desarrollo del sistema radical que consume gran parte de los carbohidratos no estructurales (NSC) en respiración de mantenimiento, comprometiendo así el desarrollo de órganos aéreos. Se excavaron y pesaron dos cepas compuestas por cuatro y ocho pies, las cuales mostraron ratios R:S (0.5 y 1, respectivamente) superiores a los registrados en pies de origen sexual. Al igual que en otras especies rebrotadoras de raíz, se observaron altas concentraciones de NSC en las raíces (> 20% en primavera) y una gran proporción de albura en el sistema radical (52%) que alberga una notable reserva de NSC (87 kg en la cepa de mayor tamaño). En el sistema radical de dicha cepa, estimada mediante dataciones radiocarbónicas en 550 años de edad, se contaron 248 uniones radicales. La persistencia de sistemas radicales grandes, viejos, y altamente interconectados sugiere que la gran cantidad de recursos almacenados y consumidos en las raíces compensan un pobre desarrollo aéreo con una alta resiliencia vegetativa. Para un mejor entendimiento de los balances de carbono y del agotamiento de NSC en las cepas de rebollo, se midieron los flujos internos y externos de CO2 en troncos y los flujos de CO2 del suelo, y se estimó la respiración de órganos aéreos (RS) y subterráneos (RR). Estacionalmente, RS y RR reflejaron las dinámicas de flujo de savia y de crecimiento del tronco, y estuvieron determinadas principalmente por los flujos externos de CO2, dada la escasa contribución de FT a RS y RR (< 10% y < 2%, respectivamente). En una escala circadiana, la contribución de FT a RS aumentó hasta un 25% en momentos de alta transpiración. Las bajas concentraciones de CO2 en el xilema ([CO2] hasta un 0.11%) determinaron comparativamente unos bajos FT, probablemente causados por una limitada respiración del xilema y una baja resistencia a la difusión radial del CO2 impuestos por la sequía estival. Los pulsos de [CO2] observados tras las primeras lluvias de otoño apoyan esta idea. A lo largo del periodo vegetativo, el flujo medio de CO2 procedente del suelo (39 mol CO2 day-1) fue el mayor flujo respiratorio, tres y cuatro veces superior a RS (12 mol CO2 day-1) y RR (8-9 mol CO2 day-1), respectivamente. Ratios RR/RS menores que la unidad evidencian un importante peso de la respiración aérea como sumidero de carbono adicional. Finalmente, se ensayó el zanjado de raíces y el anillamiento de troncos como tratamientos selvícolas alternativos con el objetivo de aumentar las reservas de NSC en los troncos de las cepas. Los resultados preliminares desaconsejan el zanjado de raíces por el alto coste derivado posiblemente de la cicatrización de las heridas. El anillado de troncos imposibilitó el transporte de NSC a las raíces y aumentó la concentración de almidón por encima de la zona anillada, mientras que sistema radical se mantiene por los pies no anillados de la cepa. Son necesarias más mediciones y datos adicionales para comprobar el mantenimiento de esta respuesta positiva a largo plazo. Para concluir, destacamos la necesidad de estudios multidisciplinares que permitan una comprensión integral de la degradación de los rebollares ibéricos para poder aplicar a posteriori una gestión adecuada en estos montes bajos abandonados. ABSTRACT Quercus pyrenaica is a vigorous root-resprouting species intensively and historically coppiced for firewood, charcoal and woody pastures. Due to the rural exodus and the appearance of new energy sources, coppicing was abandoned towards 1970. Since then, tree overaging has resulted in stand stagnation displayed by slow stem growth, branch dieback, and scarce acorn production. The urgent need to find new alternative uses for abandoned coppices is recognized as one of the biggest challenges which currently faces Mediterranean silviculture; conversion into high forest by thinning is one of the preferred alternatives. For this aim, thinning has been broadly applied and seldom tested, although without a comprehensive understanding of the causes of stand stagnation. In this PhD study, we test the hypothesis of an imbalance between above- and below-ground organs, result of long term coppicing, as the underlying cause of Q. pyrenaica decay. In an experimental plot coppiced since at least the 12th century, genetic analyses were performed a priori to elucidate inconspicuous clonal structure of Q. pyrenaica to evaluate how clonal size affects the functioning of these multi-stemmed trees. Clonal size negatively affected diametric stem growth, whereas root respiration rates, measured by internal fluxes of CO2 through xylem (FT) and soil CO2 efflux, increased with clonal size. These results suggest root-to-shoot (R:S) imbalance intensifying with clonal size: periodic removal of aboveground organs whilst belowground organs remain undisturbed may have led to massive root systems which consume a great proportion of non-structural carbohydrates (NSC) for maintenance respiration, thus constraining aboveground performance. Furthermore, excavation of two multi-stemmed trees, composed by four and eight stems, revealed R:S ratios (0.5 and 1, respectively) greater than those reported for sexually regenerated trees. Moreover, as similarly observed in several root-resprouting species, NSC allocation to roots was favored ([NSC] > 20% in spring): a large proportion of sapwood maintained throughout the root system (52%) stored a remarkable NSC pool of 87 kg in the case of the largest clone. In this root system of the eight-stemmed tree, 248 root connections were counted and, by radiocarbon dating, its age was estimated to be 550-years-old. Persistence of massive, old and highly interconnected root systems suggests that enhanced belowground NSC storage and consumption reflects a trade-off between vegetative resilience and aboveground development. For a better understanding of tree carbon budget and the potential role of carbon starvation in Q. pyrenaica decay, internal and external stem CO2 fluxes and soil CO2 effluxes were monitored to evaluate respiratory costs above- and below-ground. On a seasonal scale, stem and root respiration (RS and RR) mirrored sap flow and stem growth dynamics. Respiration was determined to the greatest extent by external fluxes of CO2 to the atmosphere or soil, since FT accounted for a low proportion of RS and RR (< 10% and < 2%, respectively). On a diel scale, the contribution of FT to RS increased up to 25% at high transpiration rates. Comparatively low FT was determined by the low concentration of xylem CO2 registered ([CO2] as low as 0.11%), likely as a consequence of constrained xylem respiration and reduced resistance to CO2 radial diffusion imposed by summer drought. Xylem [CO2] pulses following first autumn rains support this idea. Averaged over the growing season, soil CO2 efflux was the greatest respiratory flux (39 mol CO2 day-1), three and four times greater than RS (12 mol CO2 day-1) and RR (8-9 mol CO2 day-1), respectively. Ratios of RR/RS below one evidence an additional and important weight of aboveground respiration as a tree carbon sink. Finally, root trenching and stem girdling were tested as complimentary treatments to thinning as a means to improve carbon reserves in stems of clonal trees. Preliminary results discouraged root trenching due to the high cost likely incurred for wound closure. Stem girdling successfully blocked NSC translocation downward, increasing starch concentrations above the girdled zone whilst the root system is fed by non-girdled stems within the clone. Further measurements and ancillary data are necessary to verify that this positive effect hold over time. To conclude, the need of multidisciplinary approaches for an integrative understanding on the functioning of abandoned Q pyrenaica coppices is highlighted for an appropriate management of these stands.

Respuestas anatómico fisiológicas frente a estrés hídrico en plantaciones de especies de crecimiento rápido para la producción de biomasa

El objetivo general de la presente Tesis es identificar algunas de las características anatómico-fisiológicas que confieren la capacidad de alcanzar una mejor productividad bajo clima mediterráneo a plantas de diversos genotipos de los géneros Populus y Eucalyptus, caracterizados por su carácter pionero, elevado crecimiento y vulnerabilidad a la cavitación. En los dos primeros capítulos se hace un seguimiento de la conductancia estomática a una selección de clones de eucalipto cultivados en invernadero, sometidos a diferentes dotaciones hídricas. Se realizaron además mediciones periódicas del pH de la savia del tallo y de la pérdida de conductividad hidráulica para investigar su implicación en la regulación química e hidraúlica del cierre estomático. Las variaciones en el pH de la savia obtenidas parecen responder a cambios en el déficit de presión de vapor de agua atmosférico y no a diferencias en la disponibilidad de agua en el suelo. La conductancia estomática presentó una correlación positiva significativa con el pH de la savia, pero no con la conductividad hidráulica. La variabilidad de la conductividad hidráulica máxima se discute a la luz de recientes investigaciones sobre los materiales constituyentes de las membranas de las punteaduras. Los clones que mostraron mayores conductancias hidráulicas y estomáticas presentaron valores más altos de producción y supervivencia, poniendo de manifiesto la utilidad del estudio de estas variables. Por el contrario, los valores más bajos de conductancia estomática e hidraúlica se encontraron en clones que han resultado un fracaso en plantaciones comerciales, en particular, fue destacable el mal resultado de un clon procedente de autocruzamiento respecto de otros híbridos. En el tercer capítulo de la tesis se estudian características anatómicas y funcionales del xilema relacionadas con la eficiencia en el transporte de agua a las hojas, y que pueden afectar directa o indirectamente a la transpiración y al crecimiento. Los estudios anatómicos fueron realizados sobre brotes anuales de chopo en una plantación situada en Granada, en condiciones de riego limitante. La combinación de rasgos anatómicos más favorable de cara a la producción de biomasa fue una densidad alta de vasos de diámetro intermedio. Los clones más productivos figuraron entre los más resistentes a la cavitación. Para estudiar el crecimiento de masas arboladas se utilizan frecuentemente parámetros fisiológicos como el índice de area foliar (LAI). La estimación del LAI a partir de fotografías hemisféricas aplicada a tallares de chopo plantados a alta densidad y a turno corto para biomasa se lleva a cabo mediante una metodología reciente empleada y discutida en el cuarto capítulo de la Tesis. Los resultados muestran que las diferencias de producción existentes entre genotipos, localidades de medición con diferentes dosis de riego, y años, pueden predecirse a partir de la determinación del índice de área foliar tanto por métodos directos como indirectos de estimación. Tanto los estudios realizados en eucalipto como en chopo han mostrado que los genotipos con menores producciones de biomasa en campo alcanzaron los menores valores de conductancia estomática en las condiciones más favorables así como el menor número de vasos en el xilema. La estrecha relación entre crecimiento y LAI confirma una vez más la importancia del desarrollo de la copa para sostener un buen crecimiento. El mayor desarrollo de la copa y rendimiento en biomasa se midieron en uno de los clones con un número de vasos más elevado, y menor vulnerabilidad a la cavitación en condiciones de estrés. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de las características anatómicas y funcionales del xilema como condicionantes del patrón de crecimiento de las plantas y el comportamiento de los estomas. ABSTRACT A number of anatomical xylem traits and physiological variables were analyzed in genotypes of both the Populus and Eucalyptus genera with the main aim of identifying traits in the genotypes which confer the ability to produce an acceptable biomass yield under Mediterranean climatic conditions. In the first two chapters of this PhD, the results of two experiments carried out on several clones of the species Eucalyptus globulus Labill. are presented. Chapters three and four include the results of another two trials on four poplar hybrid genotypes. One of the initial plant responses to water stress is stomatal closure, which can be triggered by hydraulic and/or chemical signals. The two first chapters of this PhD deal with trials in which stomatal conductance and percentage loss of hydraulic conductivity were monitored on a set of eucalyptus clones supplied by ENCE (former National Cellulose Company) and currently used in the company’s own commercial plantings. The experimental trials were carried out in greenhouses and the plants were submitted to two different watering regimes. The pH of the stem sap was periodically measured as the greenhouse temperature and humidity changed. The aim of these measurements was to investigate the role of both sap pH and percentage loss of hydraulic conductivity on stomatal regulation. The results obtained suggest that changes in sap pH are a response to vapor pressure deficit changes rather than to differences in soil water availability. We found significant correlation between stomatal conductance and sap pH, although no significant relationship was found between stomatal conductance and hydraulic conductivity. Variability in maximum hydraulic conductivity is discussed based on recent pit membrane constituent research. The study of hydraulic conductivity proved helpful in order to detect the clones with both higher growth and greater chance of survival, since clones displaying the lowest hydraulic conductivities were those that failed in commercial plantings. Anatomical xylem traits define the water transport efficiency to leaves and can therefore limit transpiration and growth. The third chapter of this PhD addresses anatomical xylem traits in poplar. One year old stem samples were taken from a water-stressed trial in Granada. The anatomical xylem study proved useful for detecting the lowest yielding genotypes. Clones with intermediate vessel size and high vessel densities were found to be those with the highest biomass yield. Differences in cavitation resistance depending on the clone tested and the water treatment applied were also found. The clones with the highest biomass yield were found to be among the most cavitation resistant clones in each watering regime. Xylem and physiological traits along with stomatal behavior are useful tools to determine plant growth. In order to study plantings or forests, it is more common to employ other physiological variables such as leaf area index (LAI). LAI estimation from hemispherical photographs applied to short rotation woody crops is a recently developed method that still requires fine tuning through further investigation. In the fourth chapter, data from LAI monitoring over two consecutive years were analyzed in two different locations where different irrigation treatments were applied. The results showed that differences in yield between genotypes, different irrigation regimes and years could be predicted by using the LAI estimates, either through direct or indirect estimation methods. Our studies of poplar and eucalyptus have shown that the field-grown genotypes with the lowest biomass yield displayed the lowest values of stomatal conductance under the most favorable environmental conditions and also had a low number of xylem conduits. The close relationship between LAI and growth highlights the importance of crown development in biomass growth. The highest LAI and biomass yield were recorded in one of the clones with higher vessel density and the lowest vulnerability to cavitation under stress conditions. These results underline the importance of research into anatomical and functional traits as factors influencing plant growth patterns and stomatal behavior.

Evaluación de Ulmus pumila L. y Populus spp. como cultivos energéticos en corta rotación

El presente trabajo estudia el empleo del olmo de Siberia (Ulmus Pumila L.) y el chopo (Populus spp.) en corta rotación y alta densidad para la producción de biomasa con fines energéticos. En el área mediterránea las disponibilidades hídricas son limitadas, por lo que la mayoría de los cultivos energéticos utilizados hasta el momento requieren el aporte de agua de riego; por ello resulta fundamental encontrar especies con bajos requerimientos hídricos, analizar la eficiencia en el uso del agua de diferentes materiales genéticos y optimizar la dosis de riego. Las parcelas experimentales se ubicaron en la provincia de Soria. En el ensayo llevado a cabo con olmo de Siberia se ha analizado el efecto en la producción de la disponibilidad de agua mediante el establecimiento de parcelas en secano y con dos dosis de riego (2000 m3 ha-1 año-1 y 4000 m3 ha-1 año-1 aproximadamente); además, al ser una especie poco estudiada hasta el momento, se ha estudiado también el efecto que tiene sobre el rendimiento la densidad de plantación (3.333 plantas ha-1 y 6.666 plantas ha-1), el tipo de suelo (2 calidades diferentes) y el turno de corta (3 y 4 años). En el caso del chopo, se han evaluado cuatro clones (AF-2, I-214, Monviso y Pegaso) establecidos con una densidad de 20.000 plantas por hectárea. Durante el primer ciclo de tres años se aportó el mismo volumen de riego a todas las parcelas, mientras que durante el segundo ciclo se establecieron 8 regímenes hídricos diferentes. Por otra parte, se ha investigado sobre el uso del potencial hídrico de las plantas para evaluar el estrés hídrico de las mismas y se ha estimado la producción de biomasa foliar y el Índice de Área Foliar (LAI) de ambas especies, relacionando los valores obtenidos con la dosis de riego y la producción de biomasa. Los resultados muestran que los suelos inundados reducen la tasa de supervivencia de los olmos durante el periodo de implantación, sin embargo la mortalidad durante los siguientes periodos vegetativos es baja y muestra buena capacidad de rebrote. La productividad (kg ha-1 año-1) obtenida fue mayor con un turno de corta de cuatro años que con turno de tres años. El área basal y la altura fueron variables eficaces para predecir la producción de biomasa del olmo de Siberia, obteniendo una variabilidad explicada de más del 80%. En cuanto a los parámetros que mayor influencia tuvieron sobre el crecimiento, el tipo de suelo resulto ser el más relevante, obteniéndose en un suelo agrícola considerado de buena calidad una producción en condiciones de secano de unos 8.000 kg ha-1 año-1. En condiciones de regadío el rendimiento del olmo de Siberia fue al menos el doble que en secano, pero la diferencia entre las dos dosis de riego estudiadas fue pequeña. La producción de biomasa fue mayor en la densidad de plantación más alta (6.666 plantas ha–1) en las parcelas de regadío, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre las dos densidades en secano. El clon de chopo que presentó un mayor rendimiento durante el primer ciclo fue AF-2, alcanzando los 14.000 kg ha-1 año-1, sin embargo la producción de este clon bajó sustancialmente durante el segundo ciclo debido a su mala capacidad de rebrote, pasando a ser I-214 el clon más productivo llegando también a los 14.000 kg ha-1 año-1. Un aporte adicional de agua proporcionó un incremento de la biomasa recogida, pero a partir de unos 6.500 m3 ha-1 año-1 de agua la producción se mantiene constante. El potencial hídrico foliar ha resultado ser una herramienta útil para conocer el estrés hídrico de las plantas. Los olmos de regadío apenas sufrieron estrés hídrico, mientras que los implantados en condiciones de secano padecieron un acusado estrés durante buena parte del periodo vegetativo, que se acentuó en la parte final del mismo. Los chopos regados con las dosis más altas no sufrieron estrés hídrico o fue muy pequeño, en las dosis intermedias sufrieron un estrés moderado ocasionalmente y únicamente en las dosis más bajas sufrieron puntualmente un estrés severo. El LAI aumenta con la edad de los brotes y oscila entre 2 y 4 m2 m−2 en los chopos y entre 2 y 7 m2 m−2 en los olmos. Se encontró una buena relación entre este índice y la producción de biomasa del olmo de Siberia. En general, puede decirse que el olmo de Siberia podría ser una buena alternativa para producir biomasa leñosa en condiciones de secano, mientras que el chopo podría emplearse en regadío siempre que se haga una buena elección del clon y de la dosis de riego. ABSTRACT This work explores the possibilities of biomass production, for energy purposes, of Siberian elm (Ulmus Pumila L.) and poplar (Populus spp.) in Spain. Irrigation is required for the viable cultivation of many energy crops in Mediterranean areas because of low water availability, for this reason species with low water requirements should be a good alternative for biomass production. Moreover, the optimal amount of irrigation water and the performance of the different genetic material in terms of production and water use efficiency should be studied in order to use water wisely. The experimental plots were established in the province of Soria in Spain. Given the small amount of information available about Siberian elm, besides studying the influence of water availability (rain-fed and two different irrigation doses) on biomass production, two different plantation densities (3,333 plants ha-1 and 6,666 plants ha-1), two different soil type and two cutting cycles (three years and four years) were assessed. In the case of poplar, four clones belonging to different hybrids (I-214, AF2, Pegaso, and Monviso) were included in a high density plantation (20,000 plants ha-1). During the first cycle, the water supplied in all plots was the same, while 8 different watering regimes were used during the second cycle. The suitability of the use of the leaf water potential to assess the water stress situations has also been investigated. Moreover, leaf biomass production and leaf area index (LAI) were estimated in both species in order to analyze the relationship between these parameters, irrigation dose and biomass production. The results shows that flooded soils have an adverse effect on elm survival in the implantation period, but the percentage of mortality is very low during the following vegetative periods and it shows a good ability of regrowth. The annual yield from a four-year cutting cycle was significantly greater than that from the three-year cutting cycle. Basal diameter and height are effective variables for predicting the production of total biomass; equations with R squared higher than 80% were obtained. The analysis of parameters having an influence on elm growth shows that soil type is the most important factor to obtain a good yield. In soils with enough nutrients and higher waterholding capacity, biomass productions of 8,000 kg ha-1 yr-1 were achieved even under rain-fed conditions. In irrigated plots, Siberian elm production was double than the production of biomass under rain-fed conditions; however, small differences were obtained between the 2 different irrigation doses under study. Biomass yield was greater for the highest planting density (6,666 plants ha–1) in irrigated plots, but significant differences were not found between the 2 densities in rain-fed plots. The clone AF-2 showed the highest production (14,000 kg ha-1 yr-1) during the first cycle, however during the second cycle its growth was lower because of a high mortality rate after regrowth and I-214 achieves the greatest production (14,000 kg ha-1 yr-1). An additional water supply provided a greater amount of biomass, but over about 6500 m3 ha-1 yr-1 of water the production is constant. Leaf water potential has been shown to be a useful tool for finding out plant water status. Irrigated elms hardly suffered water stress, while rain-fed elms suffered a pronounced water stress, which was more marked at the end of the vegetative period. Most of poplars did not show water stress; leaf water potentials only showed an important water stress in the plots irrigated with the lowest doses. LAI increases with shoot age and it ranges from 2 to 4 m2 m−2 in poplars and from 2 to 7 m2 m−2 in elms. A good relationship has been found between this index and Siberian elm production. In general, Siberian elm could be a good alternative to produce woody biomass in rainfed plots, while poplar could be used in irrigated plots if a suitable clone and irrigation dose are chosen.