Methods for the analysis of multi-scale cell dynamics from fluorescence microscopy images

La embriogénesis es el proceso mediante el cual una célula se convierte en un ser un vivo. A lo largo de diferentes etapas de desarrollo, la población de células va proliferando a la vez que el embrión va tomando forma y se configura. Esto es posible gracias a la acción de varios procesos genéticos, bioquímicos y mecánicos que interaccionan y se regulan entre ellos formando un sistema complejo que se organiza a diferentes escalas espaciales y temporales. Este proceso ocurre de manera robusta y reproducible, pero también con cierta variabilidad que permite la diversidad de individuos de una misma especie. La aparición de la microscopía de fluorescencia, posible gracias a proteínas fluorescentes que pueden ser adheridas a las cadenas de expresión de las células, y los avances en la física óptica de los microscopios han permitido observar este proceso de embriogénesis in-vivo y generar secuencias de imágenes tridimensionales de alta resolución espacio-temporal. Estas imágenes permiten el estudio de los procesos de desarrollo embrionario con técnicas de análisis de imagen y de datos, reconstruyendo dichos procesos para crear la representación de un embrión digital. Una de las más actuales problemáticas en este campo es entender los procesos mecánicos, de manera aislada y en interacción con otros factores como la expresión genética, para que el embrión se desarrolle. Debido a la complejidad de estos procesos, estos problemas se afrontan mediante diferentes técnicas y escalas específicas donde, a través de experimentos, pueden hacerse y confrontarse hipótesis, obteniendo conclusiones sobre el funcionamiento de los mecanismos estudiados. Esta tesis doctoral se ha enfocado sobre esta problemática intentando mejorar las metodologías del estado del arte y con un objetivo específico: estudiar patrones de deformación que emergen del movimiento organizado de las células durante diferentes estados del desarrollo del embrión, de manera global o en tejidos concretos. Estudios se han centrado en la mecánica en relación con procesos de señalización o interacciones a nivel celular o de tejido. En este trabajo, se propone un esquema para generalizar el estudio del movimiento y las interacciones mecánicas que se desprenden del mismo a diferentes escalas espaciales y temporales. Esto permitiría no sólo estudios locales, si no estudios sistemáticos de las escalas de interacción mecánica dentro de un embrión. Por tanto, el esquema propuesto obvia las causas de generación de movimiento (fuerzas) y se centra en la cuantificación de la cinemática (deformación y esfuerzos) a partir de imágenes de forma no invasiva. Hoy en día las dificultades experimentales y metodológicas y la complejidad de los sistemas biológicos impiden una descripción mecánica completa de manera sistemática. Sin embargo, patrones de deformación muestran el resultado de diferentes factores mecánicos en interacción con otros elementos dando lugar a una organización mecánica, necesaria para el desarrollo, que puede ser cuantificado a partir de la metodología propuesta en esta tesis. La metodología asume un medio continuo descrito de forma Lagrangiana (en función de las trayectorias de puntos materiales que se mueven en el sistema en lugar de puntos espaciales) de la dinámica del movimiento, estimado a partir de las imágenes mediante métodos de seguimiento de células o de técnicas de registro de imagen. Gracias a este esquema es posible describir la deformación instantánea y acumulada respecto a un estado inicial para cualquier dominio del embrión. La aplicación de esta metodología a imágenes 3D + t del pez zebra sirvió para desvelar estructuras mecánicas que tienden a estabilizarse a lo largo del tiempo en dicho embrión, y que se organizan a una escala semejante al del mapa de diferenciación celular y con indicios de correlación con patrones de expresión genética. También se aplicó la metodología al estudio del tejido amnioserosa de la Drosophila (mosca de la fruta) durante el cierre dorsal, obteniendo indicios de un acoplamiento entre escalas subcelulares, celulares y supracelulares, que genera patrones complejos en respuesta a la fuerza generada por los esqueletos de acto-myosina. En definitiva, esta tesis doctoral propone una estrategia novedosa de análisis de la dinámica celular multi-escala que permite cuantificar patrones de manera inmediata y que además ofrece una representación que reconstruye la evolución de los procesos como los ven las células, en lugar de como son observados desde el microscopio. Esta metodología por tanto permite nuevas formas de análisis y comparación de embriones y tejidos durante la embriogénesis a partir de imágenes in-vivo. ABSTRACT The embryogenesis is the process from which a single cell turns into a living organism. Through several stages of development, the cell population proliferates at the same time the embryo shapes and the organs develop gaining their functionality. This is possible through genetic, biochemical and mechanical factors that are involved in a complex interaction of processes organized in different levels and in different spatio-temporal scales. The embryogenesis, through this complexity, develops in a robust and reproducible way, but allowing variability that makes possible the diversity of living specimens. The advances in physics of microscopes and the appearance of fluorescent proteins that can be attached to expression chains, reporting about structural and functional elements of the cell, have enabled for the in-vivo observation of embryogenesis. The imaging process results in sequences of high spatio-temporal resolution 3D+time data of the embryogenesis as a digital representation of the embryos that can be further analyzed, provided new image processing and data analysis techniques are developed. One of the most relevant and challenging lines of research in the field is the quantification of the mechanical factors and processes involved in the shaping process of the embryo and their interactions with other embryogenesis factors such as genetics. Due to the complexity of the processes, studies have focused on specific problems and scales controlled in the experiments, posing and testing hypothesis to gain new biological insight. However, methodologies are often difficult to be exported to study other biological phenomena or specimens. This PhD Thesis is framed within this paradigm of research and tries to propose a systematic methodology to quantify the emergent deformation patterns from the motion estimated in in-vivo images of embryogenesis. Thanks to this strategy it would be possible to quantify not only local mechanisms, but to discover and characterize the scales of mechanical organization within the embryo. The framework focuses on the quantification of the motion kinematics (deformation and strains), neglecting the causes of the motion (forces), from images in a non-invasive way. Experimental and methodological challenges hamper the quantification of exerted forces and the mechanical properties of tissues. However, a descriptive framework of deformation patterns provides valuable insight about the organization and scales of the mechanical interactions, along the embryo development. Such a characterization would help to improve mechanical models and progressively understand the complexity of embryogenesis. This framework relies on a Lagrangian representation of the cell dynamics system based on the trajectories of points moving along the deformation. This approach of analysis enables the reconstruction of the mechanical patterning as experienced by the cells and tissues. Thus, we can build temporal profiles of deformation along stages of development, comprising both the instantaneous events and the cumulative deformation history. The application of this framework to 3D + time data of zebrafish embryogenesis allowed us to discover mechanical profiles that stabilized through time forming structures that organize in a scale comparable to the map of cell differentiation (fate map), and also suggesting correlation with genetic patterns. The framework was also applied to the analysis of the amnioserosa tissue in the drosophila’s dorsal closure, revealing that the oscillatory contraction triggered by the acto-myosin network organized complexly coupling different scales: local force generation foci, cellular morphology control mechanisms and tissue geometrical constraints. In summary, this PhD Thesis proposes a theoretical framework for the analysis of multi-scale cell dynamics that enables to quantify automatically mechanical patterns and also offers a new representation of the embryo dynamics as experienced by cells instead of how the microscope captures instantaneously the processes. Therefore, this framework enables for new strategies of quantitative analysis and comparison between embryos and tissues during embryogenesis from in-vivo images.

Fenómenos no lineales y caóticos en células lógicas

El objetivo del presente trabajo es el de presentar la situación actual de las posibles relaciones entre los comportamientos de las células lógicas, empleadas en Computación Óptica, y algunos comportamientos no lineales obtenidos en sistemas complejos. Como se mostrará, las arquitecturas empleadas en sistemas de cálculo, y más en concreto, las unidades básicas de que están compuestas, pueden dar lugar a situaciones no previstas de antemano y, como consecuencia, generar procesos ajenos a los inicialmente previstos. En concreto se mostrará como de una célula lógica, pueden obtenerse comportamientos caóticos. Este estudio se extenderá al análisis de redes neuronales biológicas y a su posible modelización con las anteriores técnicas. Como caso concreto de estudio se ofrecerá una simulación de la retina de los vertebrados, obtenida mediante las células lógicas presentadas anteriormente.

Construcción y puesta a punto de un equipo para prueba del estrés termo-mecánico de células solares de concentración

El ciclo térmico natural de la célula y receptores en módulos CPV (Concentrated PhotoVoltaic) es considerado un punto débil en la operación de campo real de estos dispositivos, así como la fluctuación entre valores altos y bajos de niveles de irradiancia incidente en la célula, comúnmente causadas por nubes, produce un estrés termo-mecánico que puede ser motivo de fallo. La normativa IEC 6218 ha tenido en cuenta esta serie de problemas a la hora de diseñar una norma de calificación y homologación para módulos CPV. En concreto, este proyecto se va a basar en el test denominado "Thermal cycling test" que realiza un ciclo térmico en la base de la célula mientras se le inyectan pulsos de corriente. Sin embargo, este método produce un nivel de estrés un 50% menor que el estrés real en condiciones nominales. En este proyecto se diseña e implementa la máquina LYSS (Light cYcling Stress Source) que trata de realizar dos tipos de ciclos basados en el definido en la IEC 62108 con la variación de utilizar pulsos de luz directa a muy alta irradiancia focalizada en la parte activa de la célula en lugar de los pulsos de corriente mencionados. Con este método se pretende acelerar el proceso de degradación en la célula de manera que en tan solo 2 meses se pueda producir la misma que en 30 años de vida útil de la célula. En el primer tipo de ciclo la temperatura permanece constante durante la ejecución de los pulsos de luz y, en el segundo se realiza un ciclo térmico que varía entre una temperatura mínima y otra máxima durante estos pulsos. Además, se establece un criterio de fallo basado en la estimación de la resistencia serie de la célula a partir de los valores de su curva característica IV en condiciones de oscuridad. La metodología del proyecto realizado consiste en realizar un estudio detallado para identificar los componentes necesarios para construir la máquina, adquirirlos, llevar a cabo el montaje de éstos para que la máquina pueda implementar los ciclos diseñados, realizar los experimentos necesarios para caracterizar los diferentes dispositivos que componen la máquina, programar una aplicación de control, monitorización y adquisición de datos que comande la máquina, realizar una serie de pruebas basadas en uno de los ciclos térmico-luminosos diseñados a receptores solares de concentración reales y, por último, observar la degradación que se pudiera producirse en ésta conforme aumenta el número de ciclos realizados analizando su curva IV en condiciones de oscuridad y obteniendo conclusiones sobre la fiabilidad de la célula y/o el receptor CPV.

Desarrollo de herramienta software para la caracterización de células y módulos de concentración fotovoltaica

La caracterización de módulos fotovoltaicos proporciona las especificaciones eléctricas que se necesitan para conocer los niveles de eficiencia energética que posee un módulo fotovoltaico de concentración. Esta caracterización se consigue a través de medidas de curvas IV, de igual manera que se obtienen para caracterizar los módulos convencionales. Este proyecto se ha realizado para la optimización y ampliación de un programa de medida y caracterización de hasta cuatro módulos fotovoltaicos que se encuentran en el exterior, sobre un seguidor. El programa, desarrollado en LabVIEW, opera sobre el sistema de medida, obteniendo los datos de caracterización del módulo que se está midiendo. Para ello en primer lugar se ha tomado como base una aplicación ya implementada y se ha analizado su funcionamiento para poder optimizarla y ampliarla para introducir nuevas prestaciones. La nueva prestación más relevante para la medida de los módulos, busca evitar que el módulo entre medida y medida, se encuentre disipando toda la energía que absorbe y se esté calentando. Esto se ha conseguido introduciendo una carga electrónica dentro del sistema de medida, que mantenga polarizado el módulo siempre y cuando, no se esté produciendo una medida sobre él. En este documento se describen los dispositivos que forman todo el sistema de medida, así como también se describe el software del programa. Además, se incluye un manual de usuario para un fácil manejo del programa. ABSTRACT. The aim of the characterization of concentrator photovoltaic modules (CPV) is to provide the electrical specifications to know the energy efficiency at operating conditions. This characterization is achieved through IV curves measures, the same way that they are obtained to characterize conventional silicon modules. The objective of this project is the optimization and improvement of a measurement and characterization system for CPV modules. A software has been developed in LabVIEW for the operation of the measurement system and data acquisition of the IV curves of the modules. At first, an already deployed application was taken as the basis and its operation was analyzed in order to optimize and extend to introduce new features. The more relevant update seeks to prevent the situation in which the module is dissipating all the energy between measurements. This has been achieved by introducing an electronic load into the measuring system. This load maintains the module biased at its maximum power point between measurement periods. This work describes the devices that take part in the measurement system, as well as the software program developed. In addition, a user manual is included for an easy handling of the program.