Análisis filogenético de bacterias endosimbióticas de Genista numidica

Los rizobios son bacterias del suelo capaces de formar unas estructuras especializadas en raíces de leguminosas donde reducen dinitrógeno. Algunas de estas leguminosas, como Genista numidica Spach, juegan un importante papel ecológico y económico por la fertilización y la remediación de suelos áridos, lo que ha impulsado el estudio y la caracterización de los rizobios específicos. En la presente investigación se analizan 53 cepas de rizobios aisladas de nódulos de raíces de G. numidica de la costa de Argelia. La diversidad genética de los aislados se llevó a cabo mediante la secuenciación del gen 16S rRNA y del espacio intergénico (ITS), región situada entre los genes 16S y 23S rRNA. Los endosimbiontes de G. numidica muestran una gran diversidad filogenética. Las secuencias de los aislados mostraron proximidad a ?-proteobacterias (Bradyrhizobium sp, Sphingobium sp) y ?-proteobacterias.

Presencia de sistemas de secreción de patógenos en bacterias endosimbióticas aisladas de Lupinus de la península Ibérica

Los rizobios son bacterias endosimbióticas capaces de fijar nitrógeno en estructuras especializadas de leguminosas. Esta simbiosis es altamente específica y depende, entre otros factores, de la capacidad de los rizobios de secretar proteínas efectoras a las células vegetales. Se han descrito diferentes sistemas de secreción en patógenos animales y vegetales y posteriormente también se han encontrado en algunos rizobios. En este trabajo se presenta el estudio de varios sistemas de secreción identificados en dos cepas LmjC e ISLU101 aisladas de Lupinus marie-josephae y Lupinus angustifolius respectivamente. LmjC posee un sistema de secreción tipo III formado por agrupación de 33 genes cuya expresión dependería del activador transcripcional TtsI mediado a su vez por flavonoides secretados por la planta huésped. La cepa ISLU101 tiene dos sistemas de tipo VI de 19 y 16 genes cada uno. La importancia en la simbiosis de estos sistemas se está estudiando en estos momentos.

Caracterización de bacterias endosimbióticas de Cytisus triflorus, una leguminosa útil para la restauración de suelos en el norte de África

La restauración de suelos degradados y pobres del norte de África puede producirse gracias al crecimiento espontáneo de leguminosas arbustivas como Cytisus triflorus L¿Herit. Parte del éxito de esta planta se debe a que es capaz de formar nódulos en sus raíces ocupados por bacterias denominadas rizobios que aportan dinitrógeno atmosférico fijado a la planta a cambio de fotosintatos. En este trabajo se presenta la caracterización de 37 rizobios aislados de C. triflorus en el norte de Argelia. Se indica morfología y color de las colonias, tiempo de generación, capacidad de nodulación con distintas plantas hospedadoras y tipos de nódulos que forman.

Reintroducción del altramuz endémico valenciano Lupinus mariaejosephae mediante la inoculación de cepas seleccionadas de bacterias del género Bradyrhizobium

Lupinus mariae-josephae es un altramuz endémico de la provincia de Valencia de reciente descubrimiento para la ciencia. Se conocen solo 4 poblaciones, algunas con miles de individuos pero todas ellas con grandes fluctuaciones interanuales, tanto demográficas como de éxito reproductivo. Es por ello que está incluida en el Catálogo Valenciano de Especies de Flora Amenazadas como "Especie Vulnerable". Con finalidad conservacionista se realizó una reintroducción de la especie dentro de su área de distribución conocida. Para ello, se sembraron semillas del altramuz valenciano en 3 grupos (tratamientos) diferentes, 2 de ellos inoculados con sendas cepas de una bacteria simbionte fijadora de nitrógeno atmosférico del género Bradyrhizobium; al tercero no se le inoculó ninguna bacteria. La bacteria, específica de esta leguminosa, y las cepas, fueron aisladas, estudiadas y seleccionadas en investigaciones anteriores. Al final del ciclo biológico de la especie se valoró el éxito en la supervivencia y el éxito reproductivo encontrando resultados óptimos sobre todo para una de las cepas utilizadas (LmjC) que previamente ya había demostrado un comportamiento eficiente en condiciones controladas. Estos resultados serán de gran ayuda para el futuro establecimiento de nuevas poblaciones del altramuz valenciano, con la posible mejora de su estatus de amenaza.

Aislamiento y caracterización de bacterias endosimbióticas procedentes de suelos contaminados por cobre en Chile

El uso intensivo de compuestos de cobre como herbicidas y fungicidas provoca la contaminación de suelos de uso agrícola debido a la acumulación de este metal en las capas más superficiales del suelo. Se sabe que la presencia de cobre y otros metales pesados afecta negativamente a las interacciones simbióticas que se establecen entre bacterias diazotróficas de los géneros Rhizobium, Sinorhizobium y Bradyrhizobium y leguminosas de interés agrícola (Laguerre et al., 2006). El objetivo de este trabajo es estudiar la diversidad de cepas endosimbióticas de leguminosas en suelos agrícolas chilenos que presentan un elevado contenido en cobre como resultado de la contaminación con residuos de extracciones mineras. Además, se pretende caracterizar el nivel de resistencia a cobre en las cepas aisladas con objeto de identificar aquellas altamente eficientes que puedan ser utilizadas como inoculantes microbianos. Para ello, se han prospectado 9 suelos agrícolas de las regiones III, V y VI de Chile con contenidos muy variables de metales. Utilizando estos suelos como inóculos de plantas trampa de leguminosas se ha obtenido una colección de 362 cepas aisladas de nódulos de guisante (Pisum sativum), judía (Phaseolus vulgaris) y alfalfa (Medicago sativa). Los análisis filogenéticos y los ensayos de resistencia a cobre realizados han permitido caracterizar y seleccionar aquellas cepas con mayores niveles de resistencia a este metal. Los resultados demuestran que los suelos altamente contaminados por cobre poseen una menor diversidad de bacterias endosimbióticas; las cepas más resistentes han sido aisladas de los suelos con niveles de contaminación intermedia. Los análisis fenotípicos y moleculares realizados sobre las cepas más resistentes han demostrado la existencia de sistemas de resistencia a cobre inducibles por este metal y potencialmente implicados en su homeostasis.

Simulación de evolución dirigida de bacteriófagos en poblaciones de bacterias en 2D

The research group is currently developing a biological computing model to be implemented with Escherichia Coli bacteria and bacteriophages M13, but it has to be modelled and simulated before any experiment in order to reduce the amount of failed attempts, time and costs. The problem that gave rise to this project is that there are no software tools which are able to simulate the biological process underlying that com- putational model, so it needs to be developed before doing any experimental implementation. There are several software tools which can simulate most of the biological processes and bacterial interactions in which this model is based, so what needs to be done is to study those available simulation tools, compare them and choose the most appropriate in order to be improved adding the desired functionality for this design. Directed evolution is a method used in biotechnology to obtain proteins or nucleic acids with properties not found in nature. It consists of three steps: 1) creating a library of mutants, 2) selecting the mutants with the desired properties, 3) replicating the variants identified in the selection step. The new software tool will be verified by simulating the selection step of a process of directed evolution applied to bacteriophages. ---ABSRACT---El grupo de investigación está desarrollando un modelo de computación biolóogica para ser implementado con bacterias Escherichia Coli y bacteriofagos M13, aunque primero tiene que ser modelizado antes de realizar cualquier experimento, de forma que los intentos fallidos y por lo tanto los costes se verán reducidos. El problema que dio lugar a este proyecto es la ausencia de herramientas software capaces de simular el proceso biológico que subyace a este modelo de computación biológica, por lo que dicha herramienta tiene que ser desarrollada antes de realizar cualquier implementación real. Existen varias herramientas software capaces de simular la mayoría de los procesos biológicos y las interacciones entre bacterias en los que se basa este modelo, por lo que este trabajo consiste en realizar un estudio de dichas herramientas de simulación, compararlas y escoger aquella más apropiada para ser mejorada añadiendo la funcionalidad deseada para este diseño. La evolución dirigida es un método utilizado en biotecnología para obtener proteínas o ácidos nucleicos con propiedades que no se encuentran en la naturaleza. Este método consiste en tres pasos: 1) crear una librería de mutantes, 2) seleccionar los mutantes con las propiedades deseadas, 3) Replicar los mutantes deseados. La nueva herramienta software será verificada mediante la simulación de la selección de mutantes de un proceso de evolución dirigida aplicado a bacteriofagos.

Una Técnica para diagnóstico de la sanidad de suelos y sustratos agrícolas; Fitopatometría

En un artículo anterior, publicado por Terralia, se puso de manifiesto la complejidad y dificultades de las técnicas clásicas de análisis de suelos para conocer su estado sanitario. En dicho trabajo se presentaba la complejidad que entraña analizar todos los posibles microorganismos fitopatógenos que viven en el suelo: hongos, bacterias, virus, etc. Este trabajo pretende dar a conocer una técnica que simplifica, considerablemente, los trabajos de diagnóstico, integrando, dentro de lo posible, todos los factores que intervienen en la expresión de una enfermedad de origen edáfico (figura 1). Por ejemplo en el potencial infeccioso de un suelo aparecen como factores determinantes los siguientes: densidad de inóculo patógeno en el suelo, capacidad infecciosa del inóculo patógeno y ambiente suelo.

Mejora del valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos (málico y fosfórico) y calor = Improvement of the protein value for ruminants of sunflower meal by combined treatments with acids (malic and orthophosphoric) and heat

El objetivo principal de esta tesis fue incrementar el valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos y calor para proteger sus proteínas frente a la degradación ruminal. Estos estudios comprenden dos experimentos realizados sobre ovinos mediante tecnologías in vitro (experimento 1) o in situ e in vivo (experimento 2), empleando siempre dos ácidos: málico u ortofosfórico. Aprovechando este último experimento, también se consideraron otros objetivos de carácter metodológico con el fin de mejorar la precisión de las estimas de i) la degradabilidad ruminal y la digestibilidad intestinal de la proteína y los aminoácidos (AAs) de los alimentos y ii) la síntesis microbiana ruminal y su contribución al flujo post-ruminal de nutrientes al animal. En el experimento 1 (capítulo 2) se efectuaron cuatro ensayos in vitro para estudiar la influencia de distintos factores que puedan afectar la eficacia de estos tratamientos. En cada ensayo se utilizó una réplica por tratamiento (dos para el tratamiento control) y dos bolsas vacías (empleadas para corregir la contaminación microbiana) en cada una de las cuatro botellas del incubador (ANKOM Daisy II). Cada botella contenía 2 l de medio de incubación, saturado con CO2 para asegurar la anaerobiosis. Este medio consistió en una mezcla de solución McDougall y liquido ruminal filtrado en relación 4:1. El liquido ruminal fue obtenido de 2 corderos canulados en rumen, utilizándose bien solo o mezclado con el del otro cordero en una relación 3:1. Así, cada botella de incubación contenía un inoculo ruminal diferente. Las incubaciones se realizaron a 39 ºC durante 20 h, siendo las bolsas lavadas con agua corriente y almacenadas a -20 ºC. Tras ser descongeladas, se lavaron 3 veces durante 5 min en una mini-lavadora de turbina, se desecaron a 80 ºC durante 48 h y se destinaron íntegras al análisis de N-Kjeldahl. En el ensayo 1 se estudió el efecto del volumen de disolución de dos dosis de ácido ortofosfórico (0,4 y 1,2 equivalentes gramo (eq)/kg de harina de girasol), testando cinco volúmenes de disolución (80, 160, 240, 320 and 400 ml/kg de harina) para cada dosis, desecándose las harinas a 60 ºC hasta sequedad al tacto. La proteína bruta (PB) indegradada se incremento con la dosis de ácido empleada y también (como tendencia, P < 0,1) con el volumen de dilución. En base a ello en los siguientes ensayos se utilizo el volumen de dilución mayor (400 ml/kg). En el ensayo 2 se estudió el efecto de la dosis y del tipo de ácido a cuatro dosis (1,2; 2,4; 3,6 y 4,8 eq/kg), secándose igualmente las muestras tratadas a 60 ºC. La PB indegradada aumentó con la dosis de ácido, siendo también mayor para el ácido málico, tanto en este ensayo como en los posteriores. En el ensayo 3 se estudiaron los efectos de los dos ácidos, cuatro concentraciones (0,6; 1,2; 1,8 y 2,4 eq/kg) y tres tratamientos térmicos para el secado de las muestras (100, 150 and 200 ºC durante 60, 30 y 20 minutos, respectivamente). Con los tratamientos térmicos a 100 y 150 ºC no hubo un incremento de protección para concentraciones superiores a 0,8 eq/kg para ambos ácidos. Para incrementar la protección fue necesario aumentar la temperatura a 200 ºC y la dosis a 1,2 eq/kg, no observándose un aumento de protección a dosis mayores. En el ensayo 4 se estudiaron los efectos sobre la lisina disponible, la solubilidad de la PB en saliva artificial de McDougall y la PB indegradada in vitro de tratar la harina solo con agua o con disoluciones de ambos ácidos a dosis de 0,8 eq/kg y temperaturas de secado de 100 ó 150 ºC en las mismas condiciones que en el ensayo 3. No se apreciaron efectos sobre la lisina disponible para ninguno de los tratamientos. El efecto específico de los ácidos quedo demostrado tanto por la fuerte reducción de la solubilidad de la PB como por el aumento de la PB indegradada frente al tratamiento con agua. En conjunto, los resultados de este experimento mostraron que la eficacia de estos tratamientos depende del tipo y dosis de ácido y de su dilución, así como de las condiciones de secado. Como tratamiento de mayor interés a aplicar posteriormente en el experimento 2 se consideró una dosis de 0,8 eq/kg de harina, aplicada en un volumen de 400 ml/kg (correspondiente a soluciones 1 M y 0,67 M para los ácidos málico y ortofosfórico, respectivamente) y desecación a 150 ºC. El experimento 2 (capítulos 3 a 7) se realizó con un diseño en cuadrado latino 3x3, empleando tres corderos canulados en rumen y duodeno y tres dietas isoproteicas: U, M y P, que incluían harinas de girasol sin tratar (control) y tratadas con acido málico u ortofosfórico, respectivamente. La harina de girasol se trató en las condiciones ya indicadas siendo necesarias 6 horas para su secado en estufa. Las dietas incluían 40% de heno de raigrás italiano y 60% de concentrado a base de harina de girasol (tratada y/o sin tratar), trigo y corrector vitamínico-mineral, siendo suministradas a 75 g/kg P0.75 (equivalente a 2,3 × mantenimiento). La relación harina de girasol sin tratar y tratada fue de 100:0 en la dieta U y entorno a 40:60 en las dietas M y P. Tras 10 días de adaptación a la dieta, se estudiaron sucesivamente: i) el tránsito hasta el duodeno de las partículas del heno (solo en la dieta control) y de la harina de girasol marcadas previamente con europio e iterbio, respectivamente; ii) la fermentación ruminal durante el periodo postprandial, iii) la degradación ruminal in situ de la harina de girasol específica de cada dieta (y del trigo y el heno en la dieta control) y iv) la magnitud y composición del contenido ruminal mediante el vaciado manual del rumen-retículo. Durante todo el periodo experimental se infundio de forma continua una solución de sulfato amónico enriquecido en 15N (98 átomos %) para corregir la contaminación microbiana ruminal en los estudios in situ y para establecer las diferencias de composición química entre las bacterias libres (BAL) y adherentes (BAS) del rumen. Esta solución incluyó en los dos últimos días Li-Cr- EDTA para determinar la tasa de dilución ruminal. Posteriormente, y tras un periodo de al menos 10 días para eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta, se estudió la digestibilidad intestinal de los distintos alimentos mediante la técnica de bolsas móviles. La determinación del bypass (BP) o de la degradabilidad efectiva (DE) de la materia seca (MS) y de la PB se realizó por el método tradicional de integración matemática; estos valores se obtuvieron también para la PB y los AAs generando una muestra representativa del flujo post-ruminal del alimento en estudio en cada animal. Ello se realizó mediante la mezcla de los distintos residuos de incubación en base a la función que describe el flujo de alimento indegradado que abandona el rumen. Todos estos trabajos se realizaron considerando la tasa de salida de partículas del rumen (kp) y, según casos, considerando también la tasa de conminución y mezcla de las partículas en este compartimento (kc). Para este último caso se ha desarrollado también el modelo matemático que describe este flujo y permite este cálculo. Los valores no corregidos por la contaminación microbiana del BP (o de DE) de la PB resultantes de ambos métodos se han comparado tanto en las harinas de girasol como en los restantes alimentos de la dieta, obteniéndose valores similares, sin apreciarse desviaciones sistemáticas. Sobre las muestras compuestas representativas de la composición química del BP se determino la digestibilidad intestinal efectiva (DIE) de la MS, PB y AAs. Todos los valores resultantes de esta técnica fueron corregidos para la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen. Los estudios de transito digestivo se realizaron tras suministrar en el comedero a los corderos una dosis simple de los alimentos marcados, seguida de la toma de muestras de la digesta duodenal durante 82 h. En la dieta testigo se suministraron simultáneamente el heno de raigrás y la harina de girasol, mientras que en las otras dietas solo se suministró esta última. La harina de girasol mostro un mayor valor para kc frente al heno (0,5766 v. 0,0892, /h), mientras que no hubo diferencias entre los dos alimentos para kp (0,0623 v. 0,0609, /h). Para la harina de girasol no se apreciaron diferencias entre dietas para kc, pero si se redujo de manera moderada la tasa kp con los tratamientos, siendo ésta también menor al utilizar ácido ortofosfórico frente al uso de ácido malico (0,0577 v. 0,0600, /h). El empleo de las harinas tratadas no modifico los parámetros de fermentación ruminal, la composición de los contenidos ruminales o la tasa de dilución del rumen. Los valores efectivos del BP y de DIE de la MS, PB y AAs de las harinas de girasol se obtuvieron considerando kc y kp, conjuntamente. Los tratamientos de protección incrementaron el BP de MS y PB en 48,5 y 268% de media, respectivamente. Estos incrementos se debieron principalmente al descenso de la fracción soluble y de la velocidad de degradación, pero también al aumento de la fracción indegradable, especialmente usando ácido ortofosfórico. Con los tratamientos se incrementó también la DIE de la MS (108% de media) y de la PB con gran diferencia entre los ácidos málico y ortofosfórico (20,7 v. 11,8%). Como consecuencia de estos cambios la protección aumentó la fracción realmente digerida en el intestino en 211% (MS) y 325% (PB), sin efectos entre ambos ácidos. Considerando la reducción del suministro de energía fermentable para los microorganismos ruminales asociada a la protección y los parámetros indicados por el sistema PDI francés para la síntesis de proteína microbiana digestible, la eficacia de conversión de PB en proteína metabolizable aumentó de 0,244 a 0,559 y 0,515 con el tratamiento con acido málico y ortofosfórico, respectivamente. El contenido en aminoácidos (AAs) fue similar en todas las harinas salvo por una disminución de lisina en las harinas tratadas. De forma análoga a la PB, los tratamientos de protección incrementaron el BP y la DIE de la mayoría de AAs. El aporte de AAs metabolizabes de la harina se multiplico en 3,87 para los AAs azufrados y en menor medida (2,5 veces) para la lisina, como consecuencia de las pérdidas sufridas a consecuencia del tratamiento térmico. Estos tratamientos se muestran, por tanto, útiles para incrementar el valor proteico de la harina de girasol, si bien su empleo junto con concentrados proteicos ricos en lisina bypass digestible mejoraría el perfil de la proteína metabolizable. La corrección de la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen se asoció en todos los alimentos testados y, de forma general, con reducciones del BP y de su DIE en todas las fracciones estudiadas. Estas reducciones fueron pequeñas en todos los concentrados, de forma acorde con los muy pequeños niveles de contaminación registrados tanto en las harinas de girasol como en el grano de trigo. Por el contrario, esta contaminación, al igual que los efectos de su corrección, fueron muy importantes en el heno de raigrás. Esta contaminación aumentó al tener en cuenta kc. Así, para la proporción de PB de origen microbiano existente en las muestras compuestas representativas del BP, este aumento fue significativo para el heno de raigrás (0,463 v. 0,706) y solo numérico para la harina de girasol (0,0170 v. 0,0208). La reducción de las estimas de DIE al corregir esta contaminación fue consecuencia de la eliminación de forma casi completa de los microorganismos adherentes en todos los residuos testados. Así, esta biomasa se redujo en 96,1% como media de 7x3 observaciones. Como resultado de las diferencias acumulativas a nivel del rumen e intestino, la no corrección de la contaminación microbiana junto con la no consideración de kc condujo a fuertes sobrestimaciones de la PB digerida en el intestino. Ésta fue de 39% en la harina de girasol (0,146 v. 0,105) y de 761% en el heno de raigrás (0,373 v. 0,0433). Estos resultados muestran que es necesario considerar tanto kc como corregir la contaminación microbiana para obtener estimas in situ precisas en forrajes, mientras que en concentrados, siempre que la contaminación microbiana sea pequeña, es más importante considerar kc. La elevada contaminación microbiana observada en el heno de raigrás se asoció también con importantes errores a nivel del N asociado a la fibra neutro (FND) y ácido (FAD) detergente (NDIN y ADIN, respectivamente) e incluso de estas fracciones de fibra, evidenciándose que estos métodos no eliminan completamente la contaminación microbiana que sufren los alimentos en su paso por el retículorumen. Así, en la muestra compuesta representativa de la composición química del flujo postruminal antes descrita, la sobrevaloración por no corregir la contaminación microbiana fue de 99,8; 24,2; 3,34 y 0,48% para NDIN, ADIN, FND y FAD, respectivamente. Las subvaloraciones asociadas para su DE fueron 34,1; 8,79; 4,41 y 0,51%, respectivamente. La DE corregida del NDIN y ADIN (0,743 y 0,728, respectivamente) mostró un aprovechamiento ruminal elevado de estos compuestos, si bien menor al de la PB total (0,85). El estudio de este aprovechamiento sobre los residuos de incubación ruminal a 6 y 72 h demostró, además, una más rápida degradación del ADIN frente al NDIN, así como un mayor potencial de degradación de este último en este alimento. Para comprobar si la digestión en el abomaso eliminaba la contaminación microbiana en la FND y FAD se estudio esta contaminación y sus posibles errores en muestras liofilizadas de contenidos ruminales y duodenales correspondientes a una dieta mixta de similar composición a la utilizada en el experimento 2, comparándose, además, las diferencias entre la extracción secuencial o directa de la FAD. Utilizando como referencia las BAS se apreciaron elevadas contaminaciones en la FND y FAD y su N asociado tanto en las muestras ruminales como en las duodenales. Sin embargo, los resultados de enriquecimiento en 15N de las partículas fueron intermedios entre los correspondientes a BAS y BAL lo que evidencia una elevada contaminación con BAL en estas muestras probablemente durante el proceso de liofilización. Ello conlleva una sobrevaloración de esta estimación. El método de extracción directa de FAD se mostró, por otra parte, marcadamente menos eficaz en la eliminación de la contaminación microbiana. Los resultados muestran la necesidad de corregir la contaminación microbiana para obtener estimaciones precisas de la degradabilidad de las proteínas de las paredes celulares vegetales. Estos errores deberían ser también considerados para FND y FAD en estudios in situ e in vivo. La elevada tasa fraccional de degradación del grano de trigo (60,9 y 42,0%/h para MS y PB, respectivamente) implico que su flujo de material indegradado (calculado solo en base a la kp obtenida para la harina de girasol) se redujera muy rápidamente, de forma que es casi nulo a 8 h tras la ingestión. Los valores corregidos de PB digerida en el intestino (0,15) representan solo el 18,7% de la proteína metabolizable, lo que muestra que el valor proteico del grano de trigo está estrechamente ligado a la síntesis de proteína microbiana derivada de su fermentación. En el experimento 2 se observaron menores concentraciones para materia orgánica, lípidos y PB, así como en la proporción N-AAs/N total en BAL que en BAS, siendo, por el contrario, mayor su enriquecimiento en 15N. Estos últimos resultados se utilizaron (junto con los de otros trabajos previos de este equipo) para validar una predicción preexistente del enriquecimiento en 15N de las BAS a partir de este valor en las BAL. Esta ecuación, de muy alta precisión (R2 = 0.995), permite calcular la subvaloración que se comete en los aportes de nutrientes correspondientes a las BAS al usar las BAL como muestra de referencia. Esta subvaloración representa aproximadamente 21, 32,5 y 60% para PB, proteína verdadera y lípidos.

Aplicación de un tratamiento biológico a las aguas residuales provenientes de una destilería de alcohol de caña, utilizando un reactor UASB

En este trabajo se llevó a cabo el tratamiento de vinazas mediante dos tecnologías anaerobias. Se dividió en cuatro estudios técnicos. El primero fue el arranque y estabilización del reactor UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket), en dónde se evaluó la estabilización mediante la eficiencia de remoción de DQO y la granulación del lodo. El segundo estudio evaluó el rendimiento del reactor UASB frente a diferentes Cva. El tercer estudio evaluó el efecto del TRH sobre la eficiencia del reactor UASB, y el cuarto de ellos fue evaluar el rendimiento del RABF (Reactor Anaerobio de Biomasa Fija). El reactor UASB de 2,6 L de capacidad, fue arrancado por lotes, con seis ensayos utilizando vinaza como sustrato. Se obtuvieron eficiencias de remoción en DQO en un rango de 79-91%, en los seis lotes. Se obtuvo formación de gránulos con diámetro (Ø) de 0,85-1,15 mm y un coeficiente de esfericidad (Є) de 0,7-0,77. Se logró la granulación de lodos tras 2 meses de operación. Alcanzada la estabilización del reactor UASB, se siguió una operación en flujo continuo. Las Cva probadas de 1, 2, 4 y 6 gDQO/L.d para el reactor UASB dan una respuesta bastante favorable con respecto al rendimiento del reactor, ya que presento eficiencias de remoción de DQOs del 51 hasta el 76%, eficiencias similares a los reportados por la literatura. En el estudio de TRH se operó con Cva de 6 gDQO/L.d y los TRH fueron de 24, 12 ,5 ,3 y 1 día. El % de eliminación de DQO fue de 51, 60, 57, 60 y 63 % remoción en DQOsoluble, respectivamente. Se alcanzó una producción de biogás máximo de 5.283 ml/d, pero al reducir el TRH se observó una reducción proporcional del volumen total de biogás. El %CH4 contenido en el biogás aumento al disminuir el TRH, reflejando valores de 80 al 92 % de CH4. El RABF con un volumen de 8,2 L, utilizo tubos de plástico corrugado como medio de soporte para las bacterias. Se aplicaron las siguientes Cva; 0,5, 1, 3 y 6 gDQO/L.d. El reactor RABF presento una excelente remoción de la materia orgánica (80% DQOs), una producción de biogás estable, y un contenido en CH4 del biogás muy interesante. Sin embargo, para una Cva superior a 3 gDQO/L.d empezó un comportamiento inesperado de reducción de capacidad. Las condiciones hidrodinámicas del reactor UASB son decisivas para la formación de los gránulos, condición previa para iniciar el flujo continuo. Al operar el reactor UASB en modo continuo, se pudo evaluar las mejores condiciones de operación para este tipo de residuo (vinaza). La Cva de 6 gDQO/L.d para el reactor UASB alimentado con vinaza bruta representa el límite de su capacidad. Sin embargo, al aumentar la Cva se genera una mayor producción de biogás y metano. La eficiencia de remoción de la DQO soluble es independiente del TRH, para una Cva de 6 g DQO/L•d y las condiciones de TRH probadas (24, 12, 5, 3 y 1 días). Los valores de remoción de DQO alcanzados son un poco superior a los valores de biodegradabilidad anaerobia de la vinaza observados de 50 %. De manera general, la reducción del TRH o bien la dilución de la vinaza no presenta un efecto significativo sobre la remoción de la materia orgánica soluble, pero si lo presenta en la remoción de sulfatos reduciendo indirectamente su toxicidad. El soporte termoplástico inoculado en el RABF y alimentado con vinaza bruta, actuó como un filtro, además de obtener buenos resultados en eliminación de DQO, pero dada las dimensiones y la altura del relleno se frena la evacuación del metano. This work was carried out by treatment vinasses with two anaerobic technologies. It was divided into four technical studies. The first was the start up and stabilization Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) reactor, where the stability was evaluated by the removal efficiency of COD and sludge granulation. The second study evaluated the performance of the UASB reactor against different OLR. The third study evaluated the effect of HRT on the efficiency of the UASB reactor, and the fourth of which was evaluate the performance Fixed Biomass Anaerobic (FBA) reactor. The UASB reactor of 2,6 L capacity, was started in batch, with six assays using vinasse as substrate. Were obtained removal efficiencies of COD in the range of 79- 91% in the six batches. Forming granules were obtained with a diameter (Ø) of 0,85- 1,15 mm and sphericity coefficient (Є) of 0,7 to 0,77. Sludge granulation was achieved after 2 months of operation. Once stabilization is achieved of the UASB reactor, it was followed by a continuous flow operation. The OLR tested 1, 2, 4 and 6 gCOD/L.d for UASB reactor gives a very favorable response regarding the performance of the reactor, as presented COD5 removal efficiencies of 51 to 76%, similar efficiencies those reported in the literature The HRT study was operated with an OLR of 6 gCOD/L.d and HRT were 24, 12, 5, 3 and 1 day. The removal efficiency was 51, 60, 57, 60 and 63% in soluble COD, respectively. It reached a maximum biogas production of 5.283 ml / d, but by reducing the HRT showed a proportional reduction in the total volume of biogas. The %CH4 content in the biogas increased with decreasing TRH, reflecting values of 80 to 92% of CH4. The FBA reactor with a volume of 8,2 L, used corrugated plastic tubes as carrier for bacteria transportation. The following OLR was applied, 0,5, 1, 3 and 6 gCOD/L.d. The FBA reactor showed an excellent removal of organic matter (80% CODS), a stable biogas production, and CH4 content very interesting. However, for more than 3 gCOD/L.d OLR began with unexpected behavior of capacity reduction. The UASB reactor hydrodynamic conditions are decisive for the formation of the granules, precondition to start the continuous flow. By operating the UASB reactor in continuous mode, it was possible to evaluate the best operating conditions for this type of waste (vinasse). The OLR of 6 gCOD/L.d for the UASB reactor fed with raw vinasse represents the limit of its capacity. However, with increasing OLR creates increased biogas production and methane. The removal efficiency of soluble COD is independent of HRT for OLR of 6 gCOD/L.d and HRT conditions tested (24, 12, 5, 3 and 1 day). COD Removal values achieved are slightly higher than the values of the vinasse anaerobic biodegradability of observed at 50%. Generally, reduction of HRT or vinasse dilution does not present a significant effect on the removal of the soluble organic matter; however if it occurs in the removal of sulfate reducing indirectly its toxicity. The thermoplastic support inoculated in FBA reactor and fed with raw vinasse, acted as a filter, in addition to obtaining good results in COD removal, but given the size and height of the filling slows evacuation of methane.

Implementación de algoritmos de ensamblaje de genomas en sistemas de memoria compartida y memoria distribuida

El desarrollo de algoritmos ensambladores de genes y la utilización de estos está viviendo un aumento muy espectacular en los últimos años. Debido a las mejoras ofrecidas en los dispositivos hardware de los numerosos supercomputadores que existen hoy en día se pueden realizar experimentos científicos de una manera más asequible que hace unos años. Este proyecto servirá como introducción en el complejo mundo de algoritmos científicos, más concretamente en algoritmos ensambladores de genomas. Veremos de primera mano cómo utilizar estas nuevas tecnologías, con ejemplos sencillos, pero con un desarrollo lo bastante importante para darnos una idea del funcionamiento de todas las fases de experimentación que engloban los algoritmos ensambladores y la utilización de la programación paralela en supercomputadores. Concretamente en este proyecto se van a analizar exhaustivamente una serie de algoritmos ensambladores que serán probados en uno de los supercomputadores más potentes de España, el Magerit 2. En estas pruebas vamos a proceder al ensamblado de genomas de tres tipos de organismos como bacterias (Staphylococcus Aureus, y Rhodobacter Sphaeroides) y una prueba gran escala con el genoma del Cromosoma 14 del Homo Sapiens Sapiens (Ser humano). Después procederemos a la comparación de todos los resultados obtenidos para poder comprobar que algoritmos realizan mejor su trabajo y ajustar dicha decisión a las necesidades que tenemos actualmente para buscar un algoritmo eficaz.

Effect of type of dietary carbohydrates on digestion, intestinal barrier and growth performance in 25-d weaned rabbits

Los objetivos globales de esta tesis han sido estudiar el efecto que los carbohidratos de la dieta ejercen sobre los rendimientos productivos, la barrera intestinal, y la digestión de animales destetados a 25 días de edad. Además se ha estudiado cuál es el mejor periodo para determinar la digestibilidad fecal tras el destete a esta edad. En el primer experimento se estudió el efecto de la fibra neutro detergente soluble (FNDS) sobre la barrera intestinal, digestión, microbiota intestinal y rendimientos productivos de gazapos en gazapos en la fase post-destete. Se diseñaron tres piensos isonutritivos en los que la única fuente de variación fueron los niveles de fibra soluble. A partir de una dieta control (AH) con 103 g/kg de materia seca de FNDS y alfalfa como fuente principal de fibra, se sustituyó la mitad de esta alfalfa por una mezcla de pulpa de remolacha y pulpa de manzana (75:25) en el pienso B-AP y por una mezcla de cascarilla y concentrado de proteína de soja (88:12) en el pienso OH, obteniéndose 131 y 79 g/kg de FNDS sobre materia seca, respectivamente. Los conejos se destetaron a 25 días y fueron alimentados con los piensos experimentales hasta los 35 días de edad, momento en el que se sacrificaron para la determinación de la digestibilidad ileal aparente (DIA) de la materia seca (MS), proteína bruta (PB) y almidón, la morfología de la mucosa, y actividad enzimática en el yeyuno, el tejido linfoide asociado a la mucosa, así como la microbiota intestinal. Para la determinación de la morfología de la mucosa se utilizaron adicionalmente 19 animales lactantes de 35 días de edad. Para el estudio de la tasa de mortalidad, se utilizaron 118 animales más por tratamiento que recibieron los piensos experimentales durante las dos semanas post-destete y posteriormente un pienso comercial hasta los 60 días de edad. Los animales recibieron durante todo el experimento medicación en el agua de bebida (100 ppm de apramicina sulfato y 120 ppm de tilosina tartrato). El nivel de fibra soluble mejoró los parámetros que se utilizaron para la caracterización del estado de la barrera intestinal. Los conejos alimentados con el mayor nivel de FNDS en el pienso presentaron una mayor longitud de los villi (P=0.001), un mayor ratio longitud villi/profundidad de las criptas (8.14; P=0.001), una mayor actividad disacaridásica (8671 μmol de glucosa/g de proteína; P=0.019), así como una mayor digestibilidad ileal (96.8%; P=0.002), observándose una reducción en el flujo ileal de almidón a medida que se incrementó el nivel de fibra soluble en el pienso (1,2 vs 0,5 g/d; P=0.001). Los animales lactantes a 35 días de edad presentaron un ratio longitud de villi/profundidad de las criptas menor que el observado en aquéllos alimentados con el pienso B-AP (6.70), pero superior al de los piensos AH y OH. Niveles inferiores de NDFS tendieron (P=0.074) a incrementar la respuesta inmune de tipo celular (linfocitos CD8+). El pienso también afectó a la producción de IL2 (CD25+; P=0.029; CD5+CD25+; P=0.057), pero sin llegar a establecerse una clara relación con el nivel de fibra soluble. La diversidad de la microbiota intestinal no se vio afectada por el pienso (P ≥ 0.38). Los animales alimentados con las piensos B-AP y AH presentaron una reducción en la frecuencia de detección de Clostridium perfringens tanto en íleon (P=0.062) como en ciego (4.3 vs. 17.6%, P =0.047), comparado con el pienso OH. Además la tasa de mortalidad (118 gazapos/pienso) disminuyó de 14.4% en el pienso OH a 5.1% en el pienso B-AP. Entre los 32 y los 35 días de edad se determinó la digestibilidad fecal aparente (14/pienso) de la materia seca (MS), energía bruta (EB), proteína bruta (PB), fibra neutro detergente (FND), fibra ácido detergente (FAD) y almidón. Este grupo, junto con otros nueve animales por tratamiento se utilizaron para determinar el peso del estómago y el ciego, la concentración cecal de ácidos grasos volátiles (AGV) y amoniaco (NH3), así como las tasas de similitud de la microbiota intestinal. Además se estudiaron los rendimientos productivos (35 animales/tratamiento) de los gazapos durante todo el período de cebo, consumiendo los piensos experimentales desde el destete hasta los 35 días y posteriormente un pienso comercial hasta los 60 días de edad. Niveles crecientes de FNDS mejoraron la digestibilidad fecal de la materia seca (MS) y energía (P<0.001). La inclusión FNDS aumentó de manera lineal el peso del contenido cecal (P=0.001) y el peso del aparato digestivo completo (P=0.008), y en los días previos al sacrificio disminuyó de manera lineal el consumo medio diario (P=0.040). Se observó además, una disminución lineal (P≤0.041) del pH del estómago. No se encontró relación entre el pH, la concentración y proporciones molares de AGV y el nivel de FNDS. El pienso pareció tener un efecto, incluso superior al de la madre, sobre la tasa de similitud de la microbiota, y los efectos fueron mayores a nivel cecal que ileal. La eficacia alimenticia aumentó de manera lineal en un 12% entre piensos extremos tras el destete (25- 39d) y en un 3% en el período global de cebo con niveles mayores de NDFS. El consumo medio diario durante la fase post-destete y durante todo el período de cebo, tendió a aumen tar (P≤0.079) con niveles mayores de FNDS, sin embargo no se apreció efecto sobre la ganancia media diaria (P≥0.15). En conclusión, el incremento del nivel de fibra soluble en el pienso parece resultar beneficioso para la salud del animal ya que mejora la integridad de la mucosa, y reduce la frecuencia de detección de potenciales patógenos como C. perfringens y Campylobacter spp. Conforme a estos resultados, debería tenerse en cuenta el contenido en fibra soluble en la formulación de piensos de conejos en la fase post-destete. El objetivo del segundo experimento fue determinar el efecto de la fuente de almidón sobre la digestión, la microbiota intestinal y los rendimientos productivos en conejos destetados con 25 días de edad. Se formularon tres piensos isonutritivos en los que se modificaron las principales fuentes de almidón: trigo crudo, trigo cocido y una combinación de trigo y arroz cocido. Dos grupos de 99 y 193 animales se destetaron con 25 días de edad. El primero de ellos se utilizó para la determinación de los parámetros productivos conforme al mismo protocolo seguido en el experimento anterior. El segundo de los grupos se utilizó para la determinación de la digestibilidad fecal de 32 a 35 d, la digestibilidad ileal aparente (DIA) a 35 d, la morfología de la mucosa intestinal, los parámetros de fermentación cecal; así como, la caracterización de la microbiota intestinal. Se utilizaron además dos grupos adicionales de animales 384 (medicados) y 177 (no medicados) para estudiar el efecto de la suplementación con antibióticos en el agua de bebida sobre la mortalidad. El procesado térmico del trigo mejoró ligeramente la digestibilidad ileal del almidón (P=0.020) pero no modificó el flujo final de almidón que alcanzó el ciego, observándose una mayor frecuencia de detección de Campylobacter spp. y Ruminococcus spp. en ciego (P≤0.023), pero sin cambios a nivel ileal. El procesado térmico del trigo no afectó tampoco a los parámetros productivos, la mortalidad, la digestibilidad ileal y fecal o la morfología de la mucosa. La sustitución parcial del trigo cocido por arroz cocido, penalizó la digestibilidad ileal del almidón (P=0.020) e incrementó el flujo ileal de este nutriente al ciego (P=0.007). Sin embargo no afectó a la mortalidad, pese a que se detectaron cambios en la microbiota tanto a nivel ileal como cecal, disminuyendo la frecuencia de detección de Campylobacter spp. (en íleon y ciego), Helicobacter spp. (en íleon) y Ruminococcus spp (en ciego) e incrementando Bacteroides spp. (en ciego) (P≤0.046). El empleo de arroz cocido en las piensos post-destete no tuvieron efectos sobre los parámetros productivos, la mortalidad, la digestibilidad ileal y fecal a excepción del almidón, o la morfología de la mucosa. La suplementación con antibiótico redujo la fre cuencia de detección de la mayoría de las bacterias estudiadas (P≤0.048), sobre todo para Campylobacter spp., Clostridium perfringens y Propionibacterium spp. (P≤0.048), observándose un efecto mayor a nivel ileal que cecal, lo que se asoció a la bajada significativa (P<0.001) de la mortalidad. En conclusión, los resultados de este experimento indican que la fuente de almidón afecta a la microbiota intestinal pero no influiye sobre la salud del animal. En relación al procesado, el uso de trigo cocido junto con arroz cocido no mejora los resultados obtenidos con trigo duro, si bienserían necesarios más experimentos que confirmaran este punto. El último de los experimentos se centró en un aspecto metodológico. Dado que, los conejos destetados presentan un patrón digestivo diferente al de un animal adulto resultado de su inmadurez digestiva, el objetivo buscado era tratar de determinar el mejor procedimiento para la determinación de la digestibilidad fecal en los gazapos en la fase post-destete. Para tal fin se utilizaron 15 animales/tratamiento de tres camadas diferentes que se destetaron con 25 días, suministrándoles un pienso comercial de crecimiento-cebo. Se registró el consumo medio diario y la excreción diaria de heces desde el día 25 hasta el día 40 de edad para la determinación de la digestibilidad de la MS. La camada afectó al consumo medio diario y la excreción de heces (P=0.013 y 0.014, respectivamente), observándose una tendencia (P=0.061) en la digestibilidad. La edad afectó (P<0.001) a todos estos factores, incrementándose de manera más evidente la excreción que la ingestión de materia seca en la primera semana de vida, para aumentar de forma paralela a partir de la segunda. La correlación entre el consumo medio diario fue mayor con la excreción de heces del mismo día que con la del día siguiente, por lo que se utilizó el primero para la determinación de la digestibilidad de la MS (MSd). La MSd disminuyó de manera lineal hasta los 32 días de edad (2.17±0.25 unidades porcentuales por día), mientras que permaneció constante desde los 32 a los 40 días (69.4±0.47%). Por otro lado, la desviación estándar de la MSd se redujo cuando se incrementó el período de recogida de 2 a 6 días en un 54%. Conforme a los resultados obtenidos, se puede concluir que no es aconsejable comenzar las pruebas de digestibilidad antes de los 32 días de edad y que el número de animales necesario para detectar diferencias significativas entre tratamientos dependerá del período de recogida de heces. ABSTRACT The global aim of this thesis has been to study the effect of dietary carbohydrates on growth, performance, digestion and intestinal barrier in 25-d weaned rabbits. In addition there has also been studied which is the best period to determine the fecal digestibility after weaning. The first experiment focused on the effect of Neutral Detergent Soluble Fibre (NDSF) on gut barrier function, digestion, intestinal microbiota and growth performance n rabbits in the post-weaning period. Three isonutritive diets which only varied in the levels of soluble fiber were formulated such as it described as follows: a control diet (AH) containing 103 g of neutral detergent soluble fiber, including alfalfa as main source of fiber, was replaced by a mixture of beet and apple pulp (75-25) in the B-AP diet and, by a mix of oat hulls and soybean protein concentrate (88:12) in the OH diet, resulting 131 and 79 g of NDFS/kg of dry matter, respectively. Rabbits, weaned at 25 days of age, were fed the experimental diets up to 35 days of age, moment in which they were slaughtered for apparent ileal digestibility (AID) of dry matter (DM), crude protein (CP) and starch, mucosa morphology, sucrose activity, characterization of lamina propria lymphocytes and intestinal microbiota. To assess mucosal morphology, 19 suckling 35-d-old rabbits were also used. For mortality study, besides these animals, 118 additional rabbits per treatment were fed the experimental diets for two weeks period and thereafter received a commercial diet until 60 days of age. Rabbits were water medicated during the whole experimental period (100 ppm de apramicine sulphate and 120 ppm of tylosine tartrate). Level of soluble fiber improved all the parameters used for the characterization of the intestinal barrier condition. Villous height of the jejunal mucosa increased with dietary soluble fiber (P=0.001). Villous height of jejunal mucosa increased with dietary soluble fiber (P = 0.001). Rabbits fed the highest level of soluble fiber (BA-P diet) showed the highest villous height/crypth depth ratio (8.14; P = 0.001), sucrase specific activity (8671 μmol glucose/ g protein; P = 0.019), and the greatest ileal starch digestibility (96.8%; P = 0.002). The opposite effects were observed in rabbits fed decreased levels of soluble fiber (AH and OH diets; 4.70, 5,848 μmol of glucose/g of protein, as average, respectively). The lowest ileal starch digestibility was detected for animal fed OH diet (93.2%). Suckling rabbits of the same age showed a lower villous height/crypt depth ratio (6.70) compared with the B-AP diet group, but this ration was higher that the AH or OH diet groups. Lower levels of soluble fiber tended (P = 0.074) to increase the cellular immune response (CD8+ lymphocytes). Diet affected IL-2 production (CD25+, P = 0.029; CD5+CD25+, P = 0.057), with no clear relationship between soluble fiber and IL-2. The intestinal microbiota biodiversity was not affected by diets (P ≥ 0.38). Animals fed B-AP and AH diets had a reduced cecal frequency of detection compatible with Campylobacter spp. (20.3 vs. 37.8, P = 0.074), and Clostridium perfringens (4.3 vs. 17.6%, P = 0.047), compared with the OH diet group. Moreover, the mortality rates decreased from 14.4 (OH diet) to 5.1% (B-AP diet) with the increased presence of soluble fiber in the diet. Between 32 and 35 days of age, faecal apparent digestibility of dry matter (DM), gross energy (GE), crude protein (CP), neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF) and starch was determined (14/diet). This group, plus another nine rabbits/diet were used to determine weight of stomach and caecum and their contents, cecal fermentation traits and similarity rate (SR) of intestinal microbiota. Besides, growth performance parameters (35 rabbits/diet) were studied during the whole fattening period, in animals consuming the experimental feed after the weaning up to 35 days of age and later on a commercial diet up animals reached 60 days of age. Increasing levels of Neutral Detergent Soluble Fiber improved faecal dry matter and energy digestibility (P<0.001). NDSF inclusion improved linearly weight of the caecal content (P=0.001) and the total gastrointestinal tract (P=0.008), and in the previous days to slaughter a linear decrease of daily feed intake in diet with highest level of soluble fiber was also observed. Stomach pH decreased linearly with increasing levels of NDFS (P≤0.041). No relation between NDSF level on pH, concentration and molar proportion of VFA was found. Treatments appeared to influence the similarity rate of microbiota, even higher to mother effect. These effects were higher in ileum than in caecum. A linear positive effect of feed efficiency was observed, which increased around 12% in the two weeks post-weaning (25-39d) and 3% in the whole fattening period between extreme diets with highest levels of soluble fiber. Average daily feed intake during the two weeks after weaning and in the whole fattening period, tended (P≤0.079) to increase with highest levels of NDSF; although there were no effect on daily weight gain (≥0.15). In conclusion, an increase of soluble fiber in the feed seems to be beneficial for animal health, due to improve mucose integrity and reduce detection frequency of those poten tial pathogens like C. perfringens and Campylobacter spp. According to these results, level of soluble fiber should be taking care in feed rabbit formulation in the post-weaning period. The objective of the second experiment was to determine the effect of source of starch on digestion, intestinal microbiota and growth performance in twenty-five-day old weaned rabbits. To accomplish with this aim three iso-nutritive diets were formulated with different source of starch: raw wheat, boiled wheat and a combination of boiled wheat and boiled rice. Two groups of 99 and 193 rabbits were weaned at 25 days of age. The first group was used for growth performance determination following the same protocol than in previous experiment. The second group was used to determine faecal digestibility from 32 to 35 d, apparent ileal digestibility (AID) at 35 d, jejunal mucosa morphology, caecal fermentation traits and characterization of intestinal microbiota. For mortality, two additional groups of 384 (medicated) and 177 (not medicated) were used in order to study the effect of antibiotic water supply supplementation. Heat processing of starch slightly improved ileal digestibility of starch (P=0.020) but did not modify the flow of starch to the caecum. An increase in frequency of detection of Campylobacter spp. y Ruminococcus spp. was observed in the caecum (P≤0.023), with no changes at ileal level. Heat processing of wheat did not modify growth performance, mortality, ileal or faecal digestibility and mucosa morphology. Partial substitution of boiled wheat for boiled rice in the diet impaired ileal starch digestibility (P=0.020) and increased the ileal flow of this nutrient to the caecum (P=0.007). However, it did not affect mortality rate, although changes in the ileal and caecal intestinal microbiota were detected, decreasing the frequency of detection of Campylobacter spp. (both ileum and caecum), Helicobacter spp. (at ileum) and Ruminococcus spp (at caecum) and increasing the Bacteroides spp. (at caecum) (P≤0.046). The effect of boiled rice supplementation did not alter growth performance, mortality, ileal or faecal digestibility of other nutrients than starch, and mucosa morphology. Medication of rabbits reduced the ileal frequency of detection of most bacteria studied (P≤0.048), especially for Campylobacter spp., Clostridium perfringens y Propionibacterium spp. (P≤0.048), resulting the effect higher at ileal than caecal level and relating it with a strong reduction of mortality rate (P<0.001). In conclusion, the results of this experiment make think that the source of starch affects the intestinal microbiota but they do not seem to influence animal health. In relation to the effect of heat processed the use of cooked wheat or cooked rice it does not seem to im prove the results obtained with hard wheat, but there would be necessary more experiments that were confirming this point. The last experiment focused on a methodological aspect. Considering that, weaned rabbits have a different digestive pattern than older animals due to their digestive immaturity; the fixed objective was to determine the best procedure for faecal digestibility determination in young rabbits in the post-weaning period. Fifteen rabbits from 5 different litters were weaned at 25 days of age and fed with a commercial feed. Feed intake and faeces excretion were recorded daily from 25 to 40 days of age for dry matter digestibility (DMd) determination. Litter affected daily DM intake and excretion (P=0.013 y 0.014, respectively) and tended to affect DMd (P=0.061). Age affected all these factors (P<0.001), but ingestion increased slowly than dry matter excretion during the first week buth they evolved similarly in the second week. The correlation between daily feed intakes was higher with the faeces excretion of the day than with faeces excretion of the next day, and the first values were used to determine daily DMd. The DMd decreased linearly from weaning to 32 d of age (2.17±0.25 percentage units per day), whereas from 32 to 40 d remained constant (69.4±0.47%). On the other hand, average standard deviation of DMd decreased by 54% when the length of collection period increased from 2 to 6d. Consequently to the obtained results, it could be concluded that it would not be advisable to start digestibility trials before the 32 days of age and that the number of animals required to detect a significant difference among means would depend on the collection period.

Rapid microbiological detection method based on ultrasonic instrumentation

Los métodos de detección rápida de microorganismos se están convirtiendo en una herramienta esencial para el control de calidad en el área de la biotecnología, como es el caso de las industrias de alimentos y productos farmacéuticos y bioquímicos. En este escenario, el objetivo de esta tesis doctoral es desarrollar una técnica de inspección rápida de microoganismos basada en ultrasonidos. La hipótesis propuesta es que la combinación de un dispositivo ultrasónico de medida y un medio líquido diseñado específicamente para producir y atrapar burbujas, pueden constituir la base de un método sensible y rápido de detección de contaminaciones microbianas. La técnica presentada es efectiva para bacterias catalasa-positivas y se basa en la hidrólisis del peróxido de hidrógeno inducida por la catalasa. El resultado de esta reacción es un medio con una creciente concentración de burbujas. Tal medio ha sido estudiado y modelado desde el punto de vista de la propagación ultrasónica. Las propiedades deducidas a partir del análisis cinemático de la enzima se han utilizado para evaluar el método como técnica de inspección microbiana. En esta tesis, se han investigado aspectos teóricos y experimentales de la hidrólisis del peróxido de hidrógeno. Ello ha permitido describir cuantitativamente y comprender el fenómeno de la detección de microorganismos catalasa-positivos mediante la medida de parámetros ultrasónicos. Más concretamente, los experimentos realizados muestran cómo el oxígeno que aparece en forma de burbujas queda atrapado mediante el uso de un gel sobre base de agar. Este gel fue diseñado y preparado especialmente para esta aplicación. A lo largo del proceso de hidrólisis del peróxido de hidrógeno, se midió la atenuación de la onda y el “backscattering” producidos por las burbujas, utilizando una técnica de pulso-eco. Ha sido posible detectar una actividad de la catalasa de hasta 0.001 unidades/ml. Por otra parte, este estudio muestra que por medio del método propuesto, se puede lograr una detección microbiana para concentraciones de 105 células/ml en un periodo de tiempo corto, del orden de unos pocos minutos. Estos resultados suponen una mejora significativa de tres órdenes de magnitud en comparación con otros métodos de detección por ultrasonidos. Además, la sensibilidad es competitiva con modernos y rápidos métodos microbiológicos como la detección de ATP por bioluminiscencia. Pero sobre todo, este trabajo muestra una metodología para el desarrollo de nuevas técnicas de detección rápida de bacterias basadas en ultrasonidos. ABSTRACT In an industrial scenario where rapid microbiological methods are becoming essential tools for quality control in the biotechnological area such as food, pharmaceutical and biochemical; the objective of the work presented in this doctoral thesis is to develop a rapid microorganism inspection technique based on ultrasounds. It is proposed that the combination of an ultrasonic measuring device with a specially designed liquid medium, able to produce and trap bubbles could constitute the basis of a sensitive and rapid detection method for microbial contaminations. The proposed technique is effective on catalase positive microorganisms. Well-known catalase induced hydrogen peroxide hydrolysis is the fundamental of the developed method. The physical consequence of the catalase induced hydrogen peroxide hydrolysis is an increasingly bubbly liquid medium. Such medium has been studied and modeled from the point of view of ultrasonic propagation. Properties deduced from enzyme kinematics analysis have been extrapolated to investigate the method as a microbial inspection technique. In this thesis, theoretical and experimental aspects of the hydrogen peroxide hydrolysis were analyzed in order to quantitatively describe and understand the catalase positive microorganism detection by means of ultrasonic measurements. More concretely, experiments performed show how the produced oxygen in form of bubbles is trapped using the new gel medium based on agar, which was specially designed for this application. Ultrasonic attenuation and backscattering is measured in this medium using a pulse-echo technique along the hydrogen peroxide hydrolysis process. Catalase enzymatic activity was detected down to 0.001 units/ml. Moreover, this study shows that by means of the proposed method, microbial detection can be achieved down to 105 cells/ml in a short time period of the order of few minutes. These results suppose a significant improvement of three orders of magnitude compared to other ultrasonic detection methods for microorganisms. In addition, the sensitivity reached is competitive with modern rapid microbiological methods such as ATP detection by bioluminescence. But above all, this work points out a way to proceed for developing new rapid microbial detection techniques based on ultrasound.

Influencia de la inclusión de diferentes fuentes y niveles de fibra bajo condiciones sanitarias diferentes sobre los rendimientos productivos en lechones recién destetados.

En general la inclusión de fibra en piensos de lechones se asocia con una reducción del consumo y de los rendimientos productivos (Wellock et al., 2008; Montagne et al., 2012). Sin embargo, diversos autores indican que la inclusión de cantidades moderadas de ciertas fuentes de fibra en el pienso podría mejorar los rendimientos productivos en lechones recién destetados (Mateos et al., 2006; Hermes et al., 2009). De hecho, Bach Knudsen et al. (2008) y Wellock et al. (2008) observaron que la inclusión de fibra en el pienso disminuyó la incidencia de diarreas (ID). Pluske et al. (1998) encontraron una relación positiva entre la ID y la inclusión de fibra soluble en el pienso. Sin embargo es frecuente incluir niveles de hasta el 4-5% de pulpa de remolacha en piensos comerciales para reducir el ID. La fibra soluble de la dieta podría actuar como un substrato fermentativo reduciendo el pH y alterando el perfil microbiano. Por otro lado, la fibra insoluble podría estimular el funcionamiento del tracto gastrointestinal y mejorar la sanidad de los lechones, reduciendo la actividad de bacterias perjudiciales. La respuesta a la inclusión de fibra en piensos para lechones puede estar condicionada por factores tales como el tipo y el nivel de fibra así como las condiciones higio-sanitarias de los lechones. En particular, la limpieza y desinfección de la nave son consideradas factores claves para limitar la incidencia de diarreas post-destete (Madec et al., 1998). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el crecimiento y la incidencia de diarreas en lechones criados bajo condiciones higio-sanitarias adecuadas (naves limpias y desinfectadas) o inadecuadas (naves sucias) alimentados con dietas que diferían en el tipo y nivel de fibra utilizado.

Evolución temporal de las comunidades microbianas ruminales y los parámetros fermentativos en fermentadores Rusitec

Los fermentadores Rusitec (Czerkawski y Breckenridge, 1977) son uno de los tipos de fermentadores más ampliamente utilizados para simular in vitro la fermentación ruminal y permiten realizar estudios de larga duración (semanas). Sin embargo, debido a la prolongada extensión en el tiempo de este tipo de estudios se producen cambios cuantitativos y cualitativos en las poblaciones de microorganismos. Existen algunos estudios que han puesto de manifiesto la disminución de la población de protozoos a lo largo del período de incubación (Carro et al., 1995; Martínez et al., 2011), pero no existe información sobre otras poblaciones microbianas, a pesar de que uno de los requisitos que deberían cumplir los sistemas in vitro es mantener poblaciones microbianas representativas de las existentes en el rumen de los animales. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue estudiar la evolución en el tiempo de la abundancia de bacterias, hongos, protozoos y arqueas, así como de los parámetros ruminales en fermentadores Rusitec.

Análisis molecular de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel y eficiencia simbiótica en Rhizobium leguminosarum

Los suelos ultramáficos, que poseen elevadas concentraciones de níquel, cobalto y cromo de manera natural, son fuente de bacterias resistentes a altas concentraciones de metales. Se realizó la caracterización físico-química de seis suelos ultramáficos del suroeste europeo, seleccionándose un suelo de la región de Gorro, Italia, como el más adecuado para aislar bacterias endosimbióticas resistentes a metales. A partir de plantas-trampa de guisante y lenteja inoculados con suspensiones de ese suelo, se obtuvieron 58 aislados de Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) que fueron clasificados en 13 grupos según análisis de PCR-RAPDs. Se determinó la resistencia a cationes metálicos [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] de una cepa representante de cada grupo, así como la secuencia de los genomas de las cepas que mostraron altos niveles (UPM1137 y UPM1280) y bajos niveles (UPM1131 y UPM1136) de tolerancia a metales. Para identificar mecanismos de resistencia a metales se realizó una mutagénesis al azar en dicha cepa mediante la inserción de un minitransposón. El análisis de 4313 transconjugantes permitió identificar 14 mutantes que mostraron una mayor sensibilidad a Ni(II) que la cepa silvestre. Se determinó el punto de inserción del minitransposón en todos ellos y se analizaron en más detalle dos de los mutantes (D2250 y D4239). En uno de los mutantes (D2250), el gen afectado codifica para una proteína que presenta un 44% de identidad con dmeF (divalent efflux protein) de Cupriavidus metallidurans. Cadena arriba de dmeF se identificó un gen que codifica una proteína con un 39% de identidad con el regulador RcnR de Escherichia coli. Se decidió nombrar a este sistema dmeRF, y se generó un mutante en ambos genes en la cepa Rlv SPF25 (Rlv D15). A partir de experimentos de análisis fenotípico y de regulación se pudo demostrar que el sistema dmeRF tiene un papel relevante en la resistencia a Ni(II) y sobre todo a Co(II) en células en vida libre y en simbiosis con plantas de guisante. Ambos genes forman un operón cuya expresión se induce en respuesta a la presencia de Ni(II) y Co(II). Este sistema se encuentra conservado en distintas especies del género Rhizobium como un mecanismo general de resistencia a níquel y cobalto. Otro de los mutantes identificados (D4239), tiene interrumpido un gen que codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC. Aunque inicialmente fue identificado por su sensibilidad a níquel, experimentos posteriores demostraron que su elevada sensibilidad a metales era debida a su sensibilidad al medio TY, y más concretamente a la triptona presente en el medio. En otros medios de cultivo el mutante no está afectado específicamente en su tolerancia a metales. Este mutante presenta un fenotipo simbiótico inusual, siendo inefectivo en guisantes y efectivo en lentejas. Análisis de complementación y de mutagénesis dirigida sugieren que el fenotipo de la mutación podría depender de otros factores distintos del gen portador de la inserción del minitransposón. ABSTRACT Ultramafic soils, having naturally high concentrations of nickel, cobalt and chrome, are potential sources of highly metal-resistant bacteria. A physico-chemical characterization of six ultramafic soils from the European southwest was made. A soil from Gorro, Italy, was chosen as the most appropriated for the isolation of heavy-metal-resistant endosymbiotic bacteria. From pea and lentil trap plants inoculated with soil suspensions, 58 isolates of Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) were obtained and classified into 13 groups based on PCR-RAPDs analysis. The resistance to metallic cations [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] was analyzed in a representative strain of each group. From the results obtained in the resistance assays, the Rlv UPM1137 strain was selected to identify metal resistance mechanism. A random mutagenesis was made in UPM1137 by using minitransposon insertion. Analysis of 4313 transconjugants allowed to identify 14 mutants with higher sensitivity to Ni(II) than the wild type strain. The insertion point of the minitransposon was determined in all of them, and two mutants (D2250 and D4239) were studied in more detail. In one of the mutants (D2250), the affected gene encodes a protein with 44% identity in compared with DmeF (divalent efflux protein) from Cupriavidus metallidurans. Upstream R. leguminosarum dmeF, a gene encoding a protein with 39% identity with RcnR regulator from E. coli was identified. This protein was named DmeR. A mutant with both genes in the dmeRF deleted was generated and characterized in Rlv SPF25 (Rlv D15). From phenotypic and regulation analysis it was concluded that the dmeRF system is relevant for Ni(II) and specially Co(II) tolerance in both free living and symbiotic forms of the bacteria. This system is conserved in different Rhizobium species like a general mechanism for nickel and cobalt resistance. Other of the identified mutants (D4239) contains the transposon insert on a gene that encodes for an AraC-like transcriptional regulator. Although initially this mutant was identified for its nickel sensitivity, futher experiments demonstrated that its high metal sensitivity is due to its sensitivity to the TY medium, specifically for the tryptone. In other media the mutant is not affected specifically in their tolerance to metals. This mutant showed an unusual symbiotic phenotype, being ineffective in pea and effective in lentil. Complementation analysis and directed mutagenesis suggest that the mutation phenotype could depend of other factors different from the insertion minitransposon gene.