Conductancia del mesófilo en especies forestales: implicaciones en la respuesta fotosintética a la disponibilidad de agua y luz

La fotosíntesis es el proceso biológico que permite la producción primaria y, por tanto, la vida en nuestro planeta. La tasa fotosintética viene determinada por la ‘maquinaria’ bioquímica y las resistencias difusivas al paso del CO2 desde la atmósfera hasta su fijación en el interior de los cloroplastos. Históricamente la mayor resistencia difusiva se ha atribuido al cierre estomático, sin embargo ahora sabemos, debido a las mejoras en las técnicas experimentales, que existe también una resistencia grande que se opone a la difusión del CO2 desde los espacios intercelulares a los lugares de carboxilación. Esta resistencia, llamada normalmente por su inversa: la conductancia del mesófilo (gm), puede ser igual o incluso superior a la resistencia debida por el cierre estomático. En la presente tesis doctoral he caracterizado la limitación que ejerce la resistencia del mesófilo a la fijación de CO2 en diversas especies forestales y en distintos momentos de su ciclo biológico. En la fase de regenerado, hemos estudiado tres situaciones ambientales relevantes en el mayor éxito de su supervivencia, que son: el déficit hídrico, su interacción con la irradiancia y el paso del crecimiento en la sombra a mayor irradiancia, como puede suceder tras la apertura de un hueco en el dosel forestal. En la fase de arbolado adulto se ha caracterizado el estado hídrico y el intercambio gaseoso en hojas desarrolladas a distinta irradiancia dentro del dosel vegetal durante tres años contrastados en pluviometría. Para cada tipo de estudio se han empleado las técnicas ecofisiológicas más pertinentes para evaluar el estado hídrico y el intercambio gaseoso. Por su complejidad y la falta de un método que permita su cuantificación directa, la gm ha sido evaluada por los métodos más usados, que son: la discriminación isotópica del carbono 13, el método de la J variable, el método de la J constante y el método de la curvatura. Los resultados más significativos permiten concluir que la limitación relativa a la fotosíntesis por la conductancia estomática, del mesófilo y bioquímica es dependiente de la localización de la hoja en el dosel forestal. Por primera vez se ha documentado que bajo estrés hídrico las hojas desarrolladas a la sombra estuvieron más limitadas por una reducción en la gm, mientras que las hojas desarrolladas a pleno sol estuvieron más limitadas por reducción mayor de la conductancia estomática (gsw). Encontramos buena conexión entre el aparato fotosintético foliar y el sistema hídrico debido al alto grado de correlación entre la conductancia hidráulica foliar aparente y la concentración de CO2 en los cloroplastos en distintas especies forestales. Además, hemos mostrado diferentes pautas de regulación del intercambio gaseoso según las particularidades ecológicas de las especies estudiadas. Tanto en brinzales crecidos de forma natural y en el arbolado adulto como en plántulas cultivadas en el invernadero la ontogenia afectó a las limitaciones de la fotosíntesis producidas por estrés hídrico, resultando que las limitaciones estomáticas fueron dominantes en hojas más jóvenes mientras que las no estomáticas en hojas más maduras. La puesta en luz supuso un gran descenso en la gm durante los días siguientes a la transferencia, siendo este efecto mayor según el grado de sombreo previo en el que se han desarrollado las hojas. La aclimatación de las hojas a la alta irradiancia estuvo ligada a las modificaciones anatómicas foliares y al estado de desarrollo de la hoja. El ratio entre la gm/gsw determinó la mayor eficiencia en el uso del agua y un menor estado oxidativo durante la fase de estrés hídrico y su posterior rehidratación, lo cual sugiere el uso de este ratio en los programas de mejora genética frente al estrés hídrico. Debido a que la mayoría de modelos de estimación de la producción primaria bruta (GPP) de un ecosistema no incluye la gm, los mismos están incurriendo en una sobreestimación del GPP particularmente bajo condiciones de estrés hídrico, porque más de la mitad de la reducción en fotosíntesis en hojas desarrolladas a la sombra se debe a la reducción en gm. Finalmente se presenta un análisis de la importancia en las estimas de la gm bajo estrés hídrico de la refijación del CO2 emitido en la mitocondria a consecuencia de la fotorrespiración y la respiración mitocondrial en luz. ABSTRACT Photosynthesis is the biological process that supports primary production and, therefore, life on our planet. Rates of photosynthesis are determined by biochemical “machinery” and the diffusive resistance to the transfer of CO2 from the atmosphere to the place of fixation within the chloroplasts. Historically the largest diffusive resistance was attributed to the stomata, although we now know via improvements in experimental techniques that there is also a large resistance from sub-stomatal cavities to sites of carboxylation. This resistance, commonly quantified as mesophyll conductance (gm), can be as large or even larger than that due to stomatal resistance. In the present PhD I have characterized the limitation exerted by the mesophyll resistance to CO2 fixation in different forest species at different stages of their life cycle. In seedlings, we studied three environmental conditions that affect plant fitness, namely, water deficit, the interaction of water deficit with irradiance, and the transfer of plants grown in the shade to higher irradiance as can occur when a gap opens in the forest canopy. At the stage of mature trees we characterized water status and gas exchange in leaves developed at different irradiance within the canopy over the course of three years that had contrasting rainfall. For each study we used the most relevant ecophysiological techniques to quantify water relations and gas exchange. Due to its complexity and the lack of a method that allows direct quantification, gm was estimated by the most commonly used methods which are: carbon isotope discrimination, the J-variable, constant J and the curvature method The most significant results suggest that the relative limitation of photosynthesis by stomata, mesophyll and biochemistry depending on the position of the leaf within the canopy. For the first time it was documented that under water stress shaded leaves were more limited by a reduction in gm, while the sun-adapted leaves were more limited by stomatal conductance (gsw). The connection between leaf photosynthetic apparatus and the hydraulic system was shown by the good correlations found between the apparent leaf hydraulic conductance and the CO2 concentration in the chloroplasts in shade- and sun-adapted leaves of several tree species. In addition, we have revealed different patterns of gas exchange regulation according to the functional ecology of the species studied. In field grown trees and greenhouse-grown seedlings ontogeny affected limitations of photosynthesis due to water stress with stomatal limitations dominating in young leaves and nonstomatal limitations in older leaves. The transfer to high light resulted in major decrease of gm during the days following the transfer and this effect was greater as higher was the shade which leaves were developed. Acclimation to high light was linked to the leaf anatomical changes and the state of leaf development. The ratio between the gm/gsw determined the greater efficiency in water use and reduced the oxidative stress during the water stress and subsequent rehydration, suggesting the use of this ratio in breeding programs aiming to increase avoidance of water stress. Because most models to estimate gross primary production (GPP) of an ecosystem do not include gm, they are incurring an overestimation of GPP particularly under conditions of water stress because more than half of An decrease in shade-developed leaves may be due to reduction in gm. Finally, we present an analysis of the importance of how estimates of gm under water stress are affected by the refixation of CO2 that is emitted from mitochondria via photorespiration and mitochondrial respiration in light.

Functional response of Ulmus minor Mill. to drought, flooding and dutch elm disease

Ulmus minor es una especie arbórea originaria de Europa cuyas poblaciones han sido diezmadas por el hongo patógeno causante de la enfermedad de la grafiosis. La conservación de los olmos exige plantearse su propagación a través de plantaciones y conocer mejor su ecología y biología. Ulmus minor es un árbol de ribera, pero frecuentemente se encuentra alejado del cauce de arroyos y ríos, donde la capa freática sufre fuertes oscilaciones. Por ello, nuestra hipótesis general es que esta especie es moderadamente resistente tanto a la inundación como a la sequía. El principal objetivo de esta tesis doctoral es entender desde un punto de vista funcional la respuesta de U. minor a la inundación, la sequía y la infección por O. novo-ulmi; los factores que posiblemente más influyen en la distribución actual de U. minor. Con este objetivo se persigue dar continuidad a los esfuerzos de conservación de esta especie que desde hace años se dedican en varios centros de investigación a nivel mundial, ya que, entender mejor los mecanismos que contribuyen a la resistencia de U. minor ante la inoculación con O. novo-ulmi y factores de estrés abiótico ayudará en la selección y propagación de genotipos resistentes a la grafiosis. Se han planteado tres experimentos en este sentido. Primero, se ha comparado la tolerancia de brinzales de U. minor y U. laevis – otro olmo ibérico – a una inmersión controlada con el fin de evaluar su tolerancia a la inundación y comprender los mecanismos de aclimatación. Segundo, se ha comparado la tolerancia de brinzales de U. minor y Quercus ilex – una especie típica de ambientes Mediterránea secos – a la falta de agua en el suelo con el fin de evaluar el grado de tolerancia y los mecanismos de aclimatación a la sequía. El hecho de comparar dos especies contrastadas responde al interés en entender mejor cuales son los procesos que conducen a la muerte de una planta en condiciones de sequía – asunto sobre el que hay una interesante discusión desde hace algunos años. En tercer lugar, con el fin de entender mejor la resistencia de algunos genotipos de U. minor a la grafiosis, se han estudiado las diferencias fisiológicas y químicas constitutivas e inducidas por O. novo-ulmi entre clones de U. minor seleccionados a priori por su variable grado de resistencia a esta enfermedad. En el primer experimento se observó que los brinzales de U. minor sobrevivieron 60 días inmersos en una piscina con agua no estancada hasta una altura de 2-3 cm por encima del cuello de la raíz. A los 60 días, los brinzales de U. laevis se sacaron de la piscina y, a lo largo de las siguientes semanas, fueron capaces de recuperar las funciones fisiológicas que habían sido alteradas anteriormente. La conductividad hidráulica de las raíces y la tasa de asimilación de CO2 neta disminuyeron en ambas especies. Por el contrario, la tasa de respiración de hojas, tallos y raíces aumentó en las primeras semanas de la inundación, posiblemente en relación al aumento de energía necesario para desarrollar mecanismos de aclimatación a la inundación, como la hipertrofia de las lenticelas que se observó en ambas especies. Por ello, el desequilibrio del balance de carbono de la planta podría ser un factor relevante en la mortalidad de las plantas ante inundaciones prolongadas. Las plantas de U. minor (cultivadas en envases de 16 litros a media sombra) sobrevivieron por un prolongado periodo de tiempo en verano sin riego; la mitad de las plantas murieron tras 90 días sin riego. El cierre de los estomas y la pérdida de hojas contribuyeron a ralentizar las pérdidas de agua y tolerar la sequía en U. minor. Las obvias diferencias en tolerancia a la sequía con respecto a Q. ilex se reflejaron en la distinta capacidad para ralentizar la aparición del estrés hídrico tras dejar de regar y para transportar agua en condiciones de elevada tensión en el xilema. Más relevante es que las plantas con evidentes síntomas de decaimiento previo a su muerte exhibieron pérdidas de conductividad hidráulica en las raíces del 80% en ambas especies, mientras que las reservas de carbohidratos apenas variaron y lo hicieron de forma desigual en ambas especies. Árboles de U. minor de 5 y 6 años de edad (plantados en eras con riego mantenido) exhibieron una respuesta a la inoculación con O. novo-ulmi consistente con ensayos previos de resistencia. La conductividad hidráulica del tallo, el potencial hídrico foliar y la tasa de asimilación de CO2 neta disminuyeron significativamente en relación a árboles inoculados con agua, pero solo en los clones susceptibles. Este hecho enlaza con el perfil químico “más defensivo” de los clones resistentes, es decir, con los mayores niveles de suberina, ácidos grasos y compuestos fenólicos en estos clones que en los susceptibles. Ello podría restringir la propagación del hongo en el árbol y preservar el comportamiento fisiológico de los clones resistentes al inocularlos con el patógeno. Los datos indican una respuesta fisiológica común de U. minor a la inundación, la sequía y la infección por O. novo-ulmi: pérdida de conductividad hidráulica, estrés hídrico y pérdida de ganancia neta de carbono. Pese a ello, U. minor desarrolla varios mecanismos que le confieren una capacidad moderada para vivir en suelos temporalmente anegados o secos. Por otro lado, el perfil químico es un factor relevante en la resistencia de ciertos genotipos a la grafiosis. Futuros estudios deberían examinar como este perfil químico y la resistencia a la grafiosis se ven alteradas por el estrés abiótico. ABSTRACT Ulmus minor is a native European elm species whose populations have been decimated by the Dutch elm disease (DED). An active conservation of this species requires large-scale plantations and a better understanding of its biology and ecology. U. minor generally grows close to water channels. However, of the Iberian riparian tree species, U. minor is the one that spread farther away from rivers and streams. For these reasons, we hypothesize that this species is moderately tolerant to both flooding and drought stresses. The main aim of the present PhD thesis is to better understand the functional response of U. minor to the abiotic stresses – flooding and drought – and the biotic stress – DED – that can be most influential on its distribution. The overarching goal is to aid in the conservation of this emblematic species through a better understanding of the mechanisms that contribute to resistance to abiotic and biotic stresses; an information that can help in the selection of resistant genotypes and their expansion in large-scale plantations. To this end, three experiments were set up. First, we compared the tolerance to experimental immersion between seedlings of U. minor and U. laevis – another European riparian elm species – in order to assess their degree of tolerance and understand the mechanisms of acclimation to this stress. Second, we investigated the tolerance to drought of U. minor seedlings in comparison with Quercus ilex (an oak species typical of dry Mediterranean habitats). Besides assessing and understanding U. minor tolerance to drought at the seedling stage, the aim was to shed light into the functional alterations that trigger drought-induced plant mortality – a matter of controversy in the last years. Third, we studied constitutive and induced physiological and biochemical differences among clones of variable DED resistance, before and following inoculation with Ophiostoma novo-ulmi. The goal is to shed light into the factors of DED resistance that is evident in some genotypes of U. minor, but not others. Potted seedlings of U. minor survived for 60 days immersed in a pool with running water to approximately 2-3 cm above the stem collar. By this time, U. minor seedlings died, whereas U. laevis seedlings moved out of the pool were able to recover most physiological functions that had been altered by flooding. For example, root hydraulic conductivity and leaf photosynthetic CO2 uptake decreased in both species; while respiration initially increased with flooding in leaves, stems and roots possibly to respond to energy demands associated to mechanisms of acclimation to soil oxygen deficiency; as example, a remarkable hypertrophy of lenticels was soon observed in flooded seedlings of both species. Therefore, the inability to maintain a positive carbon balance somehow compromises seedling survival under flooding, earlier in U. minor than U. laevis, partly explaining their differential habitats. Potted seedlings of U. minor survived for a remarkable long time without irrigation – half of plants dying only after 90 days of no irrigation in conditions of high vapour pressure deficit typical of summer. Some mechanisms that contributed to tolerate drought were leaf shedding and stomata closure, which reduced water loss and the risk of xylem cavitation. Obviously, U. minor was less tolerant to drought than Q. ilex, differences in drought tolerance resulting mostly from the distinct capacity to postpone water stress and conduct water under high xylem tension among species. More relevant was that plants of both species exhibited similar symptoms of root hydraulic failure (i.e. approximately 80% loss of hydraulic conductivity), but a slight and variable depletion of non-structural carbohydrate reserves preceding dieback. Five- and six-year-old trees of U. minor (planted in the field with supplementary watering) belonging to clones of contrasted susceptibility to DED exhibited a different physiological response to inoculation with O. novo-ulmi. Stem hydraulic conductivity, leaf water potential and photosynthetic CO2 uptake decreased significantly relative to control trees inoculated with water only in DED susceptible clones. This is consistent with the “more defensive” chemical profile observed in resistant clones, i.e. with higher levels of saturated hydrocarbons (suberin and fatty acids) and phenolic compounds than in susceptible clones. These compounds could restrict the spread of O. novo-ulmi and contribute to preserving the near-normal physiological function of resistant trees when exposed to the pathogen. These results evidence common physiological responses of U. minor to flooding, drought and pathogen infection leading to xylem water disruption, leaf water stress and reduced net carbon gain. Still, seedlings of U. minor develop various mechanisms of acclimation to abiotic stresses that can play a role in surviving moderate periods of flood and drought. The chemical profile appears to be an important factor for the resistance of some genotypes of U. minor to DED. How abiotic stresses such as flooding and drought affect the capacity of resistant U. minor clones to face O. novo-ulmi is a key question that must be contemplated in future research.

Natural regeneration in mediterranean mixed forests: effect of environmental conditions on the physiological optimum niche of the species = Regeneración natural en masas mixtas mediterráneas: efecto de las condiciones ambientales en el nicho óptimo fisiológico de las especies

Los montes Mediterráneos han experimentado múltiples cambios en las últimas décadas (tanto en clima como en usos), lo que ha conducido a variaciones en la distribución de especies. El aumento previsto de las temperaturas medias junto con la mayor variabilidad intra e inter anual en cuanto a la ocurrencia de eventos extremos o disturbios naturales (como periodos prolongados de sequía, olas de frío o calor, incendios forestales o vendavales) pueden dañar significativamente al regenerado, llevándolo hasta la muerte, y jugando un papel decisivo en la composición de especies y en la dinámica del monte. La amplitud ecológica de muchas especies forestales puede verse afectada, de forma que se esperan cambios en sus nichos actuales de regeneración. Sin embargo, la migración latitudinal de las especies en busca de mejores condiciones, podría ser una explicación demasiado simplista de un proceso mucho más complejo de interacción entre la temperatura y la precipitación, que afectaría a cada especie de un modo distinto. En este sentido tanto la capacidad de adaptación al estrés ambiental de una determinada especie, así como su habilidad para competir por los recursos limitados, podría significar variaciones dentro de una comunidad. Las características fisiológicas y morfológicas propias de cada especie se encuentran fuertemente relacionadas con el lugar donde cada una puede surgir, qué especies pueden convivir y como éstas responden a las condiciones ambientales. En este sentido, el conocimiento sobre las distintas respuestas ecofisiológicas observadas ante cambios ambientales puede ser fundamentales para la predicción de variaciones en la distribución de especies, composición de la comunidad y productividad del monte ante el cambio global. En esta tesis investigamos el grado de tolerancia y sensibilidad que cada una de las tres especies de estudio, coexistentes en el interior peninsular ibérico (Pinus pinea, Quercus ilex y Juniperus oxycedrus), muestra ante los factores abióticos de estrés típicos de la región Mediterránea. Nuestro trabajo se ha basado en la definición del nicho óptimo fisiológico para el regenerado de cada especie a través de la investigación en profundidad del efecto de la sequía, la temperatura y el ambiente lumínico. Para ello, hemos desarrollado un modelo de predicción de la tasa de asimilación de carbono que nos ha permitido identificar las condiciones óptimas ambientales donde el regenerado de cada especie podría establecerse con mayor facilidad. En apoyo a este trabajo y con la idea de estudiar el efecto de la sequía a nivel de toda la planta hemos desarrollado un experimento paralelo en invernadero. Aquí se han aplicado dos regímenes hídricos para estudiar las características fisiológicas y morfológicas de cada especie, sobre todo a nivel de raíz y crecimiento del tallo, y relacionarlas con las diferentes estrategias en el uso del agua de las especies. Por último, hemos estudiado los patrones de aclimatación y desaclimatación al frio de cada especie, identificando los periodos de sensibilidad a heladas, así como cuellos de botella donde la competencia entre especies podría surgir. A pesar de que el pino piñonero ha sido la especie objeto de la gestión de estas masas durante siglos, actualmente se encuentra en la posición más desfavorable para combatir el cambio global, presentado el nicho fisiológico más estrecho de las tres especies. La encina sin embargo, ha resultado ser la especie mejor cualificada para afrontar este cambio, seguida muy de cerca por el enebro. Nuestros resultados sugieren una posible expansión en el rango de distribución de la encina, un aumento en la presencia del enebro y una disminución progresiva del pino piñonero a medio plazo en estas masas. ABSTRACT Mediterranean forests have undergone multiple changes over the last decades (in both climate and land use), which have lead to variations in the distribution of species. The expected increase in mean annual temperature together with the greater inter and intra-annual variability in extreme events and disturbances occurrence (such as prolonged drought periods, cold or heat waves, wildfires or strong winds) can significantly damage natural regeneration, up to causing death, playing a decisive role on species composition and forest dynamics. The ecological amplitude for adaptation of many species can be affected in such a way that changes in the current regeneration niches of many species are expected. However, the forecasted poleward migration of species seeking better conditions could be an oversimplification of what is a more complex phenomenon of interactions among temperature and precipitation, that would affect different species in different ways. In this regard, either the ability to adapt to environmental stresses or to compete for limited resources of a single species in a mixed forest could lead to variations within a community. The ecophysiological and morphological traits specific to each species are strongly related to the place where each species can emerge, which species can coexist, and how they respond to environmental conditions. In this regard, the understanding of the ecophysiological responses observed against changes in environmental conditions can be essential for predicting variations in species distribution, community composition, and forest productivity in the context of global change. In this thesis we investigated the degree of tolerance and sensitivity that each of the three studied species, co-occurring in central of the Iberian Peninsula (Pinus pinea, Quercus ilex and Juniperus oxycedrus), show against the typical abiotic stress factors in the Mediterranean region. Our work is based on the optimal physiological niche for regeneration of each species through in-depth research on the effect of drought, temperature and light environment. For this purpose, we developed a model to predict the carbon assimilation rate which allows us to identify the optimal environmental conditions where regeneration from each species could establish itself more easily. To obtain a better understanding about the effect of low temperature on regeneration, we studied the acclimation and deacclimation patterns to cold of each species, identifying period of frost sensitivity, as well as bottlenecks where competition between species can arise. Finally, to support our results about the effect of water availabilty, we conducted a greenhouse experiment with a view of studying the drought effect at the whole plant level. Here, two watering regimes were applied in order to study the physiological and morphological traits of each species, mainly at the level of the root system and stem growth, and so relate them to the different water use strategies of the species. Despite the fact that stone pine has been the target species for centuries, nowadays this species is in the most unfavorable position to cope with climate change. Holm oak, however, resulted the species that is best adapted to tolerate the predicted changes, followed closely by prickly juniper. Our results suggest a feasible expansion of the distribution range in holm oak, an increase in the prickly juniper presence and a progressive decreasing of stone pine presence in the medium term in these stone pine-holm oak-prickly juniper mixed forests.

Respuesta fisiológica, productiva y cualitativa del cultivar Syrah (Vitis vinifera L) con diferentes frecuencias de riego y densidad de goteros en suelos arcillosos

La disponibilidad hídrica es uno de los principales factores que determinan el rendimiento del viñedo en muchas regiones vitícolas, por lo que sus consecuencias han sido ampliamente estudiadas. Sin embargo, para una cantidad de agua de riego determinada, otros aspectos como la frecuencia de aplicación, o la combinación entre el caudal de los goteros y la distancia entre los mismos (es decir, el patrón de distribución de agua en el suelo), pueden jugar un papel relevante, pero estos factores han sido poco estudiados. El objetivo de este trabajo ha sido evaluar las implicaciones agronómicas y fisiológicas de dos frecuencias de riego (IrrF, cada 2 y 4 días) y dos patrones de distribución de agua (DisP, goteros de 2 L h-1 separados 0,6 m vs. goteros de 4 L h-1 separados 1,2 m). El experimento se llevó a cabo durante cuatro temporadas consecutivas en un viñedo cv. Syrah con un suelo arcilloso en el centro de España, y los dos factores fueron evaluados bajo dos condiciones de disponibilidad hídrica (Baja: 20% de ETo y Media: 40% de ETo). El efecto de la frecuencia de riego y el patrón de distribución de agua en la respuesta agronómica del cv. Syrah se ha estudiado en el capítulo 1. La frecuencia de riego y el patrón de distribución de agua en el suelo afectaron a algunos aspectos de los componentes de rendimiento y desarrollo vegetativo en las dos condiciones de disponibilidad hídrica, aunque los efectos observados no fueron los mismos todos los años. Los efectos fueron más evidentes para IrrF en condiciones de baja disponibilidad hídrica y para DisP en condiciones de disponibilidad hídrica media. Dos de los cuatro años del experimento, el pasar de frecuencia de riego de 2 días a 4 días causó un incremento medio de rendimiento del 20% para la situación de baja disponibilidad hídrica. La textura del suelo, sin duda ha condicionado los resultados obtenidos en los tratamientos regados con el 20% de la ETo, ya que regar cada dos días implicaba la aplicación de pequeñas cantidades de agua y se formaban bulbos de riego superficiales, probablemente favoreciendo las pérdidas por evaporación. En el capítulo 2, se ha analizado el efecto de la frecuencia de riego y del patrón de distribución de agua en el estado hídrico de la planta y el intercambio gaseoso a nivel de hoja con el fin de explicar las diferencias observadas en la respuesta agronómica. En lo que respecta a la frecuencia de riego, en condiciones de baja disponibilidad hídrica, las plantas regadas cada 4 días (plantas 4d), mostraron mayores tasas de asimilación neta y conductancia estomática que las plantas regadas cada 2 días (plantas 2d), lo que es consistente con la hipótesis de que con la frecuencia de riego de 2 días se produjo una pérdida de eficiencia del uso del agua, probablemente debido a una mayor evaporación como consecuencia del hecho de que el volumen de suelo mojado creado era pequeño y cerca de la superficie. En condiciones de disponibilidad hídrica media, las diferencias en el intercambio gaseoso a nivel de hoja fueron mucho más pequeñas. Al comienzo del verano cada frecuencia de riego se comportó mejor uno de los días de medida, compensando al final del ciclo de riego de 4 días. Sin embargo, a medida que avanzó el verano y el déficit de agua se hizo más alto, las diferencias significativas aparecieron sólo en el 'día 4' del ciclo de riego, cuando las plantas 2d se comportaron mejor que las plantas regadas 4d que llevaban tres días sin regarse. Estas diferencias fisiológicas fueron menores que en condiciones de baja disponibilidad hídrica y al parecer no suficientes para afectar el comportamiento agronómico. En cuanto al patrón de distribución de agua, el efecto fue poco significativo, pero la mayor densidad de goteros tendió a presentar un mayor intercambio gaseoso a nivel de hoja, especialmente a media mañana. El efecto fue más importante para las condiciones de disponibilidad hídrica media. En el capítulo 3, se han comparado las relaciones entre el intercambio gaseoso a nivel de hoja, el estado hídrico y la demanda atmosférica, con el fin de explicar los cambios en la intensidad de la respuesta fisiológica observados en el Capítulo 2. No se han encontrado diferencias en dichas relaciones para el patrón de distribución de agua, por lo que sólo se ha analizado el efecto de la frecuencia de riego. El estudio se ha centrado fundamentalmente en si las plantas mostraron una respuesta fisiológica diferente a los cambios en el estado hídrico y en la demanda atmosférica según el tiempo transcurrido desde el último riego. Las diferencias observadas explican los resultados obtenidos en los capítulos anteriores, y sugieren la existencia de procesos de aclimatación vinculados a la frecuencia de riego y a la disponibilidad hídrica. Las plantas bajo condiciones de baja disponibilidad hídrica se mostraron más aclimatadas al estrés hídrico que aquellas en condiciones de disponibilidad hídrica media. La frecuencia de riego afectó claramente la relación entre los parámetros de intercambio gaseoso a nivel de hoja, el estado hídrico de la planta y las condiciones atmosféricas, y junto con la cantidad de agua aplicada tuvo implicaciones en el desarrollo de mecanismos de aclimatación que afectaron a la respuesta fisiológica de la planta, afectando a la eficiencia del riego. ABSTRACT Water availability is one of the major factors that determine vineyard performance in many grape growing regions, so its implications have been widely studied before. However, for a given irrigation water amount, other aspects such as application frequency, or emitter spacing and flow rate (i.e., distribution pattern), may play a relevant role, but these factors have been scarcely studied. The aim of this work was to evaluate the agronomic and physiological implications of two irrigation frequencies (IrrF, every 2 and 4 days) and two water distribution patterns (DisP, 2 L h−1 emitters every 0.6 m vs. 4 L h−1 emitters every 1.2 m). The experiment was carried out during four consecutive seasons in a cv. Syrah vineyard with a clay soil in central Spain, and the two factors were evaluated under two water availability conditions (LOW WA: 20% of ETo and MEDIUM WA: 40% of ETo). The effect of irrigation frequency and water distribution pattern on the agronomical response of cv. Syrah was studied in Chapter 1. IrrF and DisP affected some aspects of vegetative development and yield components under both water availability conditions, although the effects observed were not the same every year. The effects were more evident for IrrF under low water availability and for DisP under medium water availability. Two out of the four years of the experiment, the change of irrigation frequency from 2 days to 4 days promoted an average yield increase of 20% for the LOW WA situation. Soil texture certainly conditioned the results obtained under LOW WA conditions, since high frequency irrigation implied applying small amounts of water that resulted in limited superficial water bulbs, which probably favored water evaporation. In Chapter 2, the effect of irrigation frequency and water distribution pattern on plant water status and leaf gas exchange was analyzed to explain the differences observed in the agronomical response. Concerning irrigation frequency, under LOW WA conditions, applying irrigation every 4 days, resulted in higher net assimilation rates and stomatal conductance than doing it every 2 days, supporting the hypothesis that the latter frequency resulted in a water use efficiency loss, probably due to higher evaporation as a consequence of the fact the wetted soil volume created was small and close to the surface. Under MEDIUM WA conditions, differences in leaf gas exchange were much smaller. At the beginning of the summer each irrigation frequency behaved better one of the measurements days, compensating at the end of the 4-day irrigation cycle. However, as the summer progressed and water deficit became higher, significant differences appeared only on ‘day 4’ of the irrigation cycle, when 2d plants behaved better than 4d plants. These physiological differences were smaller than under LOW WA conditions and apparently not sufficient to affect agronomical performance. Regarding water distribution pattern, the effect was less significant but the closest emitter spacing resulted in general terms in a higher leaf gas exchange, especially at midmorning. The effect was more noticeable for MEDIUM WA conditions. In Chapter 3, the relationships between leaf gas exchange and leaf water status and atmospheric demand were compared to explain the changes in the intensity of the physiological response observed in Chapter 2. No differences were found in the relationships for water distribution pattern, so only the effect of irrigation frequency was analyzed focusing on whether the plants have a different physiological response to changes in water status and atmospheric demand according to the time elapsed since the last irrigation. Differences observed in the relationships explained the results obtained in the previous chapters, and point at the occurrence of acclimation processes linked to irrigation frequency and to water availability. Plants under LOW WATER AVAILABILITY conditions seemed to be more acclimated to water stress than those under MEDIUM WATER AVAILABILITY conditions. Irrigation frequency clearly affected the relationship between leaf gas exchange parameters, plant water status and atmospheric conditions, and together with the amount of water applied had implications in the development of acclimation mechanisms that affected plant physiological response, thus affecting irrigation efficiency.

Investigación sobre fermentaciones metánicas de desechos estacionales

En el campo agrícola se producen una serie de desechos orgánicos, que por un lado representan serios problemas de contaminación ambiental y por otro el desperdicio de valores energéticos importantes. Es decir una acción contraria a la sostenibilidad que debe buscarse en este siglo XXI. Entre estos productos agrícolas pueden citarse la pulpa de café, residuos herbáceos, bagazo de caña y la fracción insoluble de estiércol de ganado porcino conocida como cerdaza. Un problema añadido para dar solución adecuada es la disponibilidad de estos solo en cortas épocas del año. Todo lo anterior ha sido el origen de la presente investigación, para dar solución adecuada tanto en el aprovechamiento de biogás como en la reducción de la contaminación. La investigación descrita en este documento contempla el desarrollo de los siguientes aspectos: 1) Caracterización y problemática de cada uno de los productos señalados, 2) la solución al problema mediante el proceso de digestión anaerobia con fases separadas con el aprovechamiento del biogás generados y 3) recomendaciones para el arranque del proceso de digestión anaerobia y su mantenimiento en una alternancia de los productos citados. En la primera etapa de la fase experimental se estimó el rendimiento específico de metano para los diferentes sustratos, utilizando reactores batch configurados en una y dos fases concluyendo que la digestión anaerobia en dos fases presenta diferentes ventajas sobre la digestión monoetapa. En general se obtuvo un mayor rendimiento en la producción de metano, una reducción en los tiempos de retención, mayor eficiencia en la eliminación de los sólidos volátiles agregados, y una mayor estabilidad en el proceso reflejado en el mantenimiento de valores de pH en los rangos de operación recomendados. Seguidamente, al comparar dos procesos para la puesta en marcha de digestores metanogénicos operados en forma continua, se concluye que las variables determinantes en la estabilidad del sistema son la alcalinidad total presente en el digestor, el establecimiento de la población de microorganismos y la carga orgánica aplicada. Las dos primeras están determinadas por la calidad y proporción del inóculo suministrado al inicio del proceso. La alternación de sustratos suministrados al sistema de digestión en dos fases, permitió determinar el impacto sobre el desempeño del mismo, registrando una reducción en la producción de biogás, la riqueza de metano y la eficiencia de eliminación de sólidos volátiles durante los primeros días de operación luego del cambio de sustrato. Este periodo corresponde al proceso de aclimatación de los microorganismos el cual requirió de 20 días para asimilar los componentes del nuevo sustrato. Finalmente, entre los sustratos analizados, la menor carga orgánica de operación para mantener la operación del sistema en continuo corresponde a la pulpa de café con 0.1 kg SV/m3. La composición de este sustrato favorece la rápida acumulación de acidez volátil en el sistema, proporcionando una tendencia a la acidificación. Sin embargo, al controlar las cargas orgánicas volumétricas, el sistema permaneció operando sin necesidad de adición de alcalinizantes. La aplicación de los resultados de la presente investigación a la problemática de residuos de café es alentadora, comprobando que el sistema puede ser operado en continuo alternando residuos boreales y pulpa de café, ambos sustratos disponibles en las plantas de procesamiento de la cereza de café. ABSTRACT In the agricultural field there are series of organic wastes, which in one hand are the source of serious problems of environmental pollution and in the other, they represent a residue that could be used as a feedstock with significant energy values. These actions are contrary to efforts towards sustainability, which should be a priority in this century. Among agricultural residues with significant abundance, the coffee pulp, herbaceous waste, sugarcane bagasse and the insoluble fraction of pig manure can be mentioned. An added problem to the development of appropriate treatment systems, which provides a solution to the disposal of such wastes, is the limited availability of these feedstocks only in short seasons. These arguments have been the source of our research, in order to provide properly measures to biogas usage and pollution reduction. The research presented in this document includes the approaches to the following aspects. 1) Characterization and problems regarding the selected feedstocks 2) the solution to the problem by anaerobic digestion process with separate phases and 3) recommendations for starting the process of anaerobic digestion and its maintenance with alternation of the products listed For the first stage of the experimental phase, the specific methane yield of the selected feedstocks was estimated using batch reactors configured in one and two phases. It was concluded that two-phase anaerobic digestion offered distinct advantages over the single-stage digestion. In general a higher methane production yields, lower retention times, higher efficiency in volatile solids removal, and increased stability among the process were obtained. When comparing two processes for starting up methanogenic digesters, it is concluded that the variables that determine the stability of the system are the total alkalinity in the digester, the establishment of the population of microorganisms and the organic load. The first variables are influenced by the proportion and quality of the inoculum supplied at the beginning of the process. The alternation of substrates gave as a result a negative impact on system performance, recording a reduction on biogas production, the methane concentration and the efficiency of volatile solids removal. The situation was observed during the first days of operation after the change of feeding. This period corresponds to the process of acclimatization of the microorganisms which required 20 days to assimilate new substrate components. Finally, among substrates studied, the lowest organic load applied to maintain a continuous operation of the system, corresponds to the coffee pulp with 0.1 kg VS / m3. The composition of this substrate promotes a rapid accumulation of volatile acidity within the system, providing a tendency to acidification. However, by controlling organic loads, the operating system remained stable without addition of alkalizing components. The application of the results of this research to the problem of coffee waste is promising, proving that an anaerobic system can be operated continuously by alternating boreal waste and coffee pulp, both substrates available in coffee processing plants.

Biotecnología forestal aplicada a la producción de madera de nogal

Los nogales son especies pertenecientes a la familia Juglandaceae, ampliamente distribuidos por las zonas templadas y subtropicales del planeta. Son apreciados desde la antigüedad por la calidad de sus frutos y su madera. Su grado de domesticación es relativamente bajo comparado con cultivos alimenticios, e incluso respecto a otras especies forestales. Aunque el mercado de la madera de nogal suele mover grandes cantidades de dinero, su producción está basada principalmente en explotaciones extensivas, creciendo bajo sistemas poco tecnificados. Algunos intentos se han realizado en los EUA y Europa para la obtención de variedades madereras de nogal, pero ya sea por sus prolongados ciclos biológicos, por la complejidad genética de los caracteres sobre los que habría que incidir, por la escasa experiencia acumulada en programas de mejoramiento o por las limitaciones de los protocolos comerciales de reproducción asexual disponibles, lo cierto es que no existen genotipos seleccionados y destinados para tal fin. Poseer la capacidad de reproducir asexualmente los genotipos selectos es el complemento necesario de los programas de mejoramiento genético. Igualmente constituye la base de cualquier sistema productivo intensivo. Los sistemas de propagación vegetativa tradicionales en la familia Juglandaceae, además de ser inefectivos para la producción de elevados volúmenes de plantas, implican una gran complejidad en su ejecución y sus resultados suelen ser impredecibles. La micropropagación se plantea como la mejor alternativa para superar las dificultades de estas técnicas. Sin embargo, los nogales son considerados como altamente recalcitrantes al cultivo de tejidos, lo que provoca que sólo muy pocos genotipos sean propagados de forma comercial. Varias fases de la micropropagación de los nogales son especialmente conflictivas, e inciden de manera individual, y en su conjunto, sobre el resultado final. El control de los contaminantes microbianos, junto con la emisión de sustancias fenólicas y el decaimiento de los cultivos dificultan el establecimiento in vitro de la gran mayoría de los genotipos. La re-emergencia de microorganismos durante la proliferación es una fuente de pérdidas importante que también puede conducir al fracaso de la micropropagación. Las bajas tasas de enraizamiento y la elevada mortalidad registrada durante la aclimatación, unidas a factores genéticos, terminan por limitar la utilización comercial de esta tecnología a unos pocos genotipos. Con el objetivo de desarrollar un protocolo de micropropagación pre-comercial para el nogal híbrido maderero, se incidió en la solución de los principales problemas que dificultan la definición de ésta como una tecnología funcional para la producción de clones de ortetos selectos, al menos, para aquellos genotipos que pudieron ser establecidos in vitro. Así, aquí se presenta una metodología para el establecimiento in vitro que reduce la complejidad de esta fase y mejora el porcentaje de éxito durante la introducción. Igualmente se profundizó en el saneamiento de material contaminado y en el desarrollo de una herramienta que sirva para abordar el control de la re-emergencia microbiana durante la proliferación. También se analizan los elementos claves de este protocolo que garantizan la obtención de microbrotes de calidad enraizables, potencialmente capaces de soportar el paso a condiciones ex vitro. La evaluación de aspectos como la sustitución del FeEDTA por el FeEDDHA como fuente hierro, la introducción del Floroglucinol en el medio de cultivo de proliferación y la determinación de una fuente de carbono adecuada para la formación de las raíces, junto con un manejo adecuado de la fase previa a la pre-inducción radical, fueron determinantes en la micropropagación de hasta 14 genotipos de nogal híbrido maderero. Adicionalmente, la realización de un análisis detallado del sistema radical permitió comprobar que la metodología propuesta favorece la producción de raíces que están conectadas vascularmente con el tallo, lo que unido a la presencia de estomas morfológicamente normales, permite reducir las pérdidas por estas causas y favorece el proceso de endurecimiento. Como complemento del programa de mejora y de clonación, se abordó el desarrollo de una herramienta que permitiera identificar y diferenciar las selecciones. Buscando combinar la simplicidad de la técnica con el máximo poder discriminativo posible, se eligió el uso de marcadores genéticos del tipo SSR. En una primera aproximación, se evaluó la conveniencia de emplear primers previamente publicados (Woeste et al. 2002) y utilizados en varias especies de la familia Juglandaceae (Dangl et al. 2005, Victory et al. 2006, Ross-Davis y Woeste 2008, entre otros autores). A pesar de que la mayoría de las parejas de cebadores evaluadas rindieron productos de amplificación interpretables, su capacidad de clasificación conjunta fue muy reducida y de uso muy limitado en una población afectada por un alto grado de parentesco. Por esta razón fue necesario desarrollar una batería de marcadores microsatélites diseñados específicamente para el nogal híbrido maderero. De las 700 regiones secuenciadas, finalmente 24 parejas demostraron ser funcionales y lo suficientemente polimórficas como para discriminar entre medios hermanos. Al ser utilizadas 10 de las nuevas parejas de primers, junto con 2 de la genoteca desarrollada por Woeste et al. (2002), en una población diferente fue posible genotipar con una PID del orden de 10-11, lo que abre la posibilidad de utilizar este set de marcadores de novo dentro de la familia Juglandaceae.