Análisis genómico y funcional de los sistemas de Quorum Sensing en Rhizobium leguminosarum

Rhizobium leguminosarum (Rl) es una alfa-proteobacteria capaz de establecer una simbiosis diazotrófica con distintas leguminosas. A pesar de la importancia de esta simbiosis en el balance global del ciclo del nitrógeno, muy pocos genomas de rhizobios han sido secuenciados, que aporten nuevos conocimientos relacionados con las características genéticas que contribuyen a importantes procesos simbióticos. Únicamente tres secuencias completas de Rl han sido publicadas: Rl bv. viciae 3841 y dos genomas de Rl bv. trifolii (WSM1325 y WSM2304), ambos simbiontes de trébol. La secuencia genómica de Rlv UPM791 se ha determinado por medio de secuenciación 454. Este genoma tiene un tamaño aproximado de 7.8 Mb, organizado en un cromosoma y 5 replicones extracromosómicos, que incluyen un plásmido simbiótico de 405 kb. Este nuevo genoma se ha analizado en relación a las funciones simbióticas y adaptativas en comparación con los genomas completos de Rlv 3841 y Rl bv. trifolii WSM1325 y WSM2304. Mientras que los plásmidos pUPM791a y b se encuentran conservados, el plásmido simbiótico pUPM791c exhibe un grado de conservación muy bajo comparado con aquellos descritos en las otras cepas de Rl. Uno de los factores implicados en el establecimiento de la simbiosis es el sistema de comunicación intercelular conocido como Quorum Sensing (QS). El análisis del genoma de Rlv UPM791 ha permitido la identificación de dos sistemas tipo LuxRI mediados por señales de tipo N-acyl-homoserina lactonas (AHLs). El análisis mediante HPLC-MS ha permitido asociar las señales C6-HSL, C7-HSL y C8-HSL al sistema rhiRI, codificado en el plásmido simbiótico; mientras que el sistema cinRI, localizado en el cromosoma, produce 3OH-C14:1-HSL. Se ha identificado una tercera sintasa (TraI) codificada en el plásmido simbiótico, pero su regulador correspondiente se encuentra truncado debido a un salto de fase. Adicionalmente, se han encontrado tres reguladores de tipo LuxR-orphan que no presentan una sintasa LuxI asociada. El efecto potencial de las señales tipo AHL se ha estudiado mediante una estrategia de quorum quenching, la cual interfiere con los sistemas de QS de la bacteria. Esta estrategia está basada en la introducción del gen aiiA de Bacillus subtilis, que expresa constitutivamente una enzima lactonasa degradadora de AHLs. Para llevar a cabo el análisis en condiciones simbióticas, se ha desarrollado un sistema de doble marcaje que permite la identificación basado en los marcadores gusA y celB, que codifican para una enzima β–glucuronidasa y una β–galactosidasa termoestable, respectivamente. Los resultados obtenidos indican que Rlv UPM791 predomina sobre la cepa Rlv 3841 para la formación de nódulos en plantas de guisante. La baja estabilidad del plásmido que codifica para aiiA, no ha permitido obtener una conclusión definitiva sobre el efecto de la lactonasa AiiA en competitividad. Con el fin de analizar el significado y la regulación de la producción de moléculas señal tipo AHL, se han generado mutantes defectivos en cada uno de los dos sistemas de QS. Se ha llevado a cabo un análisis detallado sobre la producción de AHLs, formación de biofilm y simbiosis con plantas de guisante, veza y lenteja. El efecto de las deleciones de los genes rhiI y rhiR en Rlv UPM791 es más drástico en ausencia del plásmido pUPM791d. Mutaciones en cinI o cinRIS muestran tanto ausencia de señales, como producción exclusivamente de las de bajo peso molecular, respectivamente, producidas por el sistema rhiRI. Estas mutaciones mostraron un efecto importante en simbiosis. El sistema rhiRI se necesita para un comportamiento simbiótico normal. Además, mutantes cinRIS generaron nódulos blancos e ineficientes, mientras que el mutante cinI fue incapaz de producir nódulos en ninguna de las leguminosas utilizadas. Dicha mutación resultó en la inestabilización del plasmido simbiótico por un mecanismo dependiente de cinI que no ha sido aclarado. En general, los resultados obtenidos indican la existencia de un modelo de regulación dependiente de QS significativamente distinto a los que se han descrito previamente en otras cepas de R. leguminosarum, en las cuales no se había observado ningún fenotipo relevante en simbiosis. La regulación de la producción de AHLs Rlv UPM791 es un proceso complejo que implica genes situados en los plásmidos UPM791c y UPM791d, además de la señal 3-OH-C14:1-HSL. Finalmente, se ha identificado un transportador de tipo RND, homologo a mexAB-oprM de P. aeruginosa e implicado en la extrusión de AHLs de cadena larga. La mutación he dicho transportador no tuvo efectos apreciables sobre la simbiosis. ABSTRACT Rhizobium leguminosarum (Rl) is a soil alpha-proteobacterium that establishes a diazotrophic symbiosis with different legumes. Despite the importance of this symbiosis to the global nitrogen cycling balance, very few rhizobial genomes have been sequenced so far which provide new insights into the genetic features contributing to symbiotically relevant processes. Only three complete sequences of Rl strains have been published: Rl bv. viciae 3841, harboring six plasmids (7.75 Mb) and two Rl bv. trifolii (WSM1325 and WSM2304), both clover symbionts, harboring 5 and 4 plasmids, respectively (7.41 and 6.87 Mb). The genomic sequence of Rlv UPM791 was undertaken by means of 454 sequencing. Illumina and Sanger reads were used to improve the assembly, leading to 17 final contigs. This genome has an estimated size of 7.8 Mb organized in one chromosome and five extrachromosomal replicons, including a 405 kb symbiotic plasmid. Four of these plasmids are already closed, whereas there are still gaps in the smallest one (pUPM791d) due to the presence of insertion elements and repeated sequences, which difficult the assembly. The annotation has been carried out thanks to the Manatee pipeline. This new genome has been analyzed as regarding symbiotic and adaptive functions in comparison to the Rlv 3841 complete genome, and to those from Rl bv. trifolii strains WSM1325 and WSM2304. While plasmids pUPM791a and b are conserved, the symbiotic plasmid pUPM791c exhibited the lowest degree of conservation as compared to those from the other Rl strains. One of the factors involved in the symbiotic process is the intercellular communication system known as Quorum Sensing (QS). This mechanism allows bacteria to carry out diverse biological processes in a coordinate way through the production and detection of extracellular signals that regulate the transcription of different target genes. Analysis of the Rlv UPM791 genome allowed the identification of two LuxRI-like systems mediated by N-acyl-homoserine lactones (AHLs). HPLC-MS analysis allowed the adscription of C6-HSL, C7-HSL and C8-HSL signals to the rhiRI system, encoded in the symbiotic plasmid, whereas the cinRI system, located in the chromosome, produces 3OH-C14:1-HSL, previously described as “bacteriocin small”. A third synthase (TraI) is encoded also in the symbiotic plasmid, but its cognate regulator TraR is not functional due to a fameshift mutation. Three additional LuxR orphans were also found which no associated LuxI-type synthase. The potential effect of AHLs has been studied by means of a quorum quenching approach to interfere with the QS systems of the bacteria. This approach is based upon the introduction into the strains Rl UPM791 and Rl 3841 of the Bacillus subtilis gene aiiA expressing constitutively an AHL-degrading lactonase enzyme which led to virtual absence of AHL even when AiiA-expressing cells were a fraction of the total population. No significant effect of AiiA-mediated AHL removal on competitiveness for growth in solid surface was observed. For analysis under symbiotic conditions we have set up a two-label system to identify nodules produced by two different strains in pea roots, based on the markers gusA and celB, encoding a β–glucuronidase and a thermostable β–galactosidase enzymes, respectively. The results obtained show that Rlv UPM791 outcompetes Rlv 3841 for nodule formation in pea plants, and that the presence of the AiiA plasmid does not significantly affect the relative competitiveness of the two Rlv strains. However, the low stability of the pME6863 plasmid, encoding aiiA, did not lead to a clear conclusion about the AiiA lactonase effect on competitiveness. In order to further analyze the significance and regulation of the production of AHL signal molecules, mutants deficient in each of the two QS systems were constructed. A detailed analysis of the effect of these mutations on AHL production, biofilm formation and symbiosis with pea, vetch and lentil plants has been carried out. The effect of deletions on Rlv UPM791 rhiI and rhiR genes is more pronounced in the absence of plasmid pUPM791d, as no signal is detected in UPM791.1, lacking this plasmid. Mutations in cinI or cinRIS show either no signals, or only the small ones produced by the rhiRI system, suggesting that cinR might be regulating the rhiRI system. These mutations had a strong effect on symbiosis. Analysis of rhi mutants revealed that rhiRI system is required for normal symbiotic performance, as a drastic reduction of symbiotic fitness is observed when rhiI is deleted, and rhiR is essential for nitrogen fixation in the absence of plasmid pUPM791d. Furthermore, cinRIS mutants resulted in white and inefficient nodules, whereas cinI mutant was unable to form nodules on any legume tested. The latter mutation is associated to the instabilization of the symbiotic plasmid through a mechanism still uncovered. Overall, the results obtained indicate the existence of a model of QS-dependent regulation significantly different to that previously described in other R. leguminosarum strains, where no relevant symbiotic phenotype had been observed. The regulation of AHL production in Rlv UPM791 is a complex process involving the symbiotic plasmid (pUPM791c) and the smallest plasmid (pUPM791d), with a key role for the 3-OH-C14:1-HSL signal. Finally, we made a search for potential AHL transporters in Rlv UPM791 genome. These signals diffuse freely across membranes, but in the case of the long-chain AHLs an active efflux system might be required, as it has been described for C12-HSL in the case of Pseudomonas aeruginosa. We have identified a putative AHL transporter of the RND family homologous to P. aeruginosa mexAB-oprM. A mutant strain deficient in this transporter has been generated, and TLC analysis shows absence of 3OH-C14:1-HSL in its supernatant. This deficiency was complemented by the reintroduction of an intact copy of the genes via plasmid transfer. The mutation in mexAB genes had no significant effects on the symbiotic performance of R. leguminosarum bv. viciae.

The AtCathB3 gene, encoding a cathepsin B-like protease, is expressed during germination of Arabidopsis thaliana and transcriptionally repressed by the basic leucine zipper protein GBF1.

Protein hydrolysis plays an important role during seed germination and post-germination seedling establishment. In Arabidopsis thaliana, cathepsin B-like proteases are encoded by a gene family of three members, but only the AtCathB3 gene is highly induced upon seed germination and at the early post-germination stage. Seeds of a homozygous T-DNA insertion mutant in the AtCathB3 gene have, besides a reduced cathepsin B activity, a slower germination than the wild type. To explore the transcriptional regulation of this gene, we used a combined phylogenetic shadowing approach together with a yeast one-hybrid screening of an arrayed library of approximately 1200 transcription factor open reading frames from Arabidopsis thaliana. We identified a conserved CathB3-element in the promoters of orthologous CathB3 genes within the Brassicaceae species analysed, and, as its DNA-interacting protein, the G-Box Binding Factor1 (GBF1). Transient overexpression of GBF1 together with a PAtCathB3::uidA (β-glucuronidase) construct in tobacco plants revealed a negative effect of GBF1 on expression driven by the AtCathB3 promoter. In stable P35S::GBF1 lines, not only was the expression of the AtCathB3 gene drastically reduced, but a significant slower germination was also observed. In the homozygous knockout mutant for the GBF1 gene, the opposite effect was found. These data indicate that GBF1 is a transcriptional repressor of the AtCathB3 gene and affects the germination kinetics of Arabidopsis thaliana seeds. As AtCathB3 is also expressed during post-germination in the cotyledons, a role for the AtCathB3-like protease in reserve mobilization is also inferred.

New insights into the regulation of NADPH oxidase dependent reactive oxygen species signaling during the plant immune response

Las NADPH oxidasas de plantas, denominadas “respiratory burst oxidase homologues” (RBOHs), producen especies reactivas del oxígeno (ROS) que median un amplio rango de funciones. En la célula vegetal, el ajuste preciso de la producción de ROS aporta la especificidad de señal para generar una respuesta apropiada ante las amenazas ambientales. RbohD y RbohF, dos de los diez genes Rboh de Arabidopsis, son pleiotrópicos y median diversos procesos fisiológicos en respuesta a patógenos. El control espacio-temporal de la expresión de los genes RbohD y RbohF podría ser un aspecto crítico para determinar la multiplicidad de funciones de estas oxidasas. Por ello, generamos líneas transgénicas de Arabidopsis con fusiones de los promoters de RbohD y RbohF a los genes delatores de la B-glucuronidasa y la luciferasa. Estas líneas fueron empleadas para revelar el patrón de expresión diferencial de RbohD y RbohF durante la respuesta inmune de Arabidopsis a la bacteria patógena Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, el hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina y en respuesta a señales relacionadas con la respuesta inmune. Nuestros experimentos revelan un patrón de expresión diferencial de los promotores de RbohD y RbohF durante el desarrollo de la planta y en la respuesta inmune de Arabidopsis. Además hemos puesto de manifiesto que existe una correlación entre el nivel de actividad de los promotores de RbohD y RbohF con la acumulación de ROS y el nivel de muerte celular en respuesta a patógenos. La expression de RbohD y RbohF también es modulada de manera diferencial en respuesta a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y por ácido abscísico (ABA). Cabe destacar que, mediante una estrategia de intercambio de promotores, hemos revelado que la región promotora de RbohD, es necesaria para dirigir la producción de ROS en respuesta a P. cucumerina. Adicionalmente, la activación del promotor de RbohD en respuesta al aislado de P. cucumerina no adaptado a Arabidopsis 2127, nos llevó a realizar ensayos de susceptibilidad con el doble mutante rbohD rbohF que han revelado un papel desconocido de estas oxidasas en resistencia no-huesped. La interacción entre la señalización dependiente de las RBOHs y otros componentes de la respuesta inmune de plantas podría explicar también las distintas funciones que median estas oxidasas en relación con la respuesta inmune. Entre la gran cantidad de señales coordinadas con la actividad de las RBOHs, existen evidencias genéticas y farmacológicas que indican que las proteínas G heterotriméricas están implicadas en algunas de las rutas de señalización mediadas por ROS derivadas de los RBOHs en respuesta a señales ambientales. Por ello hemos estudiado la relación entre estas RBOH-NADPH oxidasas y AGB1, la subunidad β de las proteínas G heterotriméricas en la respuesta inmune de Arabidopsis. Análisis de epistasis indican que las proteínas G heterotriméricas están implicadas en distintas rutas de señalización en defensa mediadas por las RBOHs. Nuestros resultados ilustran la relación compleja entre la señalización mediada por las RBOHs y las proteínas G heterotriméricas, que varía en función de la interacción planta-patógeno analizada. Además, hemos explorado la posible asociación entre AGB1 con RBOHD y RBOHF en eventos tempranos de la respuesta immune. Cabe señalar que experimentos de coímmunoprecipitación apuntan a una posible asociación entre AGB1 y la kinasa citoplasmática reguladora de RBOHD, BIK1. Esto indica un posible mecanismo de control de la función de esta NADPH oxidase por AGB1. En conjunto, estos datos aportan nuevas perspectivas sobre cómo, a través del control transcripcional o mediante la interacción con las proteínas G heterotriméricas, las NADPH oxidases de plantas median la producción de ROS y la señalización por ROS en la respuesta inmune. Nuestro trabajo ejemplifica cómo la regulación diferencial de dos miembros de una familia multigénica, les permite realizar distintas funciones fisiológicas especializadas usando un mismo mecanismo enzimático. ABSTRACT The plant NADPH oxidases, termed respiratory burst oxidase homologues (RBOHs), produce reactive oxygen species (ROS) which mediate a wide range of functions. Fine tuning this ROS production provides the signaling specificity to the plant cell to produce the appropriate response to environmental threats. RbohD and RbohF, two of the ten Rboh genes present in Arabidopsis, are pleiotropic and mediate diverse physiological processes in response to pathogens. One aspect that may prove critical to determine the multiplicity of functions of RbohD and RbohF is the spatio-temporal control of their gene expression. Thus, we generated Arabidopsis transgenic lines with RbohD- and RbohF-promoter fusions to the β-glucuronidase and the luciferase reporter genes. These transgenics were employed to reveal RbohD and RbohF promoter activity during Arabidopsis immune response to the pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina and in response to immunity-related cues. Our experiments revealed a differential expression pattern of RbohD and RbohF throughout plant development and during Arabidopsis immune response. Moreover, we observed a correlation between the level of RbohD and RbohF promoter activity, the accumulation of ROS and the amount of cell death in response to pathogens. RbohD and RbohF gene expression was also differentially modulated by pathogen associated molecular patterns and abscisic acid. Interestingly, a promoter-swap strategy revealed the requirement for the promoter region of RbohD to drive the production of ROS in response to P. cucumerina. Additionally, since the RbohD promoter was activated during Arabidopsis interaction with a non-adapted P. cucumerina isolate 2127, we performed susceptibility tests to this fungal isolate that uncovered a new role of these oxidases on non-host resistance. The interplay between RBOH-dependent signaling with other components of the plant immune response might also explain the different immunity-related functions mediated by these oxidases. Among the plethora of signals coordinated with RBOH activity, pharmacological and genetic evidence indicates that heterotrimeric G proteins are involved in some of the signaling pathways mediated by RBOH–derived ROS in response to environmental cues. Therefore, we analysed the interplay between these RBOH-NADPH oxidases and AGB1, the Arabidopsis β-subunit of heterotrimeric G proteins during Arabidopsis immune response. We carried out epistasis studies that allowed us to test the implication of AGB1 in different RBOH-mediated defense signaling pathways. Our results illustrate the complex relationship between RBOH and heterotrimeric G proteins signaling, that varies depending on the type of plant-pathogen interaction. Furthermore, we tested the potential association between AGB1 with RBOHD and RBOHF during early immunity. Interestingly, our co-immunoprecipitation experiments point towards an association of AGB1 and the RBOHD regulatory kinase BIK1, thus providing a putative mechanism in the control of the NADPH oxidase function by AGB1. Taken all together, these studies provide further insights into the role that transcriptional control or the interaction with heterotrimeric G-proteins have on RBOH-NADPH oxidase-dependent ROS production and signaling in immunity. Our work exemplifies how, through a differential regulation, two members of a multigenic family achieve specialized physiological functions using a common enzymatic mechanism.