Resistance to malathion and lambda-cyhalothrin in Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)

La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), es una de las plagas de mayor incidencia económica en cítricos y otros frutales a nivel mundial. En España las medidas de control de esta plaga en cítricos, desde mediados de los 90 hasta 2009, se basaron principalmente en el monitoreo de las poblaciones y en la aplicación de tratamientos aéreos y terrestres con malatión cebo. Sin embargo, desde la retirada en la Unión Europea en 2009 de los productos fitosanitarios que contienen malatión, los insecticidas más utilizados para el control de esta plaga han sido lambda-cihalotrina y spinosad. En 2004-2005 se detectaron poblaciones españolas de C. capitata resistentes a malatión. Esta resistencia se ha asociado a una mutación (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE), a una duplicación del gen de la AChE (Ccace2) (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas (posiblemente aliesterasas). Sin embargo, cuando se secuenció la aliesterasa CcE7 en individuos de una línea resistente a malatión, no se encontró ninguna de las mutaciones (G137D y/o W251L/S/G) asociadas a resistencia en otras especies, si bien se encontraron otras mutaciones al compararlos con individuos de una línea susceptible. Asimismo, mediante la selección en laboratorio de una línea resistente a malatión (W-4Km) con lambda-cihalotrina, se ha podido obtener una línea resistente a lambda-cihalotrina (W-1K). Finalmente, se ha demostrado la capacidad de esta especie para desarrollar resistencia a spinosad mediante selección en laboratorio. Los múltiples mecanismos de resistencia identificados evidencian el potencial de esta especie para desarrollar resistencia a insecticidas con diferentes modos de acción. Los objetivos de esta tesis doctoral son: 1) evaluar la susceptibilidad de poblaciones españolas de campo de C. capitata a lambda-cihalotrina y dilucidar los mecanismos de resistencia en la línea W-1Kλ; 2) comparar la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A); y 3) investigar el papel de las mutaciones identificadas en la aliesterasa CcαE7 en la resistencia a malatión. Estos estudios son de utilidad para el desarrollo de estrategias de manejo de la resistencia que puedan prevenir o retrasar la aparición de resistencia y aumentar la sostenibilidad de los insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Nuestros resultados indican que las poblaciones españolas de C. capitata analizadas han desarrollado resistencia a lambda-cihalotrina. Los valores de CL50 estimados para las poblaciones recogidas en la Comunidad Valenciana, Cataluña y Andalucía oscilaron entre 129 ppm y 287 ppm, igualando o sobrepasando la concentración recomendada para los tratamientos de campo (125 ppm). Estos resultados contrastan con los obtenidos con tres poblaciones de campo recogidas en Túnez, cuya susceptibilidad fue similar a la de la línea control (C). La línea resistente a lambda-cihalotrina W-1K se continuó seleccionando en el laboratorio alcanzándose unos niveles de resistencia de 205 veces con respecto a la línea C, siendo su CL50 (4224 ppm) más de 30 veces superior a la concentración recomendada para los tratamientos de campo. Esta línea resistente mostró altos niveles de resistencia cruzada a deltametrina (150 veces) y a etofenprox (240 veces), lo que sugiere que el desarrollo de resistencia a lambda-cihalotrina podría comprometer la eficacia de otros piretroides para el control de esta plaga. Hemos demostrado que la resistencia de la línea W-1K a lambda-cihalotrina fue casi completamente suprimida por el sinergista PBO, lo que indica que las enzimas P450 desempeñan un papel muy importante en la resistencia a este insecticida. Sin embargo, tanto las moscas de la línea susceptible C como las de la línea resistente W-1K perdieron inmediatamente la capacidad de caminar (efecto “knock-down”) al ser tratadas tópicamente con lambda-cihalotrina, lo que sugiere que la resistencia no está mediada por alteraciones en la molécula diana (resistencia tipo “kdr”). La resistencia metabólica mediada por P450 fue analizada comparando la expresión de 53 genes CYP (codifican enzimas P450) de las familias CYP4, CYP6, CYP9 y CYP12 en adultos de la línea resistente W-1K y de la línea susceptible C. Nuestros resultados muestran que el gen CYP6A51 (número de acceso GenBank XM_004534804) fue sobreexpresado (13-18 veces) en la línea W-1K. Por otra parte, la expresión del gen CYP6A51 fue inducida tanto en adultos de la línea W-1K como de la línea C al ser tratados con lambda-cihalotrina. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre la línea susceptible C y la línea resistente W-1K al comparar la cantidad de P450 y la actividad NADPH-citocromo c reductasa presente en fracciones microsomales obtenidas a partir de abdómenes. Asimismo, no hemos podido correlacionar el metabolismo de deltametrina, estimado in vitro mediante la incubación de este insecticida con fracciones microsomales, con el nivel de resistencia a este piretroide observado en los bioensayos con la línea W-1K. Por otro lado, no se encontró ninguna alteración en la región promotora 5'UTR del gen CYP6A51 (-500 pb desde el inicio de la traducción) que pudiera explicar su sobreexpresión en la línea W-1K. Los datos obtenidos sugieren que la resistencia a lambda-cihalotrina en la línea W-1K está mediada por P450 y que la sobreexpresión de CYP6A51 puede desempeñar un papel importante, aunque se necesitan más evidencias para establecer una asociación directa de la resistencia con este gen. Hemos estudiado la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A). La línea susceptible C, donde no se encuentra la mutación G328A (genotipo S/S), se cruzó con dos isolíneas establecidas para representar genotipos únicos correspondientes a los dos mecanismos de resistencia asociados a la molécula diana: 1) la isolínea 267Y (genotipo R/R) establecida a partir de una pareja que portaba la mutación G328A en homocigosis; 2) la isolínea 306TY (genotipo RS/RS) establecida a partir de una pareja que portaba en homocigosis la duplicación del gen Ccace2. No se realizaron cruces recíprocos, ya que mediante experimentos de hibridación in situ en cromosomas politénicos se pudo comprobar que el locus de la AChE y la duplicación (probablemente en tándem) se localizan en el cromosoma autosómico 2L. La susceptibilidad al malatión de los parentales resistentes (R/R o RS/RS) y susceptibles (S/S), los cruces F1 (S/R, S/RS y R/RS) y los retrocruzamientos indican que la resistencia a malatión es semi-dominante en ambos casos. Sin embargo, nuestros resultados no fueron concluyentes con respecto a la naturaleza monogénica de la resistencia a malatión en estas isolíneas. Por lo tanto, no podemos descartar que otros genes que contribuyan a la resistencia, además de la mutación G328A (isolínea 267Y) y de la duplicación del gen Ccace2 (isolínea 306TY), puedan haber sido seleccionados durante el proceso de selección de 267Y y 306TY. Varios parámetros biológicos fueron evaluados para determinar si estos dos mecanismos de resistencia a malatión suponen un coste biológico para los genotipos resistentes. Individuos con genotipo R/R mostraron un retraso en el tiempo de desarrollo de huevo a pupa, un peso de pupa reducido y una menor longevidad de los adultos, en comparación con los individuos con genotipo S/S. Sin embargo, el peso de pupa de los individuos con genotipo RS/RS fue similar al de los individuos S/S, y su desarrollo de huevo a pupa intermedio entre S/S y R/R. Estas diferencias en el coste biológico pueden estar relacionadas con la reducción de la eficiencia catalítica de la AChE mutada en los individuos R/R, y al efecto compensatorio que la copia no mutada del gen tiene en los individuos RS/RS que portan la duplicación. La estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación se analizó mediante el seguimiento de los caracteres de resistencia en la progenie de retrocruzamientos S/R x R/R y S/RS x RS/RS a lo largo de varias generaciones en ausencia de presión de selección con insecticidas. Nuestros resultados muestran que la frecuencia del alelo que porta la mutación G328A disminuyó desde 67,5% en la primera generación del retrocruzamiento S/R x R/R (75% esperado, asumiendo segregación mendeliana y que sólo hay dos alelos: uno mutado y otro no mutado) a 12% después de 10 generaciones. Por el contrario, la frecuencia de la duplicación sólo disminuyó desde 75% en en la primera generación del retrocruzamiento S/RS x RS/RS (75% esperado, asumiendo segregación Mendeliana y que la duplicación segrega como un único alelo) a 50% en el mismo período, lo que indica que la duplicación es más estable que la mutación. Asimismo, se analizó la presencia de la mutación y de la duplicación en poblaciones de campo recogidas en seis localidades en 2004-2007, cuando todavía se usaba el malatión, y se comparó con poblaciones recogidas en los mismos campos en 2010, un año después de la prohibición del malatión en la Unión Europea. La frecuencia media del genotipo susceptible (S/S) aumentó del 55,9% en el período 2004-2007 a 70,8% en 2010, mientras que la frecuencia de los genotipos portadores de la mutación en homocigosis o heterocigosis (R/R y S/R) disminuyó del 30,4 al 9,2%, los que llevan la duplicación en homocigosis o heterocigosis (RS/RS y S/RS) aumentaron levemente desde 12,8 hasta 13,3%, y los que llevan a la vez la mutación y la duplicación (R/RS) también aumentaron del 1 al 6,7%. Estos resultados son consistentes con que la duplicación del gen Ccace2 (con una copia con la mutación G328A y la otra copia no mutada) es más ventajosa que la mutación G328A por si sola, ya que la duplicación mantiene los niveles de resistencia a la vez que limita el coste biológico. Para investigar la asociación entre la resistencia a malatión y las mutaciones encontradas previamente en CcE7, hemos generado isolíneas con mutaciones específicas seleccionadas por su ubicación próxima a la entrada al centro activo de la enzima. La isolínea Sm2 (procedente de una hembra heterocigota para la mutación V96L y un macho homocigoto para el alelo no mutado) mantuvo altos niveles de resistencia a malatión, incluso después de 30 generaciones sin presión de selección. Por el contrario, la isolínea 267Y (compuesta por individuos homocigotos para la mutación L267Y) y la línea 306TY (compuesta por individuos homocigotos para la doble mutación R306T-N307Y) mostraron una reducción significativa en los niveles de resistencia. También hemos encontrado que la resistencia a malatión de la línea Sm2 fue parcialmente revertida por DEF y TPP, y que Sm2 mostró una reducción significativa en la actividad MTB, como se ha descrito en otras especies que muestran resistencia específica a malatión mediada por aliesterases. Además, fue posible asociar la presencia de la mutación V96L en individuos de la línea Sm2 con supervivencia a una concentración discriminante de malatión (5,000 ppm) y con una baja actividad MTB. Estos resultados sugieren una posible relación entre la mutación V96L en la aliesterasa CcE7 y la resistencia a malatión, aunque todavía no se puede concluir que la resistencia es causada por esta mutación, siendo necesarios más estudios para comprobar su contribución a la resistencia. En conclusión, se ha encontrado por primera vez resistencia a lambda-cihalotrina en poblaciones de campo de C. capitata, y nuestros resultados indican que las P450 son el principal mecanismo de resistencia en la línea W-1K. Esta situación se suma al caso previamente descrito de resistencia en campo a malatión asociada a la mutación G328A, a la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas. Nuestros resultados también indican que la alteración de la molécula diana AChE parece ser responsable de un cierto nivel de resistencia a malatión en C. capitata, que puede ser estimada como aproximadamente 25-40 veces para la mutación G328A y 40-60 veces para la duplicación; mientras que la resistencia mediada por esterasas y que ha sido asociada en este estudio con la mutación V96L en CcE7 puede conferir un efecto multiplicativo (por un factor de 5 a 10) aumentando la resistencia a malatión a 200-400 veces. Por otra parte, hemos demostrado que los insectos resistentes que llevan la duplicación tienen un coste biológico menor y muestran una estabilidad mayor que aquellos con la mutación G328A en ausencia de presión de selección con insecticidas. Esto representa un escenario en el que los genotipos con la duplicación permanecerán en el campo en frecuencias bajas a moderadas, pero podrían ser seleccionados rápidamente si se utilizan malatión u otros insecticidas que muestren resistencia cruzada. Estos resultados tienen importantes implicaciones para los programas de manejo de la resistencia, ya que el repertorio de insecticidas eficaces para el control de C. capitata es cada vez más limitado. Además, la coexistencia de múltiples mecanismos de resistencia en poblaciones de campo ofrece el potencial para desarrollar resistencia frente a otros insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Estrategias para de manejo de la resistencia basadas en la alternancia de insecticidas con diferentes modos de acción, y su combinación con otros métodos de control, deben ser implementadas para evitar el desarrollo de resistencia en campo. ABSTRACT The Mediterranean fruit fly (Medfly), Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), is one of the most economically damaging pests of citrus and other fruit crops worldwide. Control measures in citrus crops in Spain from the mid 90's to 2009 were mainly based on field monitoring of population levels and aerial and ground treatments with malathion bait sprays. However, since the withdrawal of phytosanitary products containing malathion in the European Union in 2009, lambda-cyhalothrin and spinosad have become the most widely used insecticides for the control of this pest. Resistance to malathion was found in Spanish field populations of C. capitata in 2004-2005. This resistance has been associated with a mutation G328A in the acetylcholinesterase (AChE), a duplication of the AChE gene (Ccace2) (one of the copies bearing the mutation G328A), and metabolic resistance mediated by esterases (probably aliesterases). However, when the gene of the aliesterase CcE7 was sequenced in individuals from a malathion resistant strain of C. capitata, none of the known G137D and/or W251L/S/G mutations associated to resistance in other species were found, though other mutations were detected when compared with individuals from a susceptible strain. Noteworthy, a lambda-cyhalothrin resistant strain (W-1K) was obtained by selecting a field-derived malathion resistant strain (W-4Km) with lambda-cyhalothrin. Moreover, it has also been demonstrated the capacity of this species to develop resistance to spinosad by laboratory selection. The multiple resistance mechanisms identified highlight the potential of this species to develop resistance to insecticides with different modes of action. The objectives of this PhD Thesis are: 1) to assess the susceptibility of Spanish field populations of C. capitata to lambda-cyhalothrin and to elucidate the resistance mechanisms in the W-1Kλ strain; 2) to compare the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A); and 3) to investigate the role of the aliesterase CcαE7 mutations in malathion resistance. All these studies will be of use for devising proactive resistance management strategies that could prevent or delay resistance development and would increase the sustainability of the insecticides available for Medfly control. Our results indicate that Spanish field populations of C. capitata have developed resistance to lambda-cyhalothrin. The LC50 values estimated for populations collected at Comunidad Valenciana, Cataluña and Andalucía ranged from 129 ppm to 287 ppm, equaling or overpassing the recommended concentration for field treatments (125 ppm). These results contrast with those obtained with three different Tunisian field populations, whose susceptibility was similar to that of the control (C) strain. The lambda-cyhalothrin resistant W-1K strain has been further selected to achieve a 205-fold resistance compared to the C strain, being its LC50 (4,224 ppm) more than 30 times higher than the recommended concentration for field applications. This resistant strain showed high levels of cross-resistance to deltamethrin (150-fold) and etofenprox (240-fold), suggesting that the development of resistance to lambda-cyhalothrin may compromise the effectiveness of other pyrethroids for the control of this species. We have shown that the resistance of the W-1K strain to lambda-cyhalothrin was almost completely suppressed by the synergist PBO, indicating that P450 enzymes play a very important role in resistance to this insecticide. However, both susceptible C and resistant W-1K flies were knocked down after topical treatment with lambda-cyhalothrin, suggesting that kdr resistance mediated by alterations of the target site is not playing a major role. Metabolic resistance mediated by P450 was further analyzed by comparing the expression of 53 genes of the families CYP4, CYP6, CYP9 and CYP12 in adults flies from the resistant W-1K and the susceptible C strains. We found that the gene CYP6A51 (GenBank accession number XM_004534804) was overexpressed (13-18-fold) in the W-1K strain. Moreover, the expression of the CYP6A51 gene was induced when adults of the W-1K and C strains were treated with lambda-cyhalothrin. However, no significant differences were obtained between susceptible C and resistant W-1K strains for the quantity of P450 and for the activity of NADPH- cytochrome c reductase measured in microsomal fractions obtained from abdomens. Moreover, we failed to correlate the metabolism of deltamethrin, analyzed in vitro by incubating this insecticide with microsomal fractions, with the resistance level against this pyrethroid observed in bioassays with W-1K. The sequencing of the 5´UTR region of the CYP6A51 gene failed in finding an alteration in the promoter region (-500 bp from translation start site) that could explain overexpression in the W-1K strain. All data obtained suggest that resistance to lambda-cyhalothrin in the W- 1K strain is mediated by P450 and that overexpression of CYP6A51 may play a major role, although further evidences are needed to establish a direct association of resistance with this gene. We have studied the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A). The malathion-susceptible C strain where the G328A mutation is not found (S/S genotype) was crossed with two isolines established to represent unique genotypes corresponding to the two target-site resistance mechanisms: 1) the 267Y isoline (genotype R/R) was established from a couple bearing the mutation G328A in homozygosis; and 2) the 306TY isoline (genotype RS/RS) was established from a couple being homozygous for the duplication of the Ccace2 gene. Reciprocal crosses have not been performed, since in situ hybridization on polythene chromosomes showed that the AChE locus and the duplication (most probably in tandem) are placed at the autosomal chromosome 2L. Mortality responses to malathion of resistant isolines (R/R or RS/RS) and susceptible (S/S) genotypes, F1 crosses (S/R, S/RS, and R/RS), and the back-crosses indicated that resistance to malathion is inherited as a semi-dominant trait in both cases. However, our results were not conclusive about the monogenic nature of the resistance to malathion in these isolines. Thus, we can not discard that other genes contributing to resistance, in addition to the mutation G328A (isoline 267Y) and the duplication of the Ccace2 gene (isoline 306TY), may have been selected during the selection process of 267Y and 306TY. Several biological parameters were evaluated to determine if these two malathion resistance mechanisms impose a fitness cost for resistant genotypes. Individuals with genotype R/R have a reduced fitness in terms of developmental time from egg to pupa, pupal weight and adult longevity, when compared to susceptible individuals (genotype S/S). Interestingly, the fitness cost was substantially diminished in individuals with genotype RS/RS. These differences in fitness may be related to the reduction of the catalytic efficiency of mutated AChE in individuals R/R, and the compensatory effect that the non-mutated copy of the gene has on individuals RS/RS bearing the duplication. The stability of malathion reistance associated with the mutation G328A or the duplication was analyzed by following these resistant traits in the progeny of the back-crosses S/RS x RS/RS and S/R x R/R over consecutive generations in the absence of insecticide selection pressure. Our results show that the frequency of the allele bearing the mutation G328A decreased from 67.5% at the first generation of the back-cross S/R x R/R (75% expected, assuming Mendelian segregation and that there are only two alleles: one mutated and the other non-mutated) to 12% after 10 generations. By contrast, the frequency of the duplication only declined from 75% at the first generation of the back-cross S/RS x RS/RS (75% expected, assuming Mendelian segregation and that the duplication segregates as an unique allele) to 50% in the same period, indicating that the duplication is more stable than the mutation. The presence of the mutation and the duplication was analyzed in field populations collected in six localities in 2004-2007, when malathion was still used, and compared to populations collected in the same fields in 2010, one year after the prohibition of malathion in the European Union. The average frequency of the susceptible genotype (S/S) increased from 55.9% in the period 2004-2007 to 70.8% in 2010, whereas the frequency of those genotypes carrying the mutation in homozygosis or heterozygosis (R/R and S/R) declined from 30.4 to 9.2%, those carrying the duplication in homozygosis or heterozygosis (RS/RS and S/RS) increased slightly from 12.8 to 13.3%, and those carrying both the mutation and the duplication (R/RS) also increased from 1 to 6.7%. These results are consistent with the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A and the other copy non-mutated) being more advantageous than the G328A mutation alone by maintaining resistance while restoring part of the fitness. In order to investigate the association of malathion resistance with mutations previously found in the aliesterase CcE7, we have generated isolines bearing specific mutations selected by their putative location near the upper part of the active site gorge of the enzyme. The isoline Sm2 (originating from a female heterozygous for the mutation V96L and a male homozygous for the non-mutated allele) kept high levels of resistance to malathion, even after 30 generations without selection pressure. On the contrary, the isoline 267Y (composed by individuals homozygous for the mutation L267Y) and the strain 306TY (composed by homozygous for the double mutation R306T-N307Y) showed a significant reduction in the levels of resistance. We have found also that resistance to malathion in the Sm2 isoline was partially reverted by DEF and TPP, and that Sm2 showed a significant reduction in MTB activity, as reported for other species showing malathion-specific resistance mediated by aliesterases. Besides, it was possible to associate the presence of the mutation V96L in individuals from the Sm2 isoline with both survival to a discriminating concentration of malathion (5,000 ppm) and low MTB activity. Our results point out to a possible connection betwen the mutation V96L in the aliesterase CcE7 and resistance to malathion, though we can not yet conclude that the resistance is caused by the mutation, being needed further work to understand its contribution to resistance. In conclusion, resistance to lambda-cyhalothrin has been found for the first time in field populations of C. capitata, and metabolic resistance mediated by P450 appears to be the main resistance mechanism in the resistant strain W-1K. These findings add to the previously reported case of field resistance to malathion, associated to the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A) and to metabolic resistance mediated by esterases. Our results also indicate that altered target site AChE appears to be responsible for a certain level of resistance to malathion in C. capitata, that can be estimated as about 25-40-fold for the mutation G328A and 40-60-fold for the duplication; whereas metabolic resistance mediated by esterases and associated in this study with the mutation V96L in CcE7 may confer a multiplicative effect (by a factor of 5 to10) increasing malathion resistance to 200-400-fold. Moreover, we have shown that resistant insects carrying the duplication have better fitness and exhibit a higher stability than those with the mutation G328A in the absence of insecticide pressure. This represents a scenario where genotypes with the duplication will remain in the field at low to moderate frequencies, but could be rapidly selected if malathion or other insecticides showing cross-resistance are used. These findings have important implications for resistance management programs, as the repertoire of effective insecticides for C. capitata control is becoming very limited. Besides, multiple resistance mechanisms coexisting in field populations provide the potential to develop resistance to other available insecticides for the control of this pest. Appropriate resistance management strategies based on the alternation of insecticides with different modes of action, and their combination with other control methods, must then be implemented to avoid the evolution of resistance in the field.

Multiple Hashing Integration for Real-Time Large Scale Part-to-Part Video Matching

A real-time large scale part-to-part video matching algorithm, based on the cross correlation of the intensity of motion curves, is proposed with a view to originality recognition, video database cleansing, copyright enforcement, video tagging or video result re-ranking. Moreover, it is suggested how the most representative hashes and distance functions - strada, discrete cosine transformation, Marr-Hildreth and radial - should be integrated in order for the matching algorithm to be invariant against blur, compression and rotation distortions: (R; _) 2 [1; 20]_[1; 8], from 512_512 to 32_32pixels2 and from 10 to 180_. The DCT hash is invariant against blur and compression up to 64x64 pixels2. Nevertheless, although its performance against rotation is the best, with a success up to 70%, it should be combined with the Marr-Hildreth distance function. With the latter, the image selected by the DCT hash should be at a distance lower than 1.15 times the Marr-Hildreth minimum distance.

Unearthing the roots of degradation of Quercus pyrenaica coppices: an integrative perspective from clonal structure to carbon budgets

Quercus pyrenaica es una especie rebrotadora de raíz intensa e históricamente aprovechada en monte bajo para la obtención de leñas, carbón y pastos. Debido al éxodo rural y a la aparición de nuevas fuentes energéticas, este aprovechamiento fue abandonado en la década de 1970. Desde entonces, las bajas producciones de madera y bellota y el puntisecado de los pies evidencian el generalizado estancamiento de estas masas. Uno de los mayores retos actuales de la selvicultura en el ámbito mediterráneo es encontrar usos alternativos para estos montes abandonados, siendo la conversión a monte alto una de las alternativas preferidas. Se han realizado resalveos de conversión, sin embrago, éstos se aplican sin un conocimiento integral de las causas de la degradación. En esta tesis doctoral, estudiamos un hipotético desequilibrio entre la parte radical y la parte aérea (R:S) de las cepas de rebollo como causa subyacente de su decaimiento. En una parcela experimental, aprovechada al menos desde el siglo XII, se realizaron análisis genéticos a priori para elucidar la estructura genética del rodal, y así estudiar la influencia del tamaño clonal en el funcionamiento de las cepas. Las cepas de mayor tamaño presentaron un menor crecimiento diametral de sus pies, así como mayores tasas de respiración radical, estimadas a partir de flujos internos de CO2 a través del xilema (FT) y de los flujos de CO2 del suelo. Estos resultados sugieren que el desequilibrio R:S aumenta con el tamaño clonal, dado que la eliminación periódica de órganos aéreos, al mismo tiempo que las raíces permanecen intactas, da lugar a un gran desarrollo del sistema radical que consume gran parte de los carbohidratos no estructurales (NSC) en respiración de mantenimiento, comprometiendo así el desarrollo de órganos aéreos. Se excavaron y pesaron dos cepas compuestas por cuatro y ocho pies, las cuales mostraron ratios R:S (0.5 y 1, respectivamente) superiores a los registrados en pies de origen sexual. Al igual que en otras especies rebrotadoras de raíz, se observaron altas concentraciones de NSC en las raíces (> 20% en primavera) y una gran proporción de albura en el sistema radical (52%) que alberga una notable reserva de NSC (87 kg en la cepa de mayor tamaño). En el sistema radical de dicha cepa, estimada mediante dataciones radiocarbónicas en 550 años de edad, se contaron 248 uniones radicales. La persistencia de sistemas radicales grandes, viejos, y altamente interconectados sugiere que la gran cantidad de recursos almacenados y consumidos en las raíces compensan un pobre desarrollo aéreo con una alta resiliencia vegetativa. Para un mejor entendimiento de los balances de carbono y del agotamiento de NSC en las cepas de rebollo, se midieron los flujos internos y externos de CO2 en troncos y los flujos de CO2 del suelo, y se estimó la respiración de órganos aéreos (RS) y subterráneos (RR). Estacionalmente, RS y RR reflejaron las dinámicas de flujo de savia y de crecimiento del tronco, y estuvieron determinadas principalmente por los flujos externos de CO2, dada la escasa contribución de FT a RS y RR (< 10% y < 2%, respectivamente). En una escala circadiana, la contribución de FT a RS aumentó hasta un 25% en momentos de alta transpiración. Las bajas concentraciones de CO2 en el xilema ([CO2] hasta un 0.11%) determinaron comparativamente unos bajos FT, probablemente causados por una limitada respiración del xilema y una baja resistencia a la difusión radial del CO2 impuestos por la sequía estival. Los pulsos de [CO2] observados tras las primeras lluvias de otoño apoyan esta idea. A lo largo del periodo vegetativo, el flujo medio de CO2 procedente del suelo (39 mol CO2 day-1) fue el mayor flujo respiratorio, tres y cuatro veces superior a RS (12 mol CO2 day-1) y RR (8-9 mol CO2 day-1), respectivamente. Ratios RR/RS menores que la unidad evidencian un importante peso de la respiración aérea como sumidero de carbono adicional. Finalmente, se ensayó el zanjado de raíces y el anillamiento de troncos como tratamientos selvícolas alternativos con el objetivo de aumentar las reservas de NSC en los troncos de las cepas. Los resultados preliminares desaconsejan el zanjado de raíces por el alto coste derivado posiblemente de la cicatrización de las heridas. El anillado de troncos imposibilitó el transporte de NSC a las raíces y aumentó la concentración de almidón por encima de la zona anillada, mientras que sistema radical se mantiene por los pies no anillados de la cepa. Son necesarias más mediciones y datos adicionales para comprobar el mantenimiento de esta respuesta positiva a largo plazo. Para concluir, destacamos la necesidad de estudios multidisciplinares que permitan una comprensión integral de la degradación de los rebollares ibéricos para poder aplicar a posteriori una gestión adecuada en estos montes bajos abandonados. ABSTRACT Quercus pyrenaica is a vigorous root-resprouting species intensively and historically coppiced for firewood, charcoal and woody pastures. Due to the rural exodus and the appearance of new energy sources, coppicing was abandoned towards 1970. Since then, tree overaging has resulted in stand stagnation displayed by slow stem growth, branch dieback, and scarce acorn production. The urgent need to find new alternative uses for abandoned coppices is recognized as one of the biggest challenges which currently faces Mediterranean silviculture; conversion into high forest by thinning is one of the preferred alternatives. For this aim, thinning has been broadly applied and seldom tested, although without a comprehensive understanding of the causes of stand stagnation. In this PhD study, we test the hypothesis of an imbalance between above- and below-ground organs, result of long term coppicing, as the underlying cause of Q. pyrenaica decay. In an experimental plot coppiced since at least the 12th century, genetic analyses were performed a priori to elucidate inconspicuous clonal structure of Q. pyrenaica to evaluate how clonal size affects the functioning of these multi-stemmed trees. Clonal size negatively affected diametric stem growth, whereas root respiration rates, measured by internal fluxes of CO2 through xylem (FT) and soil CO2 efflux, increased with clonal size. These results suggest root-to-shoot (R:S) imbalance intensifying with clonal size: periodic removal of aboveground organs whilst belowground organs remain undisturbed may have led to massive root systems which consume a great proportion of non-structural carbohydrates (NSC) for maintenance respiration, thus constraining aboveground performance. Furthermore, excavation of two multi-stemmed trees, composed by four and eight stems, revealed R:S ratios (0.5 and 1, respectively) greater than those reported for sexually regenerated trees. Moreover, as similarly observed in several root-resprouting species, NSC allocation to roots was favored ([NSC] > 20% in spring): a large proportion of sapwood maintained throughout the root system (52%) stored a remarkable NSC pool of 87 kg in the case of the largest clone. In this root system of the eight-stemmed tree, 248 root connections were counted and, by radiocarbon dating, its age was estimated to be 550-years-old. Persistence of massive, old and highly interconnected root systems suggests that enhanced belowground NSC storage and consumption reflects a trade-off between vegetative resilience and aboveground development. For a better understanding of tree carbon budget and the potential role of carbon starvation in Q. pyrenaica decay, internal and external stem CO2 fluxes and soil CO2 effluxes were monitored to evaluate respiratory costs above- and below-ground. On a seasonal scale, stem and root respiration (RS and RR) mirrored sap flow and stem growth dynamics. Respiration was determined to the greatest extent by external fluxes of CO2 to the atmosphere or soil, since FT accounted for a low proportion of RS and RR (< 10% and < 2%, respectively). On a diel scale, the contribution of FT to RS increased up to 25% at high transpiration rates. Comparatively low FT was determined by the low concentration of xylem CO2 registered ([CO2] as low as 0.11%), likely as a consequence of constrained xylem respiration and reduced resistance to CO2 radial diffusion imposed by summer drought. Xylem [CO2] pulses following first autumn rains support this idea. Averaged over the growing season, soil CO2 efflux was the greatest respiratory flux (39 mol CO2 day-1), three and four times greater than RS (12 mol CO2 day-1) and RR (8-9 mol CO2 day-1), respectively. Ratios of RR/RS below one evidence an additional and important weight of aboveground respiration as a tree carbon sink. Finally, root trenching and stem girdling were tested as complimentary treatments to thinning as a means to improve carbon reserves in stems of clonal trees. Preliminary results discouraged root trenching due to the high cost likely incurred for wound closure. Stem girdling successfully blocked NSC translocation downward, increasing starch concentrations above the girdled zone whilst the root system is fed by non-girdled stems within the clone. Further measurements and ancillary data are necessary to verify that this positive effect hold over time. To conclude, the need of multidisciplinary approaches for an integrative understanding on the functioning of abandoned Q pyrenaica coppices is highlighted for an appropriate management of these stands.

Modelo multidimensional de los factores que afectan la interacción entre marketing y ventas en el lanzamiento de nuevos productos en Latino América

Esta tesis se centra en la identificación y análisis de los factores que pueden favorecer o actuar como barreras del éxito de la implementación de la innovación y las relaciones entre sí, desde el enfoque de la interface marketing-ventas. El trabajo empírico se enmarca en el vacío de investigación existente en el campo del proceso de lanzamiento de nuevos productos en los mercados donde operan subsidiarias de empresas multinacionales de consumo masivo (FMCG). Las empresas FMCG son altamente dependientes de la innovación como proceso clave determinante del crecimiento competitivo de mediano y largo plazo. En un contexto de acortamiento del ciclo de vida de los productos, como resultado del desarrollo tecnológico y científico que impactan en el comportamiento de los consumidores, las empresas invierten un mayor nivel de recursos en el desarrollo de nuevos productos, reingeniería y programas de innovación (Mundra, Gulati y Gupta, 2013). Sin embargo, a pesar del aumento en la inversión, las tasas de éxito de la innovación reportadas son inferiores al 25% (Evanschitzky, Eisend, Calantone y Jiang, 2012). Aumentar las tasas de éxito de los proyectos de innovación es reconocida en la literatura como un elemento clave para la supervivencia y competitividad de las empresas, para ser superiores a su competencia y desarrollar nuevos modelos de negocios. A pesar de la existencia de estudios que intentan comprender el proceso de lanzamiento de nuevos productos, no se ha identificado un claro prototipo de gestión de la innovación (Gupta et al, 2007). Profundizando en los factores de éxito, los autores Keupp, Palmié y Gassman (2012) reconocen que la innovación exitosa no depende solamente de la estrategia de selección de los proyectos de innovación, sino también la forma en que los mismos son implementados (Klein and Sorra, 1996; Repenning, 2002; Keupp, Palmié y Gassmann, 2012). Al analizar la implementación de los proyectos de lanzamiento de nuevos productos al mercado, en empresas FMCG, dicho proceso es responsabilidad principalmente de las funciones de marketing y ventas a través de la comunicación con los consumidores y los clientes respectivamente (Ernst, Hoyer y Rubsaamen, 2010). Es decir que el éxito en la implementación de la innovación requiere la gestión efectiva de la relación inter-funcional entre marketing y ventas (Ernst, Hoyer y Rubsaamen, 2010; Hughes, Le Bon y Malshe, 2012). A pesar de la importancia de la integración entre marketing y ventas en la conceptualización e implementación de la innovación, este tema no ha sido estudiado en profundidad (Hughes, Le Bon y Malshe, 2012; Keupp, Palmié y Gassmann, 2012). En las empresas multinacionales, está demostrado que el desempeño de las subsidiarias determinan el éxito competitivo de la empresa a nivel global. El desafío de dichas subsidiarias es conjugar el desarrollo global de innovación y comunicación con las características locales de comportamiento del consumidor y el mercado. Por lo tanto, esta investigación empírica responde a la pregunta académica y de gestión acerca de cómo mejorar las tasas de éxito de lanzamiento de nuevos productos al mercado en subsidiarias de empresas de consumo masivo, desde la perspectiva de la relación entre marketing y ventas. En particular analiza cómo afectan la formalización de los procesos y los mecanismos de comunicación a la confianza interpersonal y a la efectividad de la interface marketing-ventas y dichos factores a su vez sobre la planificación integrada de la implementación de la innovación. La determinación de los factores o ítems que conforman cada uno de los constructos del proceso de ejecución de la innovación, se llevó a cabo a partir de una revisión exhaustiva del estado del arte de la literatura sobre las interfaces funcionales y el proceso de innovación. Posteriormente, los ítems seleccionados (más de 50 en total) fueron validados por referentes de marketing y ventas de Argentina y Uruguay a través de entrevistas en profundidad. A partir de los factores identificados se construyeron dos modelos teóricos: • (1) relativo a la influencia de las dimensiones de confianza interpersonal sobre la efectividad de las uniones inter-funcionales y como los mecanismos organizacionales, tales como la frecuencia y la calidad de la comunicación entre las áreas, afectan la confianza y la relación entre ellas; • (2) relativo a la dimensión planificación integrada de la implementación de la innovación, ya que durante el lanzamiento de nuevos productos al mercado, marketing y ventas utilizan procesos formales que facilitan la comunicación frecuente y efectiva, desarrollando confianza inter-personal que no solamente afecta la efectividad de su relación sino también el desarrollo de planes integrados entre ambas áreas. El estudio fue llevado a cabo en una empresa multinacional de consumo masivo que integra la lista Global 500 (Fortune, 2015), presente en todo el mundo con más de 25 marcas participantes en más de 15 categorías, implementando 150 proyectos de innovación en el último año. El grupo de subsidiarias en estudio fue reconocido a nivel mundial por su desempeño en crecimiento competitivo y su alta contribución al crecimiento total. El modelo analizado en esta tesis fue expandido al resto de América Latina, tratándose entonces de un caso ejemplar que representa una práctica de excelencia en la implementación de la innovación en subsidiarias de una empresa multinacional. La recolección de los datos fue llevado a cabo a través de un cuestionario estructurado y confidencial, enviado a la base de datos de todo el universo de directores y gerentes de marketing y ventas. El nivel de respuesta fue muy elevado (70%), logrando 152 casos válidos. El análisis de datos comprendió el análisis descriptivo de los mismos, estimación de fiabilidad y análisis factorial exploratorio a través del software SPSS v.20. El análisis factorial confirmatorio y el análisis de senderos para examinar las relaciones entre los factores se estudiaron mediante el software R (Package 2.15.1., R Core Team, 2012) (Fox, 2006). Finalmente se llevaron a cabo entrevistas en profundidad a gerentes de marketing y ventas de cada uno de los seis países con el fin de profundizar en los constructos y sus relaciones. Los resultados de los modelos demuestran que la frecuencia de comunicación impacta positivamente en la calidad de la misma, que a su vez afecta directamente la relación entre marketing y ventas. Adicionalmente, la calidad de la comunicación impacta sobre la confianza cognitiva, que a su vez se relaciona no solamente con la confianza afectiva sino también con la relación entre ambas áreas. Esto significa que para mejorar la implementación de la innovación, los gerentes deberían orientarse a reforzar la relación entre marketing y ventas facilitando la construcción de confianza interpersonal primero cognitiva y luego afectiva, incrementando la frecuencia de la comunicación que alimenta la calidad de la comunicación entre ambas áreas. A través del segundo modelo se demuestra que durante el lanzamiento de nuevos productos al mercado, marketing y ventas necesitan emplear procesos formales que faciliten la comunicación frecuente y efectiva. De esta forma se contrarresta el efecto negativo de la formalización sobre la planificación integrada entre ambas áreas. Adicionalmente, los gerentes de ambos departamentos deberían promover la construcción de confianza interpersonal, no solamente para mejorar la efectividad de la relación, sino también para desarrollar planes integrados de implementación de nuevos productos. Finalmente, se valida que la frecuencia de la comunicación, la confianza afectiva y la relación marketing-ventas, se relacionan positivamente con la planificación integrada en la implementación de la innovación. El estudio contribuye a la comprensión de los factores que las empresas pueden emplear para mejorar la relación inter-funcional entre marketing y ventas y la implementación de la innovación en empresas de consumo masivo. El aporte de esta investigación puede ser valorado de dos maneras, los aportes a la gestión y a la academia. Desde el punto de vista empresarial, provee a los líderes al frente de empresas de consumo masivo, del conocimiento sobre los factores que afectan la implementación de la innovación y en definitiva el éxito del negocio a mediano y largo plazo. Desde el punto de vista académico aporta al conocimiento del proceso de implementación de la innovación y en la efectividad de la interface marketing y ventas en un caso de buenas prácticas en el mercado de consumo masivo. A su vez incorpora por primera vez un estudio empírico en geografías emergentes capaces de recuperar el camino de crecimiento posterior a una profunda crisis económica a través de la exitosa implementación de la innovación en sus mercados. ABSTRACT This thesis is focused on the identification, analysis and relationship study of factors which may benefit or hinder the successful deployment of innovation, from a marketing-sales interface perspective. Considering the non-existent investigation dedicated to the study of new products launches into markets in which Fast Moving Consumer Goods (FMCG) companies’ subsidiaries operate, it is that this investigation has been carried out. FMCG companies rely on innovation as their key process for a competitive growth on a medium and long term basis. Nowadays, the life-cycle of products is getting shorter as a result of new technological and scientific development, having impact on consumer behavior, and therefore companies are forced to dedicating more resources to the development of new products, reengineering and innovation programs (Mundra, Gulati and Gupta, 2013). However, in spite of the investment increase, the innovation success rates have been reported to be lower than 25% (Evanschitzky, Eisend, Calantone y Jiang, 2012). Increasing success rates on innovation processes has been considered as a key element on the survival and competitiveness of companies, outperforming competitors and developing new business models. Despite new studies which try to comprehend the process of new products launch, a prototype of innovation management has not yet been identified (Gupta et al, 2007). Emphasizing on success factors, authors Keupp, Palmié and Gassman (2012) recognize that successful innovation does not solely depend on innovation processes’ selection strategy, but it is also based on the way in which these are implemented (Klein and Sorra, 1996; Repenning, 2002; Keupp, Palmié y Gassmann, 2012). While analyzing the implementation of projects for new products releases on massive consumption companies, the two departments in charge of taking this forward are marketing and sales, by focusing on communication strategies with consumers and clients respectively (Ernst, Hoyer y Rubsaamen, 2010). This means that having success on innovation implementation requires an effective management of inter-functional relationship among marketing and sales (Ernst, Hoyer y Rubsaamen, 2010; Hughes, Le Bon y Malshe, 2012). In spite of the importance on the integration between marketing and sales on the conceptualization and implementation of innovation, this subject has not been studied in depth (Hughes, Le Bon y Malshe, 2012; Keupp, Palmié y Gassmann, 2012). In multinational companies, previous research has confirmed that the performance of their subsidiaries determine the competitive success of the company on a global scale. The challenge of said subsidiaries is to conjugate the global innovation development and communication with the local consumer and market behavior. Therefore, this empirical study aims to respond to the academic and management question of how to improve the success rates of new product launches into MNE subsidiary’ markets, from a marketing-sales relationship perspective. Particularly, this investigation analyses how the formalization of products and communication mechanisms affect interpersonal trust and marketing-sales interface effectiveness and also on how these factors affect the overall planning of the implementation of innovation. The determination of which factors build the hypothesis of the innovation execution process was taken forward through an extensive research on the extant literature on functional interfaces and innovation processes. More than 50 items were selected which were in turn validated by marketing and sales referents on Uruguay and Argentina through in depth interviews. Based on the identified factors, two theoretical models were proposed: (1) Relative to the influence that interpersonal trust dimensions have on inter functional linkages effectiveness and how organizational mechanisms such as frequency and quality of communication between departments affect trust and their relationship. (2) Relative to the integrated planning and innovation implementation dimensions. Marketing and sales department use formal process thus allowing inter-personal trust, which affects positively their relationship and also enables the development of integrated planning between them. The study was performed within a massive consumption company which is part of the “Global 500” (Fortune, 2015), with subsidiaries all over the world and more than 25 participant brands in 15 categories, having implemented over 150 innovation projects in the year under study. The analyzed subsidiary group has been awarded worldwide for their performance in competitive growth and their high contribution to the total growth. The model being analyzed in this thesis was implemented throughout Latin America, representing a remarkable case of innovation implementation excellence for subsidiaries of multinational companies. Data recollection was carried out through a structured and confidential questionnaire, sent to the universe of marketing-sales directors and managers’ database available with a high level of responsiveness of 70%, resulting in 152 valid cases. Data exploration involved a descriptive analysis, followed by a reliability estimation and an exploratory factorial analysis carried out through SPSS v.20. Confirmatory factorial analysis and path analysis (to examine relations between the different study factors) were studied using “R” software (Package 2.15.1., R Core Team, 2012) (Fox, 2006). Finally, in depth interviews were carried out to several marketing and sales managers in each of the six countries so as to further confirm the hypothesis and their relations. The models results prove that communication frequency has a positive impact on the quality of the same, which in turn has direct effects on the marketing-sales relations. Additionally, communication quality has an impact on the cognitive trust, which also relates not only to affective trust, but also to the relation between both areas. This means that in order to improve the implementation of innovation, managers should strive to enforce marketing-sales relations, facilitating the interpersonal trust construction (firstly cognitive, followed by affective trust), increasing the communication frequency, and therefore nurturing the communication quality among both areas. Through the second model, the results confirm the importance of creating effective relationships between sales and marketing to facilitate planning integrated new product implementations. While formalized new product development processes provide opportunities for sales and marketing to communicate, this does not directly influence the planning of integrated new product implementations. By using these formal opportunities to communicate to create information quality, it is possible to improve sales and marketing’s ability to integrate information during the planning process. Further, communication quality creates inter-personal trust in the other party’s competences (cognitive-based trust), leading to affect-based trust. Affect-based inter-personal trust, not only to improve the overall effectiveness of the sales and marketing relationship, but also helps in planning integrated new product implementations. This study contributes to the understanding of factors which enterprises can use to improve the inter-functional relations between marketing and sales, and the implementation of innovation in FMCG companies. The contribution of this investigation can be measured in two ways: enrichment of management and contribution to the academic area. From a business perspective, it provides massive consumption businesses leaders with knowledge on which factors affect innovation implementation, which results on mid and long-term success for the company. From an academic point of view, it provides knowledge on a prototype of successful innovation implementation management based on the marketing-sales interface effectiveness through a case study in the FMCG consumption market. Last but not least, it incorporates for the first time an empiric study on emerging geographies capable of recovery post a deep economic crisis through successful innovation implementation on their markets.