Estudio de la estabilidad genética asociada a los procesos de crioconservación de ápices de menta

La crioconservación se ha descrito como una técnica de conservación ex situ a largo plazo que ha sido aplicada con éxito a numerosas especies, y resulta especialmente importante en aquellas con propagación vegetativa, infértiles o amenazadas, en las que sistemas de conservación ex situ más sencillos, como los bancos de semillas, no son posibles. También presenta ventajas frente a la conservación in vitro, ya que logra disminuir o eliminar problemas como la excesiva manipulación del material, evitando los subcultivos periódicos y disminuyendo así el riesgo de contaminaciones y de aparición de variación somaclonal. Sin embargo, someter al material vegetal a los procedimientos que implica la crioconservación provoca distintos estreses. Entre ellos, el estrés oxidativo puede potencialmente producir daños en membranas, proteínas, carbohidratos y en el ADN. En este trabajo se han evaluado diversos sistemas de crioconservación en ápices de Mentha × piperita L., híbrido estéril entre Mentha aquatica L. y Mentha spicata L. Se han utilizado ápices de dos genotipos (‘MEN 186’y ‘MEN 198’) en los cuales se compararon dos técnicas de crioconservación, encapsulación-deshidratación y vitrificación-droplet. El análisis de la supervivencia y capacidad de regeneración del material sometido a los tratamientos de crioconservación, junto con el análisis de la estabilidad genética de dicho material mediante marcadores moleculares (RAPD y AFLP) han permitido comparar los distintos protocolos y tratamientos establecidos. El estudio sobre el tipo de protocolo empleado reveló una mayor variabilidad genética en la técnica de encapsulación-deshidratación, especialmente en el genotipo ‘MEN 186’, ya que ‘MEN 198’ resultó ser más estable en todos los análisis. La inestabilidad encontrada en esta técnica no fue exclusiva de aquellos explantos crioconservados, sino que los pasos previos a la inmersión en nitrógeno líquido (NL) también provocaron variaciones en el ADN. Según el tipo de muestra analizada se encontraron diferencias en la estabilidad: muestras provenientes de callos presentaron una mayor inestabilidad que aquellas de hojas (brotes). Se utilizaron tres medios para la recuperación de los ápices tras la crioconservación con el uso de diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento: “Reed” (0,5 mgL-1 6-bencilaminopurina, BAP), “Senula” (0,5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purina, 2-iP + 0,1 mgL-1 ácido α-naftalen-acético, ANA) y “Nudos” (0,5 mgL-1 BAP + 0,1 mgL-1ANA). El medio “Reed” produjo un aumento en la supervivencia y recuperación de los ápices en ambos genotipos y técnicas, y disminuyó la formación de callo. Sin embargo, no tuvo un efecto significativo en la estabilidad genética. El medio “Senula” provocó una mayor estabilidad genética en el genotipo más inestable, ‘MEN 186’. Para reducir el daño oxidativo producido durante la encapsulación-deshidratación, e incrementar la recuperación de los ápices manteniendo su estabilidad genética, se comparó el efecto de añadir sustancias antioxidantes en el precultivo de los ápices (ácido ascórbico, vitamina E y glutatión). No se obtuvo la respuesta esperada y estos tratamientos no presentaron efectos significativos tanto en la estabilidad como en la recuperación. Para entender mejor qué sucede durante todo el proceso de encapsulación-deshidratación, se evaluó cada paso del protocolo por separado y su efecto en la estabilidad y la recuperación. Además, se determinó el estado de oxidación en cada etapa mediante la cuantificación de malondialdehído y la detección de la formación de radicales libres (mediante el ensayo del ácido tiobarbitúrico, y sondas fluorescentes específicas, respectivamente). Se determinó que a partir de los primeros pasos se genera estrés oxidativo, el cual aumenta a medida que se avanza por el protocolo hasta la inmersión en nitrógeno líquido. Esto se ve reflejado en la disminución progresiva tanto de la recuperación como de la estabilidad genética. Con el uso de antioxidantes en el precultivo (ácido ascórbico y vitamina E) no se obtuvo un efecto positivo en el mantenimiento de la estabilidad genética, y tan sólo con el uso de vitamina E se observó una recuperación mayor en uno de los pasos estudiados (después de la desecación). Sin embargo, cuando se utilizó ácido ascórbico durante el precultivo o la deshidratación osmótica se consiguió disminuir de forma significativa la formación de MDA y la acumulación del radical superóxido (O2•-) en la mayoría los pasos analizados, aunque esta reducción no parece tener un efecto directo en la estabilidad genética del material recuperado. ABSTRACT Cryopreservation has been described as an effective technique for the long term of ex situ conservation that has been successfully applied to numerous species, and is of especial relevance for those with vegetative propagation, infertile or endangered, in which simpler systems of ex situ conservation, such as seed banking, are not feasible. It also has advantages over in vitro conservation, as it reduces or eliminates excessive material handling, avoids periodic subcultures and thus limits the risk of contamination and the appearance of somaclonal variation. However, plant material is subjected to different treatments involved in the cryopreservation procedures, which impose several stresses. Among them, oxidative stress can potentially cause damage to membranes, proteins, carbohydrates and DNA. In this work, two cryopreservation techniques have been evaluated in Mentha × piperita L. shoot tips, sterile hybrid between Mentha aquatica L. and Mentha spicata L. Two genotypes ('MEN 186' and 'MEN 198') were used to compare two techniques: encapsulation-dehydration and droplet-vitrification. The analysis of survival and recovery capacity of the material after the cryopreservation treatments, and the analysis of the genetic stability by molecular markers (RAPD and AFLP) have enabled the comparison between protocols and treatments. The study of the two cryopreservation procedures revealed a higher genetic variability in the encapsulation-dehydration technique, especially in genotype 'MEN 186', as 'MEN 198' was more stable in all analyses. The instability generated in this technique was not exclusive of cryopreserved explants, pretreatments prior to immersion in NL also caused DNA variations. The type of sampled plant material revealed also differences in the stability: callus samples showed greater instability than shoots. Three different culture media were used for the recovery of shoot tips after cryopreservation, using different combinations of growth regulators: "Reed" (0.5 mgL-1 6-benzylaminopurine, BAP), "Senula" (0.5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purine, 2-iP + 0.1 mgL-1 α-naphthalene acetic acid, ANA) and "Nodes" (0.5 mgL-1 BAP + 0.1 mgL-1 ANA). "Reed" medium increased survival and recovery of shoot tips in both genotypes and techniques and decreased callus formation. However, it didn`t have a significant effect on genetic stability. "Senula" medium caused a higher genetic stability in the most unstable genotype, 'MEN 186'. To reduce oxidative damage during encapsulation-dehydration, and increase shoot tip recovery and maintain genetic stability, the effect of added antioxidants (ascorbic acid, vitamin E and glutathione) in the shoot tip preculture medium was studied. These treatments had no significant effect on both stability and recovery. To better understand the events during the encapsulation-dehydration process, the effect of each step of the protocol on stability and recovery was evaluated separately. Moreover, the oxidation level was determined by quantifying malondialdehyde (MDA) formation and detecting free radical accumulation (using the thiobarbituric acid assay, and specific fluorescent probes, respectively). The oxidative stress was detected from the first steps and increased throughout the protocol until the immersion in liquid nitrogen. This was also reflected in the gradual decline of recovery and genetic stability. The use of antioxidants (ascorbic acid and vitamin E) in the shoot tip preculture medium had no effect in maintaining genetic stability; only vitamin E increased recovery in one of the steps studied (after desiccation). However, when ascorbic acid was used during the preculture or during the osmotic dehydration, a significantly decrease was observed in MDA formation and superoxide radical accumulation in most of the steps analyzed, although this reduction did not seem to have a direct effect on the genetic stability of recovered material.

Fenómenos dinámicos de estabilidad de un buque en olas longitudinales: resonancia paramétrica. Influencia en el proyecto y equipo. Guía operacional al capitán

El fenómeno de balance paramétrico se ha convertido en un tema de actualidad en los últimos años debido al aumento de accidentes relacionados y las discusiones en OMI debido a su indiscutible importancia en la seguridad del buque, su carga y tripulación. Por esta razón, su estudio ha atraído el interés de universidades, administraciones y sociedades de clasificación. Esta tesis trata el fenómeno de balance paramétrico desde diferentes puntos de vista. Primero, se estudiaran los diferentes escenarios donde el fenómeno de balance paramétrico ha ocurrido para entender cómo se desarrolla el fenómeno en la vida real, así como sus implicaciones en la seguridad de las personas y carga abordo. Un modelo matemático no lineal de movimiento de balance desacoplado es propuesto. Este modelo se basa en la aproximación cuadrática del momento de amortiguamiento junto con un brazo adrizante dependiente del tiempo. Este modelo es validado con datos experimentales del Canal de Ensayos de la ETSI Navales (UPM) relativos a un buque de pesca de 34.5m de eslora y dos cubiertas para diferentes casos de olas longitudinales. Se encuentra una correspondencia muy satisfactoria en términos de fase y amplitud entre el modelo teórico y los datos de canal para el caso en particular. El modelo es comparado con el estado del arte de la tecnología disponible actualmente, así como con los requisitos mínimos que están siendo discutidos en OMI relativos a los Criterios de Estabilidad de Segunda Generación. Finalmente, el fenómeno es revisado desde los puntos de vista de diseño y operacional para entender los parámetros relevantes detrás del fenómeno y conocer/aplicar las herramientas disponibles y medios para afrontar/mitigar este fenómeno. ABSTRACT A parametric roll resonance phenomenon has become a very relevant technical issue in recent years due the increasing number of accidents related and the ongoing discussions at the IMO due to its undisputed importance in the safety of the ship, its cargo and crew. For this reason, its study has attracted the interest of universities, regulatory bodies and classification societies. This thesis deals with this phenomenon of parametric roll resonance from different points of view. First, we will look at different real scenarios where parametric roll resonance phenomena has occurred in order to further understand how it is developed in real life and its implications for the safety of the people and cargo onboard. A non-linear mathematical model of the uncoupled roll motion is also presented. This model is based on a classic quadratic approximation of the damping momentum together with a time-varying restoring arm. This model is validated with real data taken from experimental results of the E.T.S.I. Navales Towing Tank on a trawler of two decks of 34.5 m. length for different cases of longitudinal waves. A very satisfactory correspondence, in terms of phase and amplitude, is found between the theoretical model presented and the real data on this particular case. The model is compare with the state-of-the-art technology currently available as well as with the minimum requirements currently being discussed as part of the IMO SGISC. Finally, the phenomenon is reviewed from design and operational aspects to understand the underlying parameters and know the available tools and ways to tackle/mitigate this phenomenon.

Estudio de una metodología de software para la predicción y análisis del balance paramétrico de buques para su aplicación en los criterios de estabilidad de segunda generación

El objetivo de ésta tesis es estudiar cómo desarrollar una aplicación informática que implemente algoritmos numéricos de evaluación de características hidrodinámicas de modelos geométricos representativos de carenas de buques. Se trata de especificar los requisitos necesarios que debe cumplir un programa para informático orientado a dar solución a un determinado problema hidródinámico, como es simular el comportamiento en balance de un buque sometido a oleaje, de popa o proa. una vez especificada la aplicación se realizará un diseño del programa; se estudiarán alternativas para implementar la aplicación; se explicará el proceso que ha de seguirse para obtener la aplicación en funcionamiento y se contrastarán los resultados obtenidos en la medida que sea posible. Se pretende sistematizar y sintetizar todo el proceso de desarrollo de software, orientado a la simulación del comportamiento hidrodinámico de un buque, en una metodología que se pondrá a disposición de la comunidad académica y científica en la forma que se considere más adecuada. Se trata, por tanto, de proponer una metodología de desarrollo de software para obetener una aplicación que facilite la evaluación de diferentes alternativas de estudio variando parámetros relativos al problema en estudio y que sea capaz de proporcionar resultados para su análisis. Así mismo se incide en cómo ha de conducirse en el proceso para que dicha aplicación pueda crecer, incorporando soluciones existentes no implementadas o nuevas soluciones que aparezcan en este ámbito de conocimiento. Como aplicación concreta de la aplicación se ha elegido implementar los algoritmos necesarios para evaluar la aparición del balance paramétrico en un buque. En el análisis de éste problema se considera de interés la representación geométrica que se hace de la carena del buque. Además de la carena aparecen otros elementos que tienen influencia determinante en éste estudio, como son las situación de mar y las situaciones de carga. Idealmente, el problema sería resuelto si se consiguiera determinar el ángulo de balance que se produce al enfrentar un buque a las diferentes condiciones de mar. Se pretende preparar un programa utilizando el paradigma de la orientación a objetos. Considero que es la más adecuada forma de modularizar el programa para poder utilizar diferentes modelos de una misma carena y así comparar los resultados de la evaluación del balance paramétrico entre sí. En una etapa posterior se podrían comparar los resultados con otros obtenidos empíricamente. Hablo de una nueva metodología porque pretendo indicar cómo se ha de construir una aplicación de software que sea usable y sobre la que se pueda seguir desarrollando. Esto justifica la selección del lenguaje de programación C++. Se seleccionará un núcleo geométrico de software que permita acoplar de forma versátil los distintos componentes de software que van a construir el programa. Este trabajo pretende aplicar el desarrollo de software a un aspecto concreto del área de conocimiento de la hidrodinámica. No se pretende aportar nuevos algoritmos para resolver problemas de hidrodinámica, sino diseñar un conjunto de objetos de software que implementen soluciones existentes a conocidas soluciones numéricas a dichos problemas. Se trata fundamentalmente de un trabajo de software, más que de hidrodinámica. Lo que aporta de novedad es una nueva forma de realizar un programa aplicado a los cálculos hidrodinámicos relativos a la determinación del balance paramétrico, que pueda crecer e incorporar cualquier novedad que pueda surgir más adelante. Esto será posible por la programación modular utilizada y los objetos que representan cada uno de los elementos que intervienen en la determinación del balance paramétrico. La elección de aplicar la metodología a la predicción del balance paramétrico se debe a que este concepto es uno de los elementos que intervienen en la evaluación de criterios de estabilidad de segunda generación que estan en estudio para su futura aplicación en el ámbito de la construcción naval. Es por tanto un estudio que despierta interés por su próxima utilidad. ABSTRACT The aim of this thesis is to study how to develop a computer application implementing numerical algorithms to assess hydrodynamic features of geometrical models of vessels. It is therefore to propose a methodology for software development applied to an hydrodynamic problem, in order to evaluate different study alternatives by varying different parameters related to the problem and to be capable of providing results for analysis. As a concrete application of the program it has been chosen to implement the algorithms necessary for evaluating the appearance of parametric rolling in a vessel. In the analysis of this problem it is considered of interest the geometrical representation of the hull of the ship and other elements which have decisive influence in this phenomena, such as the sea situation and the loading condition. Ideally, the application would determine the roll angle that occurs when a ship is on waves of different characteristics. It aims to prepare a program by using the paradigm of object oriented programming. I think it is the best methodology to modularize the program. My intention is to show how face the global process of developing an application from the initial specification until the final release of the program. The process will keep in mind the spefici objetives of usability and the possibility of growing in the scope of the software. This work intends to apply software development to a particular aspect the area of knowledge of hydrodynamics. It is not intended to provide new algorithms for solving problems of hydrodynamics, but designing a set of software objects that implement existing solutions to these problems. This is essentially a job software rather than hydrodynamic. The novelty of this thesis stands in this work focuses in describing how to apply the whole proccess of software engineering to hydrodinamics problems. The choice of the prediction of parametric balance as the main objetive to be applied to is because this concept is one of the elements involved in the evaluation of the intact stability criteria of second generation. Therefore, I consider this study as relevant usefull for the future application in the field of shipbuilding.