Respuesta transcripcional de Populus a bifenilos policlorados: Aspectos aplicados a la fitorremediación

La degradación del suelo ha adquirido una magnitud preocupante. Los métodos tradicionales de descontaminación, son costosos e insuficientes. La fitorremediación representa una alternativa eficaz, de bajo coste, respetuosa con el medio ambiente, que además mejora las propiedades del suelo, si bien ha habido desarrollos relevantes en la última década. Desde el punto de vida científico, el reto principal es descifrar las rutas metabólicas implicadas en respuesta a contaminantes y comprender su regulación. Esta información es imprescindible si aspiramos a mejorar las capacidades naturales de algunas especies vegetales para remediar los suelos contaminados. Los estudios de esta Tesis se han centrado en Populus, el mejor modelo forestal disponible a raíz de la secuenciación de su genoma completo. Por otra parte, Populus tiene una gran capacidad natural para la degradación de contaminantes orgánicos, lo que explica su predominio en los programas forestales de fitorremediación que se desarrollan actualmente. Hemos elegido en concreto al híbrido Populus tremula x P. alba, por la facilidad con que se cultiva y su particular interés biotecnológico. La presente Tesis plantea un estudio comprehensivo de la respuesta molecular a bifenilos policlorados (PCBs), una familia de contaminantes orgánicos persistentes de particular relevancia a escala mundial. Se ha utilizado para ello una aproximación transcriptómica, basada en tecnología RNA-seq, para identificar los genes implicados en el metabolismo de los compuestos in planta y cuantificar sus niveles de activación en distintas situaciones controladas. La tesis pretende asimismo definir el control transcripcional subyacente a la respuesta bioquímica frente a este tipo de contaminantes. Resulta sorprendente que dicha respuesta sea prácticamente desconocida a nivel molecular, a pesar de su gran potencial aplicado en el contexto de la tecnología fitorremediadora. Para desarrollar este proyecto aplicamos a nuestros cultivos de chopo híbridos concentraciones diferentes de Aroclor 1221, una mezcla de PCBs muy utilizada a nivel comercial durante décadas, su uso está prohibido hoy internacionalmente. Y tomamos muestras de RNA a dos concentraciones y dos momentos distintos de exposición al contaminante, generando así una matriz de cuatro elementos con sus controles correspondientes. Con el fin de incrementar la especificidad de nuestro análisis, consideramos sobre todo los genes diferencialmente expresados más significativos según cuatro algoritmos estadísticos distintos. Por otra parte, realizamos análisis funcionales con herramientas bioinformáticas basadas en comparaciones de secuencias y en redes de co-expresión génica. La respuesta de los genes de particular interés fue validada mediante tecnología qRT-PCR (reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa en tiempo real). Se trata del primer estudio comprehensivo de la respuesta de un organismo vegetal ante la presencia de PCBs. Este estudio nos ha permitido identificar una cantidad considerable de genes estructurales y reguladores, definiendo nuevos factores de transcripción cuya expresión es proporcional a la concentración de contaminante en el medio o al tiempo de exposición al mismo. Los análisis de correlación nos permiten afirmar en que la respuesta metabólica a PCBs, incluyendo posibles rutas degradadoras, participan en al menos quince factores de transcripción y unas cuarenta proteínas o enzimas que resultan particularmente inducidas. Entre las familias implicadas destacan los citocromos P450, la glutatión transferasas, las deshidrogenasas reductasas (short-chain dehydrogenase reductase) y las proteínas MDR (multi-drug resistance). Mientras que los factores de transcripción encontrados pertenecen a la familia de ZF-TF, MYBs, WRKYs entre otros. También identificamos proteínas de función desconocida que no se habían vinculado previamente a este tipo de respuestas en plantas, como la CSP (cold-shock domain proteins). Para estudiar su posible relación con la presencia de PCBs, se caracterizó un gen de esta familia detectado mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) a partir de mapas IEF x SDS-PAGE (isoelectro focusing x sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) de alta resolución. Mediante qRT-PCR pudimos confirmar la inducción del gen correspondiente, ortólogo a PtCSP4 de P. trichocarpa (Potri.004g172600), en respuesta a Aroclor 1221. El análisis fenotípico de las líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobre-expresaba la proteína CSP de chopo híbrido confirmó un papel para la misma tolerancia a PCBs, posiblemente a través de mecanismos reguladores que activan proteínas MDR. Este trabajo, además de aportar datos novedosos sobre los mecanismos moleculares desencadenados por la presencia de un PCB en Populus, utilizado aquí como sistema modelo. Con ello se demuestra el potencial de las especies arbóreas no solo como agentes descontaminantes, ya explotado comercialmente, sino también como fuente potencial de genes interesantes. Entre los genes identificados en esta Tesis hay candidatos evidentes a participar en mecanismos de tolerancia al estrés inducido por la contaminación y también rutas metabólicas degradadores de PCBs. Precisamente la posibilidad de degradar al contaminante confiere particular interés a este tipo de estudios frente a la fitorremediación de metales pesados y otros contaminantes elementales. La comparación de los datos generados en este estudio con estudios análogos que se realicen en el futuro con otras especies y xenobióticos, contribuirán a definir mejor la respuesta de las plantas ante la contaminación orgánica y mejorar su potencial descontaminante. ABSTRACT Soil degradation has acquired a disturbing magnitude. Traditional methods of decontamination are expensive and insufficient. Phytoremediation represent an effective alternative, low cost, respectful of the environment, that also improves soil properties, although there have been relevant developments in the last decade. From a life scientist, the challenge is to decipher the major metabolic pathways involved in response to pollutants and understand their regulation. This information is essential if we desire to enhance the natural abilities of some plant species to remediate contaminated soils. This thesis studies have focused on Populus, the best available forestry model following the sequencing of the entire genome. Moreover, Populus has a natural ability to degrade organic pollutants, which explains its predominance in phytoremediation forestry programs currently being developed. We have chosen specifically to hybrid Populus tremula x P. alba, the ease with which it is grown and its particular biotechnological interest. This thesis presents a comprehensive study of the molecular response to polychlorinated biphenyls (PCBs), a family of persistent organic pollutants of particular relevance worldwide. It has been used for a transcriptomic approach using RNA-seq technology, to identify genes involved in the metabolism of compounds in plant and quantify their levels of activation in different controlled situations. The thesis also aims to define the underlying transcriptional control the biochemical response to these pollutants. It is surprising that the response is virtually unknown at the molecular level, despite its great potential applied in the context of phytoremediation technology. To develop this project we applied our hybrid poplar crops different concentrations of Aroclor 1221, a mixture of PCBs widely used commercially for decades, its use is now banned internationally. And we RNA samples at two different concentrations and times of exposure to the pollutant, generating an array of four elements with their corresponding controls. In order to increase the specificity of our analysis, we consider mainly the most significant differentially expressed genes in four different statistical algorithms. Moreover, functional analyzes conducted with bioinformatics tools based on sequence comparisons and networks gene co-expression. The response of genes of particular interest was validated by qRT-PCR (polymerase reaction chain in real-time quantitative. This is the first comprehensive study of the response of a plant organism in the presence of PCBs. This study allowed us to identify a considerable amount of structural and regulatory genes, defining new transcription factors whose expression is proportional to the concentration of contaminant in the middle or at the time of exposure. Correlation analyzes allow us to affirm that the metabolic response to PCBs, including possible degradative pathways, at least fifteen involved in transcription factors and forty proteins or enzymes which are particularly induced. Among the families involved include cytochromes P450, the glutathione transferases, dehydrogenases reductases (short -chain dehydrogenase reductase) and MDR proteins (multi - drug resistance). While transcription factors belong to the family found ZF-TF, MYBs, WRKYs among others. We also identify proteins of unknown function that had not been previously linked to such responses in plants such as CSP (cold- shock domain proteins). To study their possible relationship with the presence of PCBs, a gene in this family was characterized and was detected by tandem mass spectrometry (MS/MS) from maps IEF x SDS -PAGE (sodium dodecyl isoelectro x sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) of high resolution. By qRT -PCR could confirm the induction of the corresponding gene, ortholog to PtCSP4 of P. trichocarpa (Potri.004g172600), in response to Aroclor 1221. Phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines over- expressing the protein CSP poplar hybrid confirmed a role for PCBs same tolerance, possibly through regulatory mechanisms activated MDR proteins. This work, in addition to providing new data on the molecular mechanisms triggered by the presence of PCBs in Populus, used here as a model system. Thus the potential of tree species not only as decontamination agents, and commercially exploited, but also as a potential source of interesting genes is shown. Among the genes identified in this thesis there are evident candidates to participate in tolerance mechanisms to stress induced by pollution and degrading metabolic pathways of PCBs. Precisely the possibility of degrading the pollutant attaches particular interest to this type of study off the phytoremediation of heavy metals and other elemental pollutants. The comparison of the data generated in this study with similar studies carried out in the future with other species and xenobiotics contribute to better define the response of plants to organic pollution and improve their decontamination potential.

Hidrodinamica de planeadores submarinos y su impacto en la funcionalidad de sensores CTD

Los recientes desarrollos tecnológicos permiten la transición de la oceanografía observacional desde un concepto basado en buques a uno basado en sistemas autónomos en red. Este último, propone que la forma más eficiente y efectiva de observar el océano es con una red de plataformas autónomas distribuidas espacialmente y complementadas con sistemas de medición remota. Debido a su maniobrabilidad y autonomía, los planeadores submarinos están jugando un papel relevante en este concepto de observaciones en red. Los planeadores submarinos fueron específicamente diseñados para muestrear vastas zonas del océano. Estos son robots con forma de torpedo que hacen uso de su forma hidrodinámica, alas y cambios de flotabilidad para generar movimientos horizontales y verticales en la columna de agua. Un sensor que mide conductividad, temperatura y profundidad (CTD) constituye un equipamiento estándar en la plataforma. Esto se debe a que ciertas variables dinámicas del Océano se pueden derivar de la temperatura, profundidad y salinidad. Esta última se puede estimar a partir de las medidas de temperatura y conductividad. La integración de sensores CTD en planeadores submarinos no esta exenta de desafíos. Uno de ellos está relacionado con la precisión de los valores de salinidad derivados de las muestras de temperatura y conductividad. Específicamente, las estimaciones de salinidad están significativamente degradadas por el retardo térmico existente, entre la temperatura medida y la temperatura real dentro de la celda de conductividad del sensor. Esta deficiencia depende de las particularidades del flujo de entrada al sensor, su geometría y, también se ha postulado, del calor acumulado en las capas de aislamiento externo del sensor. Los efectos del retardo térmico se suelen mitigar mediante el control del flujo de entrada al sensor. Esto se obtiene generalmente mediante el bombeo de agua a través del sensor o manteniendo constante y conocida su velocidad. Aunque recientemente se han incorporado sistemas de bombeo en los CTDs a bordo de los planeadores submarinos, todavía existen plataformas equipadas con CTDs sin dichos sistemas. En estos casos, la estimación de la salinidad supone condiciones de flujo de entrada al sensor, razonablemente controladas e imperturbadas. Esta Tesis investiga el impacto, si existe, que la hidrodinámica de los planeadores submarinos pudiera tener en la eficiencia de los sensores CTD. Específicamente, se investiga primero la localización del sensor CTD (externo al fuselaje) relativa a la capa límite desarrollada a lo largo del cuerpo del planeador. Esto se lleva a cabo mediante la utilización de un modelo acoplado de fluido no viscoso con un modelo de capa límite implementado por el autor, así como mediante un programa comercial de dinámica de fluidos computacional (CFD). Los resultados indican, en ambos casos, que el sensor CTD se encuentra fuera de la capa límite, siendo las condiciones del flujo de entrada las mismas que las del flujo sin perturbar. Todavía, la velocidad del flujo de entrada al sensor CTD es la velocidad de la plataforma, la cual depende de su hidrodinámica. Por tal motivo, la investigación se ha extendido para averiguar el efecto que la velocidad de la plataforma tiene en la eficiencia del sensor CTD. Con este propósito, se ha desarrollado un modelo en elementos finitos del comportamiento hidrodinámico y térmico del flujo dentro del CTD. Los resultados numéricos indican que el retardo térmico, atribuidos originalmente a la acumulación de calor en la estructura del sensor, se debe fundamentalmente a la interacción del flujo que atraviesa la celda de conductividad con la geometría interna de la misma. Esta interacción es distinta a distintas velocidades del planeador submarino. Específicamente, a velocidades bajas del planeador (0.2 m/s), la mezcla del flujo entrante con las masas de agua remanentes en el interior de la celda, se ralentiza debido a la generación de remolinos. Se obtienen entonces desviaciones significantes entre la salinidad real y aquella estimada. En cambio, a velocidades más altas del planeador (0.4 m/s) los procesos de mezcla se incrementan debido a la turbulencia e inestabilidades. En consecuencia, la respuesta del sensor CTD es mas rápida y las estimaciones de la salinidad mas precisas que en el caso anterior. Para completar el trabajo, los resultados numéricos se han validado con pruebas experimentales. Específicamente, se ha construido un modelo a escala del sensor CTD para obtener la confirmación experimental de los modelos numéricos. Haciendo uso del principio de similaridad de la dinámica que gobierna los fluidos incompresibles, los experimentos se han realizado con flujos de aire. Esto simplifica significativamente la puesta experimental y facilita su realización en condiciones con medios limitados. Las pruebas experimentales han confirmado cualitativamente los resultados numéricos. Más aun, se sugiere en esta Tesis que la respuesta del sensor CTD mejoraría significativamente añadiendo un generador de turbulencia en localizaciones adecuadas al interno de la celda de conductividad. ABSTRACT Recent technological developments allow the transition of observational oceanography from a ship-based to a networking concept. The latter suggests that the most efficient and effective way to observe the Ocean is through a fleet of spatially distributed autonomous platforms complemented by remote sensing. Due to their maneuverability, autonomy and endurance at sea, underwater gliders are already playing a significant role in this networking observational approach. Underwater gliders were specifically designed to sample vast areas of the Ocean. These are robots with a torpedo shape that make use of their hydrodynamic shape, wings and buoyancy changes to induce horizontal and vertical motions through the water column. A sensor to measure the conductivity, temperature and depth (CTD) is a standard payload of this platform. This is because certain ocean dynamic variables can be derived from temperature, depth and salinity. The latter can be inferred from measurements of temperature and conductivity. Integrating CTD sensors in glider platforms is not exempted of challenges. One of them, concerns to the accuracy of the salinity values derived from the sampled conductivity and temperature. Specifically, salinity estimates are significantly degraded by the thermal lag response existing between the measured temperature and the real temperature inside the conductivity cell of the sensor. This deficiency depends on the particularities of the inflow to the sensor, its geometry and, it has also been hypothesized, on the heat accumulated by the sensor coating layers. The effects of thermal lag are usually mitigated by controlling the inflow conditions through the sensor. Controlling inflow conditions is usually achieved by pumping the water through the sensor or by keeping constant and known its diving speed. Although pumping systems have been recently implemented in CTD sensors on board gliders, there are still platforms with unpumped CTDs. In the latter case, salinity estimates rely on assuming reasonable controlled and unperturbed flow conditions at the CTD sensor. This Thesis investigates the impact, if any, that glider hydrodynamics may have on the performance of onboard CTDs. Specifically, the location of the CTD sensor (external to the hull) relative to the boundary layer developed along the glider fuselage, is first investigated. This is done, initially, by applying a coupled inviscid-boundary layer model developed by the author, and later by using a commercial software for computational fluid dynamics (CFD). Results indicate, in both cases, that the CTD sensor is out of the boundary layer, being its inflow conditions those of the free stream. Still, the inflow speed to the CTD sensor is the speed of the platform, which largely depends on its hydrodynamic setup. For this reason, the research has been further extended to investigate the effect of the platform speed on the performance of the CTD sensor. A finite element model of the hydrodynamic and thermal behavior of the flow inside the CTD sensor, is developed for this purpose. Numerical results suggest that the thermal lag effect is mostly due to the interaction of the flow through the conductivity cell and its geometry. This interaction is different at different speeds of the glider. Specifically, at low glider speeds (0.2 m/s), the mixing of recent and old waters inside the conductivity cell is slowed down by the generation of coherent eddy structures. Significant departures between real and estimated values of the salinity are found. Instead, mixing is enhanced by turbulence and instabilities for high glider speeds (0.4 m/s). As a result, the thermal response of the CTD sensor is faster and the salinity estimates more accurate than for the low speed case. For completeness, numerical results have been validated against model tests. Specifically, a scaled model of the CTD sensor was built to obtain experimental confirmation of the numerical results. Making use of the similarity principle of the dynamics governing incompressible fluids, experiments are carried out with air flows. This significantly simplifies the experimental setup and facilitates its realization in a limited resource condition. Model tests qualitatively confirm the numerical findings. Moreover, it is suggested in this Thesis that the response of the CTD sensor would be significantly improved by adding small turbulators at adequate locations inside the conductivity cell.

La representación de la arquitectura moderna : la villa Stein-de Monzie en "L'Oeuvre Complète" de Le Corbusier y Pierre Jeanneret : influencia de la visión cinematográfica

Esta tesis doctoral trata de investigar cuánto hubo de presencia del cine en el pensamiento de Le Corbusier y Pierre Jeanneret, a la hora de acometer la publicación y maquetación de las páginas dedicadas a la Villa Stein-de Monzie en Garches, en “Le Corbusier et Pierre Jeanneret. Oeuvre Complète 1910-1929”. Qué mecanismos cinematográficos pusieron en juego, cuando montaban las páginas de L´Oeuvre Complète. Más que encontrar elementos cinematográficos utilizados de manera directa; el objetivo de esta tesis es profundizar en los mecanismos, procedimientos, sistemas de generación de ideas a lo largo del proceso de proyecto; en las maneras de percibir y experimentar los espacios, o de observar las formas. El armazón lo compone por lo tanto el análisis del modo en que Le Corbusier representa la villa en L´Oeuvre Complète, sus intenciones y la función pedagógica de este modo de representar; así como sus diferencias con respecto a lo realmente construido. Una realidad elaborada sobre un tablero; maquetando su representación, eligiendo los fragmentos, y componiendo las láminas (cercana a la de un director de cine). La justificación del objeto a estudiar se plantea en el primer capítulo: L´Oeuvre Complète (1937), la reedición en francés, alemán e inglés de la primera edición en alemán, Ihr Gesamtes Werk (1929).Se establecen las intenciones de Le Corbusier de que se convierta en un modelo de Tratado de Arquitectura Moderna, eminentemente visual. Se estudian los mecanismos formales y geométricos de composición del libro, y el modo en el que L´Oeuvre Complète debe ser leída. El desarrollo de los siguientes capítulos (del 2 al 9) recoge el método principal de investigación de esta tesis, basado en una lectura longitudinal, crítica y sistemática, a partir de la observación atenta de la representación de la villa Stein-de Monzie en Garches, en las páginas nº 140 a 149 de L´Oeuvre Complète. Se efectúa mediante un desarrollo lineal y secuenciado, como si de un guión cinematográfico se tratara. Cada capítulo describe y analiza cada uno de los diferentes fragmentos, permitiendo al mismo tiempo enlazar temas de interés que ayudan a comprender aspectos de la villa de Garches, de su concepción en la intensa labor de proyecto (con numerosas variantes y propuestas), e incluso de su aparición en el cine. Además, la tesis arroja luz sobre unos documentos bastante desconocidos: las láminas de la colección del Museo Cooper-Hewitt de nueva York, para la villa de Garches. El análisis de la presentación de la villa de Garches en L´Oeuvre Complète, constata que para Le Corbusier, el fragmento, per se, ha de ser perfecto, produciendo la máxima emoción. Como un prestidigitador, Le Corbusier los manipula, o le niega información al espectador mediante el uso de la elipsis en el relato. Los textos concatenan las imágenes, soportan el hilo de la narración. Los bocetos quieren siempre seducir al espectador: son dibujos que rezuman vitalidad, con una técnica muy cercana a la ligne claire del cómic. Las plantas son un laboratorio para demostrar su jerarquía y su libertad de composición; eliminando elementos, distorsionando la valoración de líneas y apareciendo algún elemento no ejecutado. Los alzados, esquemáticos y abstractos, demuestran el control de la geometría para garantizar la emoción. Las fotografías son controladas en su fase de captura (elección del punto de vista, cuidada puesta en escena de los objetos, composición con la luz, uso de las sombras para la aparición del fuera de campo); pero también en la fase de postproducción y edición, donde son cortadas, alisadas superficies, borrando o dibujando elementos sobre ellas. El montaje compone asimismo una representación dinámica, fragmentada y múltiple de la villa. Como sucede en el cine, los fragmentos sólo encuentran su razón de ser una vez son re-creados y montados en la cabeza del espectador. La falta de raccord es un mecanismo buscado por Le Corbusier, trasladando a la representación una de las primordiales características de la villa de Garches: su permanente dualidad simultánea. Todos estos mecanismos son desplegados por Le Corbusier, para ofrecer una versión idealizada de la villa, que recoja todas las virtudes de los distintos proyectos e incorpore el factor tiempo. ABSTRACT This doctoral thesis tries to investigate how much the cinema affected Le Corbusier and Pierre Jeanneret´s thoughts, at the moment of undertaking the publication and layout of the pages dedicated to the villa Stein-de Monzie in Garches, in the book “Le Corbusier et Pierre Jeanneret. Oeuvre Complète 1910-1929”. Which cinematographic mechanisms they brought into play, when they were mounting those pages. Instead of finding cinematographic elements, used directly; the aim of this thesis is to go deeply into the mechanisms, methods, systems of generation of ideas along the project process; into the ways of seeing and feeling the spaces, or of watching the forms. The body is composed therefore by the analysis of the way in which Le Corbusier represents the villa in L'Oeuvre Complète, his intentions and the pedagogic function of that way of representation; as well as its differences with the real built villa. One reality elaborated on a board; laying out its representation, choosing the fragments, and composing the sheets (near to the work of a director of cinema). The justification of the object to studying appears in the first chapter: L'Oeuvre Complète (1937), the reissue in French, German and English of the first edition in German, Ihr Gesamtes Werk (1929). This chapter shows the intentions of Le Corbusier of turning the book into a model of modern architecture, highly visual. The formal and geometric mechanisms of composition of the book are studied, and the way in which L'Oeuvre Complète must be read. The development of the following chapters (from 2 to 9) gathers the principal method of investigation of this thesis, based on a longitudinal, critical and systematic reading; from the watching of the representation of the villa Stein-de Monzie in Garches, in the pages nr. 140 to 149 of L'Oeuvre Complète. It is carried out by a linear and sequenced development, as a cinematographic script. Every chapter describes and analyzes each of the different fragments, allowing at the same time to connect interesting issues that help to understand aspects of the villa in Garches, of its conception in the intense project process (with numerous variants and designs), and even of its appearance in films. Also, the thesis throws light on some unknown documents: the sheets of the collection of the Museum Cooper-Hewitt in New York, for the villa in Garches. The analysis of the presentation of the villa in Garches in L'Oeuvre Complète, proves that for Le Corbusier, the fragment, itself, has to be perfect, getting the maximum emotion. As a prestidigitator, Le Corbusier manipulates them, or denies information to the spectator by means of the use of the ellipsis in the story. The texts concatenate the images, support the thread of the story. The sketches always attempt to seduce the spectator: they are drawings that leak vitality, with lines very near to the ligne claire of the cómic. The plans are a laboratory to demonstrate their hierarchy and their freedom of composition; deleting elements, distorting the thickness of lines and showing some not executed elements. The elevations, schematic and abstract, shows the control of the geometry to guarantee the emotion in architecture. The pictures are controlled in their instant of capture (choice of the point of view, elegant mise-en-scène of the objects, composition with light, use of the shadows for the appearance of out of vision); but also in the postproduction and edition time, when surfaces are cut, smoothing, erasing or drawing elements in them. The montage composes in the same way a dynamic, fragmented and multiple representation of the villa. As in the films, the fragments only find their raison d'être once they have been re-created and mounted into the mind of the viewer. The continuity error is a mechanism allowed by Le Corbusier, transfering to the representation in the book one of the basic characteristics of the villa in Garches: its constant simultaneous duality. All these methods are displayed by Le Corbusier, to offer an idealized version of the villa, which gathers all the virtues of the different projects, and incorporates the time factor.