Nuevos mecanismos moleculares de tolerancia a sequía y otros tipos de estrés abiótico en especies arbóreas de interés económico

Las masas forestales tienen una importancia colosal para nuestra sociedad y el conjunto de la biosfera. Estudios recientes a escala mundial indican que la sequía es el factor abiótico que más afecta a su crecimiento y supervivencia, seguida por las temperaturas extremas y la salinidad. Aunque comprender los mecanismos con que las especies arbóreas toleran estas formas de estrés tiene un interés aplicado evidente, dichos mecanismos se han estudiado mucho más en especies herbáceas modelo o de interés agronómico. Existen sin embargo diferencias notables entre ellas, como se demuestra en esta tesis y en otros trabajos recientes. Nuestro estudio se centra concretamente en la respuesta molecular del chopo –el sistema modelo forestal más desarrollado– al estrés abiótico, con particular énfasis en la sequía. Utilizando una estrategia proteómica y tratamientos controlados, hemos identificado componentes mayoritarios de dicha respuesta. Su participación en la misma se ha validado mediante análisis transcripcionales detallados utilizando tecnología qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real). Hemos identificado proteínas cuyo nexo funcional con mecanismos de tolerancia ya era conocido, como chaperonas moleculares sHSP o enzimas que atenúan el estrés oxidativo, pero también proteínas cuya relación funcional con el estrés es menos clara o incluso novedosa, como polifenol oxidasas (PPO), deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR), o bicupinas (BIC), entre otras. El cuerpo central de la tesis consiste en la caracterización detallada de una PPO inusual, cuya inducción por estrés hídrico se describe por vez primera. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en plantas, si bien su número es muy variable de unas especies a otras. Algunas, como nogal, tienen un único gen, mientras que Arabidopsis no tiene ninguno. En la última versión del genoma de chopo hemos identificado un total de 12 miembros bona fide, corrigiendo trabajos previos, y hemos caracterizado su expresión individual ante diferentes situaciones de estrés controlado y tratamientos hormonales. La isoforma antedicha es el único miembro de la familia que responde claramente a la deshidratación. También responde a salinidad y a la mayor parte de tratamientos hormonales ensayados, pero no a daño mecánico o tratamientos con metil jasmonato. Esto la diferencia de enzimas homólogas presentes en otras especies de plantas, que se han relacionado experimentalmente con estrés biótico. Los patrones de acumulación de transcritos en árboles adultos son compatibles con un papel protector frente a la sequía. La integración de nuestros estudios funcionales y filogenéticos sugiere que la familia ha sufrido un proceso reciente de diversificación y neofuncionalización, siendo la protección frente a deshidratación su papel primigenio. Aunque se conoce la actividad bioquímica in vitro de este tipo de enzimas, sus sustratos naturales son esencialmente una incógnita. Mediante expresión heteróloga en Escherichia coli BL21(DE3) hemos detectado que la enzima de chopo es capaz de oxidar L-DOPA a dopaquinona, siendo menos activa frente a otros sustratos. Por otra parte, hemos demostrado su localización cloroplástica mediante transformación transitoria de protoplastos con fusiones a la proteína fluorescente YFP. Mediante la obtención de plantas transgénicas de A. thaliana hemos demostrado que la enzima de chopo aumenta considerablemente la tolerancia in vivo frente a la deshidratación y al estrés salino. El análisis fenotípico detallado de las líneas transgénicas, combinando múltiples metodologías, nos ha permitido sustanciar que la tolerancia tiene una base compleja. Esta incluye una mayor protección del sistema fotosintético, una capacidad antioxidante muy incrementada y la acumulación de solutos osmoprotectores como la prolina. Los análisis metabolómicos nos han permitido asociar la expresión de la proteína a la síntesis de un flavano no descrito previamente en A. thaliana, vinculando la enzima de chopo con la síntesis de fenilpropanoides. También hemos observado alteraciones en los niveles hormonales que podrían subyacer a efectos pleiotrópicos con interés aplicado, como un aumento consistente del tamaño de la planta o el acortamiento del ciclo de crecimiento. Además de aportar datos novedosos sobre la funcionalidad in vivo de esta familia de oxidasas, los resultados de esta tesis demuestran que los árboles son sistemas de estudio interesantes para caracterizar nuevas estrategias de tolerancia al estrés abiótico con potencial aplicado. ABSTRACT Forests masses have an extraordinary importance for our society and the biosphere. Recent worldwide studies indicate that drought is the abiotic factor that affects more their growing and survival, followed by extreme temperatures and salinity. The understanding of how the arboreal species tolerate the stress has an evident practical interest, but their mechanisms have been studied much more in herbaceous species or with agronomic interest. However, considerable differences exist between them, as this thesis and recent studies show. Our study is focused on the molecular response of the poplar –the more developed forestry model system- to abiotic stress, specifically focused in the drought. Using a proteomic strategy and controlled treatments, we have identified main components in such response. Its participation has been validated through transcriptional analysis using qRT-PCR technology. We have identified proteins whose functional connection with tolerance mechanisms were already known, as molecular chaperones sHSP or enzymes that attenuate the oxidative stress, but also some proteins whose functional relationship with the stress is less clear or even novel, as polifenol oxidases (PPO), short chain deshidrogenases/reductases (SDR), or bicupines (BIC), among others. The central body of the thesis consists of the detailed characterization of an unsual PPO, whose induction due to drought stress is first described. These enzymes are thoroughly distributed in plants, but their number of members is very variable among species. Some of them, as the walnut tree, have a single gene, while Arabidopsis has none. We have identified a total of 12 members in the last version of the poplar genome, correcting previous works, and have characterized their individual expression against different situations of controlled stress and hormone treatments. The aforementioned isoform is the only member of the family that responds clearly to the drought. It also reacts to salinity and the majority of hormonal treatments tested, but it does not respond to mechanical damage or treatments with methyl jasmonate. This is the difference with homologue enzymes present in other plant species, which have been related experimentally with abiotic stress. The accumulation patterns of transcripts in adult trees are compatible with a protector role against drought. The integration of our functional and phylogenetic studies suggests that the family has suffered a recent process of diversification and neofunctionalization, being the protection against drought their original role. Although the in vitro biochemistry activity of this kind of enzymes is already known, their natural substracts are essentially a mystery. By means of heterologous expression of Escherichia coli BL21(DE3) we have detected that the enzyme of poplar is able to oxidize L-DOPA to dopaquinone, being less active against other substrates. Additionally, we have proven its chloroplastic location with transitory transformation of protoplasts with YFP protein fusion. By means of getting transgenic plants of A. thaliana, we have demonstrated that the poplar enzyme increases notably the in vivo tolerance against the drought and salinity stresses. The phenotypic analysis of the transgenic lines, and the use of multiple methodologies, allowed us to test the complexity of the tolerance. This includes a major protection of the photosynthetic system, a very increased antioxidant capacity and the accumulation of osmoprotectant solutes as the proline. The metabolic analysis has allowed to associate the protein expression with the synthesis of a Flavan non described previously in A. thalaiana, linking the enzyme of poplar with the synthesis of phenylpropanoids. We have observed alterations in the hormonal levels that could underlie pleiotropic effects with applied interest, as a consistent increase of the size of the plant and the reduction of the growth cycle. The results of this thesis, in addition to provide novel data about the in vivo functionality of the oxidase family, demonstrate that the trees are interesting systems of study to characterize new strategies of tolerance against abiotic stress with applied potential.

Exploración y evaluación de mecanismos para la captura de la posición y postura de personas en entornos reales

El presente trabajo consiste en el estudio de la viabilidad en el uso de tres posibles opciones orientadas a la captura de la posición y la postura de personas en entornos reales, así como el diseño e implementación de un prototipo de captura en cada uno de ellos. También se incluye una comparativa con el fin de destacar los pros y los contras de cada solución. Una de las alternativas para llevarlo a cabo consiste en un sistema de tracking óptico por infrarrojos de alta calidad y precisión, como es Optitrack; la segunda se basa en una solución de bajo coste como es el periférico Kinect de Microsoft y la tercera consiste en la combinación de ambos dispositivos para encontrar un equilibrio entre precisión y economía, tomando los puntos fuertes de cada uno para contrarrestar sus debilidades. Uno de los puntos importantes del trabajo es que el uso de los prototipos de captura está orientado a entornos de trabajo reales (en concreto en la captura de los movimientos del personal que trabaja en un quirófano), así que han sido necesarias pruebas para minimizar el efecto de las fuentes de luz en los sistemas de infrarrojos, el estudio de los dispositivos para determinar el número de personas que son capaces de capturar a la vez sin que esto afecte a su rendimiento y el nivel de invasión de los dispositivos en los trabajadores (marcadores para el tracking), además de los mecanismos apropiados para minimizar el impacto de las oclusiones utilizando métodos de interpolación y ayudándose del conocimiento del contexto, las restricciones de movimiento del cuerpo humano y la evolución en el tiempo. Se han desarrollado conocimientos en el funcionamiento y configuración dispositivos como el sistema de captura Optitrack de Natural Point y el sistema de detección de movimiento Kinect desarrollado por Microsoft. También se ha aprendido el funcionamiento del entorno de desarrollo y motor de videojuegos multiplataforma homónimos Unity y del lenguaje de programación C# que utiliza dicho entorno para sus scripts de control, así como los protocolos de comunicación entre los distintos sistemas que componen los prototipos como son VRPN y NatNet.---ABSTRACT---This project is about a viability study in the use of three possible options, oriented towards the capture of the position and view of people in a real environment, as well as the design and implementation of a capturing prototype in each of them. A comparative study is also included, in order to emphasise the pros and cons of each solution. One of the alternatives consists of an optical tracking system via high quality and precision infrareds, like Optitrack; the second is based on a low cost solution, such as Microsoft’s Kinect peripheral, and the third consists on a combination of both devices to find a balance between precision and price, taking the strong points of each of the mechanisms to make up for the weaknesses. One of the important parts of this project is that the use of the capturing prototypes is directed towards real life work situations (specifically towards the capturing of the movements of surgery personnel), so various tests have been necessary in order to minimize the effect of light sources in infrared systems, the study of the devices to determine the number of people that they are capable of capturing simultaneously without affecting their performance and the invasion level of the devices towards the workers (tracking markers), as well as the mechanisms adopted to minimize the impact of the occlusions using interpolation methods and with help of the knowledge of the surroundings, the human movement restrictions and the passing of time. Knowledge has been developed on the functioning and configuration of the devices such as Natural Point’s Optitrak capturing system, and the Kinect movement detection system developed by Microsoft. We have also learned about the operating of the development and incentive environment of multiplatform videogames of namesake Unity and of C# programming language, which uses said environment for its control scripts, as well as communication protocols between the different systems that make up prototypes like VRPN and NatNet.