Native bradyrhizobial symbionts of Lupinus mariae-josephae, a unique endemism thriving in alkaline soils in Eastern Spain

Lupinus mariae-josephae (Lmj) es una especie de lupino endémica de una pequeña y específica área de Comunidad Valenciana (Este de España), donde prospera en suelos alcalinoscalcáreos, un hábitat singular para los altramuces, que crecen preferentemente en suelos ácidos o neutros. Esto hace de Lmj una especie de lupino única. Cuando se inició este trabajo, la extensión conocida de este endemismo abarcaba unos 700 kilómetros cuadrados, confinados en la provincia de Valencia. En esta área, Lmj prospera en pequeñas poblaciones aisladas que contienen un número reducido de plantas por lo que se la consideró una especie en peligro de extinción. Todos los esfuerzos, utilizando estrategias clásicas dirigidas a ampliar el área de crecimiento de Lmj y garantizar su conservación, han tenido un éxito limitado. El trabajo que se presenta está dirigido a mejorar el conocimiento de la ecología de Lmj, en particular la interacción simbiótica que establece con bacterias del suelo denominadas rizobios y se centra en la caracterización fenotípica, filogenética y genómica de esos rizobios. También se investiga la posible contribución de la simbiosis en mejorar la conservación de Lmj. Para este fin, se han estudiado diferentes aspectos que se describen a continuación. El primero objetivo se centró en aislar y estudiar de la diversidad genética de las bacterias endosimbióticas de Lmj. . Se realizó un análisis filogenético de genes esenciales que mostró que las cepas de Lmj pertenecen al género Bradyrhizobium y que presentan una gran diversidad con características fenotípicas y simbióticas diferentes de cepas de Bradyrhizobium que nodulan otras especies de lupinos nativos de España (cepas ISLU). Las cepas estudiadas se dividieron en dos grupos (Clado I y Clado II). El Clado I, incluye a las cepas Lmj, definiendo un nuevo linaje, filogenéticamente relacionado con otras especies de Bradyrhizobium, como B. jicamae y B. elkanii. El Clado II contiene cepas ISLU relacionadas con cepas de B. canariense y B. japonicum que establecen simbiosis con lupinos de suelos ácidos. Otro análisis filogenético basado en genes simbióticos, distribuyó las cepas de Lmj en sólo dos grupos diferentes. La singularidad y gran diversidad de estas cepas en una pequeña área geográfica, hacen de este, un atractivo sistema para el estudio de la evolución y adaptación de las bacterias simbióticas a su respectiva planta huésped. Adicionalmente, se estudio la presencia de bacterias capaces de nodular Lmj en suelos básicos de Chiapas, México. Sorprendentemente, estos suelos contienen bacterias capaces establecer interacciones simbióticas eficientes con Lmj en ensayos de invernadero. A continuación se investigó la taxonomía de los endosimbiontes de Lmj analizando la secuencia de cuatro genes esenciales (16S rRNA, recA, glnII y atpD) y el promedio de identidad de nucleótidos de genomas completos de algunas cepas representativas de la diversidad (ANIm). Se identificaron nuevas especies de Bradyrhizobium dentro del Clado I y se definió una de ellas: 'Bradyrhizobium valentinum' sp. nov (cepa tipo LmjM3T = CECT 8364T, LMG 2761T). También se abordó cómo conservar Lmj en su hábitat natural mediante inoculación con alguna de las cepas aisladas. Se demostró la ausencia de bacterias capaces de nodular Lmj en suelos rojos alcalinos o ‘‘terra rossa’’ de la Península Ibérica y Baleares. Dos cepas, altamente eficientes en cuanto a la fijación de nitrógeno, LmjC y LmjM3T, fueron seleccionadas para ser empleadas como inoculantes. Dos experimentos de campo llevados a cabo en años consecutivos en áreas con características edafoclimáticas similares a las que presentan las poblaciones de Lmj, lograron la reproducción exitosa de la planta. Se concluyó que un ciclo reproductivo exitoso de Lmj es absolutamente dependiente de la inoculación con sus simbiontes naturales y que la simbiosis debe ser considerada un factor esencial en estrategias de conservación de leguminosas en peligro. La obtención de varias secuencias genómicas de cepas aisladas de Lmj y de otras cepas de Bradyrhizobium reveló una alta similitud entre los genomas de las cepas del Clado I, y permitió la identificación de cinco posibles nuevas especies. Además, se estudiaron tres agrupaciones de genes relacionados con la simbiosis (nod, nif y fix) definiendo un nuevo linaje para las cepas de Lmj, diferente del symbiovar “genistearum” de B. canariense y B. japonicum. La baja diversidad encontrada en el análisis filogenético de los genes simbióticos contrasta con la gran diversidad asociada a genes esenciales. La presencia de plásmidos en cepas del género Bradyrhizobium ha sido descrita en muy pocas ocasiones, sin embargo el análisis de la secuencia genómica de la cepa ISLU101, aislada de Lupinus angustifolius, reveló la presencia de un origen de replicación extracromosómico homólogo al operón repABC, presente en el plásmido de Bradyrhizobium sp BTAi1. Gracias a esta secuencia se identificaron genes homólogos en 19 de 72 cepas ISLU. Filogenéticamente, las secuencias de repABC se agruparon en un grupo monofilético con las de pBTAi1 y separadas de los rizobios de crecimiento rápido. Finalmente, se identificaron sistemas de secreción de proteínas de tipo III (T3SS) en nueve genomas de cepas de Lmj. Los T3SS pueden inyectar proteínas efectoras al interior de células vegetales. Su presencia en rizobios se ha relacionado con la gama de hospedador que pueden nodular y puede tener un efecto beneficioso, neutro o perjudicial en la simbiosis. Los T3SS de las cepas de Lmj codifican para una proteína efectora similar a NopE, un efector dependiente de T3SS descrito en B. diazoefficiens USDA 110T. La proteína NopE de la cepa LmjC se ha caracterizado bioquímicamente. ABSTRACT Lupinus mariae-josephae (Lmj) is a lupine species endemic of a unique small area in Valencia region (Eastern Spain) where the lupine plants thrive in alkaline-limed soils, which preferentially grow in acid or neutral soils. This is the type of soils native lupines of Spain. When this work was initiated, the extension of the endemic area of Lmj was of about 700 squared kilometers confined to the Valencia province. In this area, Lmj thrives in small, isolated patches containing a reduced number of plants, and points to an endemism that can easily became endangered or extinct. Consequently, the Valencia Community authorities gave a ‘‘microreserve” status for conservation of the species. All efforts, using classical strategies directed to extend the area of Lmj growth and ensure its conservation have been so far unsuccessful. The work presented here is directed to improve our knowledge of Lmj ecology and it is centered in the characterization of the rhizobial symbiosis by phenotypic, phylogenetic and genomic analysis as well as in investigate the potential contribution of the symbiosis to improve its conservation. To this end, five different topics have been studied, and results are briefly described here. Extensive details can be followed en the attached, published articles. The first topic deals with the indigenous rhizobial symbionts of the Lmj endemism, and its genetic diversity was investigated. The Lmj root symbionts belong to the Bradyrhizobium genus, and phylogenetic analysis based on core genes identified a large diversity of Bradyrhizobium strains with phenotypic and symbiotic characteristics different from rhizobia nodulating other Lupinus spp. native of Spain. The strains were split in two clades. Clade II contained strains close to classical B. canariense and B. japonicum lineages that establish symbioses with lupines in acid soils of the Mediterranean area. Clade I included Lmj strains that define a new lineage, close to other Bradyrhizobium species as B. jicamae and B. elkanii. The phylogenetic analysis based on symbiotic genes identified only two distinct clusters. The singularity and large diversity of these strains in such a small geographical area makes this an attractive system for studying the evolution and adaptation of the rhizobial symbiont to the plant host. Additionally, the presence of bacteria able to nodulate Lmj in basic soils from Chiapas, Mexico was investigated. Surprisingly, these soils contain bacteria able to effectively nodulate and fix nitrogen with Lmj plants in greenhouse assays. In the second topic, the taxonomic status of the endosymbiotic bacteria of Lmj from Valencia endemism and Chiapas was investigated. Results from phylogenetic analysis of core genes and Average Nucleotide Identity (ANIm) using draft genomic sequences identified new Bradyrhizobium species within strains of Clade I of Lmj endosymbiotic bacteria. Only one of these potentially new species has been defined, meanwhile the others are under process of characterization. The name ‘Bradyrhizobium valentinum’ sp. nov. was proposed for the defined species (type strain LmjM3T= CECT 8364T, LMG 2761T). The third topic was directed to conservation of endangered Lmj in its natural habitat. The relevant conclusion of this experimentation is that the symbiosis should be considered as a relevant factor in the conservation strategies for endangered legumes. First, we showed absence of bacteria able to nodulate Lmj in all the inspected ‘‘terra rossa’’ or alkaline red soils of the Iberian Peninsula and Balearic Islands. Then, two efficient nitrogen fixing strains with Lmj plants, LmjC and LmjM3T, were selected as inoculum for seed coating. Two planting experiments were carried out in consecutive years under natural conditions in areas with edapho-climatic characteristics identical to those sustaining natural Lmj populations, and successful reproduction of the plant was achieved. The relevant conclusion from these assays was that the successful reproductive cycle was absolutely dependent on seedling inoculation with effective bradyrhizobia The forth topic deep into the analysis of the genomic of Lmj representative strains. To this end, draft genomic sequences of selected Lmj strains and type strains of Bradyrhizobium spp. were assembled. The comparison analysis of the draft genomic sequences of Lmj strains and related Bradyrhizobium species grouped in Clade I, revealed a high genomic homology among them, and allowed the definition of five potentially new species of Lmj nodulating bacteria. Also, based on the available draft genomic sequences, only three clusters of nod, fix and nif genes from Lmj strains were identified and showed to define a new symbiotic lineage, distant from that of B. canariense and B. japonicum bv. genistearum. The low diversity exhibited by the phylogenetic analysis of symbiotic genes contrast with the large diversity of strains as regards the housekeeping genes analyzed. Besides, the genomic analysis of a Lupinus angustifolius strain ISLU101, revealed the presence of an extrachromosomal replication origin homologous to repABC cluster from plasmid present in Bradyrhizobium spp BTAi1. This repABC cluster gene sequence allowed the identification of extrachromosomic replication origin in 19 out of 72 Bradyrhizobium strains from Lupinus spp., a highly significant result since the absence of plasmids in the Bradyrhizobium genus was traditionally assumed. The repABC gene sequences of these strains grouped them in a unique monophyletic group, related to B. sp. BTAi1 plasmid, but differentiated from the repABC gene cluster of plasmids in fast growing rhizobium strains. The last topic was focused on characterization of type III secreted effectors present in Lmj endosymbiotic bacteria. Type III secretion systems (T3SS) are specialized protein export machineries which can deliver effector proteins into plant cells. The presence of T3SS in rhizobia has frequently been related to the symbiotic nodulation host-range and may have a beneficial or detrimental effect on the symbiosis with legumes. In this context, the presence of T3SS in genomes of nine Lmj strains was investigated, and it was shown the presence of clusters encoding NopE type III-secreted protein similar to the NopE1 and NopE2 of B. diazoefficiens USDA 110T. The putative NopE protein of LmjC strain is at present being characterized regarding its structure and function.

Modelo para la integración del trazado de infraestructuras lineales en el paisaje y el medio ambiente basado en SIG

El análisis de las diferentes alternativas en la planificación y diseño de corredores y trazados de carreteras debe basarse en la correcta definición de variables territoriales que sirvan como criterios para la toma de decisión y esto requiere un análisis ambiental preliminar de esas variables de calidad. En España, los estudios de viabilidad de nuevas carreteras y autovías están asociados a una fase del proceso de decisión que se corresponde con el denominado Estudio Informativo, el cual establece condicionantes físicos, ambientales, de uso del suelo y culturales que deben ser considerados en las primeras fases de la definición del trazado de un corredor de carretera. Así, la metodología más frecuente es establecer diferentes niveles de capacidad de acogida del territorio en el área de estudio con el fin de resumir las variables territoriales en mapas temáticos y facilitar el proceso de trazado de las alternativas de corredores de carretera. El paisaje es un factor limitante a tener en cuenta en la planificación y diseño de carreteras y, por tanto, deben buscarse trazados más sostenibles en relación con criterios estéticos y ecológicos del mismo. Pero este factor no es frecuentemente analizado en los Estudios Informativos e incluso, si es considerado, los estudios específicos de la calidad del paisaje (estético y ecológico) y de las formas del terreno no incorporan las recomendaciones de las guías de trazado para evitar o reducir los impactos en el paisaje. Además, los mapas de paisaje que se generan en este tipo de estudios no se corresponden con la escala de desarrollo del Estudio Informativo (1:5.000). Otro déficit común en planificación de corredores y trazados de carreteras es que no se tiene en cuenta la conectividad del paisaje durante el proceso de diseño de la carretera para prevenir la afección a los corredores de fauna existentes en el paisaje. Este déficit puede originar un posterior efecto barrera en los movimientos dispersivos de la fauna y la fragmentación de sus hábitats debido a la ocupación parcial o total de las teselas de hábitats con importancia biológica para la fauna (o hábitats focales) y a la interrupción de los corredores de fauna que concentran esos movimientos dispersivos de la fauna entre teselas. El objetivo principal de esta tesis es mejorar el estudio del paisaje para prevenir su afección durante el proceso de trazado de carreteras, facilitar la conservación de los corredores de fauna (o pasillos verdes) y la localización de medidas preventivas y correctoras en términos de selección y cuantificación de factores de idoneidad a fin de reducir los impactos visuales y ecológicos en el paisaje a escala local. Concretamente, la incorporación de valores cuantitativos y bien justificados en el proceso de decisión permite incrementar la transparencia en el proceso de diseño de corredores y trazados de carreteras. Con este fin, se han planteado cuatro preguntas específicas en esta investigación (1) ¿Cómo se seleccionan y evalúan los factores territoriales limitantes para localizar una nueva carretera por los profesionales españoles de planificación del territorio en relación con el paisaje? (2) ¿Cómo pueden ser definidos los corredores de fauna a partir de factores del paisaje que influyen en los movimientos dispersivos de la fauna? (3) ¿Cómo pueden delimitarse y evaluarse los corredores de fauna incluyendo el comportamiento parcialmente errático en los movimientos dispersivos de la fauna y el efecto barrera de los elementos antrópicos a una escala local? (4) ¿Qué y cómo las recomendaciones de diseño de carreteras relacionadas con el paisaje y las formas del terreno pueden ser incluidas en un modelo de Sistemas de Información Geográfica (SIG) para ayudar a los ingenieros civiles durante el proceso de diseño de un trazado de carreteras bajo el punto de vista de la sostenibilidad?. Esta tesis doctoral propone nuevas metodologías que mejoran el análisis visual y ecológico del paisaje utilizando indicadores y modelos SIG para obtener alternativas de trazado que produzcan un menor impacto en el paisaje. Estas metodologías fueron probadas en un paisaje heterogéneo con una alta tasa de densidad de corzo (Capreolus capreolus L.), uno de los grandes mamíferos más atropellados en la red de carreteras españolas, y donde está planificada la construcción de una nueva autovía que atravesará la mitad del área de distribución del corzo. Inicialmente, se han analizado las variables utilizadas en 22 estudios de proyectos de planificación de corredores de carreteras promovidos por el Ministerio de Fomento entre 2006 y 2008. Estas variables se agruparon según condicionantes físicos, ambientales, de usos del suelo y culturales con el fin de comparar los valores asignados de capacidad de acogida del territorio a cada variable en los diferentes estudios revisados. Posteriormente, y como etapa previa de un análisis de conectividad, se construyó un mapa de resistencia de los movimientos dispersivos del corzo en base a la literatura y al juicio de expertos. Usando esta investigación como base, se le asignó un valor de resistencia a cada factor seleccionado para construir la matriz de resistencia, ponderándolo y combinándolo con el resto de factores usando el proceso analítico jerárquico y los operadores de lógica difusa como métodos de análisis multicriterio. Posteriormente, se diseñó una metodología SIG para delimitar claramente la extensión física de los corredores de fauna de acuerdo a un valor umbral de ancho geométrico mínimo, así como la existencia de múltiples potenciales conexiones entre cada par de teselas de hábitats presentes en el paisaje estudiado. Finalmente, se realizó un procesado de datos Light Detection and Ranging (LiDAR) y un modelo SIG para calcular la calidad del paisaje (estético y ecológico), las formas del terreno que presentan características similares para trazar una carretera y la acumulación de vistas de potenciales conductores y observadores de los alrededores de la nueva vía. Las principales contribuciones de esta investigación al conocimiento científico existente en el campo de la evaluación del impacto ambiental en relación al diseño de corredores y trazados de carreteras son cuatro. Primero, el análisis realizado de 22 Estudios Informativos de planificación de carreteras reveló que los métodos aplicados por los profesionales para la evaluación de la capacidad de acogida del territorio no fue suficientemente estandarizada, ya que había una falta de uniformidad en el uso de fuentes cartográficas y en las metodologías de evaluación de la capacidad de acogida del territorio, especialmente en el análisis de la calidad del paisaje estético y ecológico. Segundo, el análisis realizado en esta tesis destaca la importancia de los métodos multicriterio para estructurar, combinar y validar factores que limitan los movimientos dispersivos de la fauna en el análisis de conectividad. Tercero, los modelos SIG desarrollados Generador de alternativas de corredores o Generator of Alternative Corridors (GAC) y Eliminador de Corredores Estrechos o Narrow Corridor Eraser (NCE) pueden ser aplicados sistemáticamente y sobre una base científica en análisis de conectividad como una mejora de las herramientas existentes para la comprensión el paisaje como una red compuesta por nodos y enlaces interconectados. Así, ejecutando los modelos GAC y NCE de forma iterativa, pueden obtenerse corredores alternativos con similar probabilidad de ser utilizados por la fauna y sin que éstos presenten cuellos de botella. Cuarto, el caso de estudio llevado a cabo de prediseño de corredores y trazado de una nueva autovía ha sido novedoso incluyendo una clasificación semisupervisada de las formas del terreno, filtrando una nube de puntos LiDAR e incluyendo la nueva geometría 3D de la carretera en el Modelo Digital de Superficie (MDS). El uso combinado del procesamiento de datos LiDAR y de índices y clasificaciones geomorfológicas puede ayudar a los responsables encargados en la toma de decisiones a evaluar qué alternativas de trazado causan el menor impacto en el paisaje, proporciona una visión global de los juicios de valor más aplicados y, en conclusión, define qué medidas de integración paisajística correctoras deben aplicarse y dónde. ABSTRACT The assessment of different alternatives in road-corridor planning and layout design must be based on a number of well-defined territorial variables that serve as decision-making criteria, and this requires a high-quality preliminary environmental analysis of those quality variables. In Spain, feasibility studies for new roads and motorways are associated to a phase of the decision procedure which corresponds with the one known as the Informative Study, which establishes the physical, environmental, land-use and cultural constraints to be considered in the early stages of defining road corridor layouts. The most common methodology is to establish different levels of Territorial Carrying Capacity (TCC) in the study area in order to summarize the territorial variables on thematic maps and facilitate the tracing process of road-corridor layout alternatives. Landscape is a constraint factor that must be considered in road planning and design, and the most sustainable layouts should be sought based on aesthetic and ecological criteria. However this factor is not often analyzed in Informative Studies and even if it is, baseline studies on landscape quality (aesthetic and ecological) and landforms do not usually include the recommendations of road tracing guides designed to avoid or reduce impacts on the landscape. The resolution of the landscape maps produced in this type of studies does not comply with the recommended road design scale (1:5,000) in the regulations for the Informative Study procedure. Another common shortcoming in road planning is that landscape ecological connectivity is not considered during road design in order to avoid affecting wildlife corridors in the landscape. In the prior road planning stage, this issue could lead to a major barrier effect for fauna dispersal movements and to the fragmentation of their habitat due to the partial or total occupation of habitat patches of biological importance for the fauna (or focal habitats), and the interruption of wildlife corridors that concentrate fauna dispersal movements between patches. The main goal of this dissertation is to improve the study of the landscape and prevent negative effects during the road tracing process, and facilitate the preservation of wildlife corridors (or green ways) and the location of preventive and corrective measures by selecting and quantifying suitability factors to reduce visual and ecological landscape impacts at a local scale. Specifically the incorporation of quantitative and well-supported values in the decision-making process provides increased transparency in the road corridors and layouts design process. Four specific questions were raised in this research: (1) How are territorial constraints selected and evaluated in terms of landscape by Spanish land-planning practitioners before locating a new road? (2) How can wildlife corridors be defined based on the landscape factors influencing the dispersal movements of fauna? (3) How can wildlife corridors be delimited and assessed to include the partially erratic movements of fauna and the barrier effect of the anthropic elements at a local scale? (4) How recommendations of road design related to landscape and landforms can be included in a Geographic Information System (GIS) model to aid civil engineers during the road layout design process and support sustainable development? This doctoral thesis proposes new methodologies that improve the assessment of the visual and ecological landscape character using indicators and GIS models to obtain road layout alternatives with a lower impact on the landscape. These methodologies were tested on a case study of a heterogeneous landscape with a high density of roe deer (Capreolus capreolus L.) –one of the large mammals most commonly hit by vehicles on the Spanish road network– and where a new motorway is planned to pass through the middle of their distribution area. We explored the variables used in 22 road-corridor planning projects sponsored by the Ministry of Public Works between 2006 and 2008. These variables were grouped into physical, environmental, land-use and cultural constraints for the purpose of comparing the TCC values assigned to each variable in the various studies reviewed. As a prior stage in a connectivity analysis, a map of resistance to roe deer dispersal movements was created based on the literature and experts judgment. Using this research as a base, each factor selected to build the matrix was assigned a resistance value and weighted and combined with the rest of the factors using the analytic hierarchy process (AHP) and fuzzy logic operators as multicriteria assessment (MCA) methods. A GIS methodology was designed to clearly delimit the physical area of wildlife corridors according to a geometric threshold width value, and the multiple potential connections between each pair of habitat patches in the landscape. A Digital Surface Model Light Detection and Ranging (LiDAR) dataset processing and a GIS model was performed to determine landscape quality (aesthetic and ecological) and landforms with similar characteristics for the road layout, and the cumulative viewshed of potential drivers and observers in the area surrounding the new motorway. The main contributions of this research to current scientific knowledge in the field of environmental impact assessment for road corridors and layouts design are four. First, the analysis of 22 Informative Studies on road planning revealed that the methods applied by practitioners for assessing the TCC were not sufficiently standardized due to the lack of uniformity in the cartographic information sources and the TCC valuation methodologies, especially in the analysis of the aesthetic and ecological quality of the landscape. Second, the analysis in this dissertation highlights the importance of multicriteria methods to structure, combine and validate factors that constrain wildlife dispersal movements in the connectivity analysis. Third, the “Generator of Alternative Corridors (GAC)” and “Narrow Corridor Eraser (NCE)” GIS models developed can be applied systematically and on a scientific basis in connectivity analyses to improve existing tools and understand landscape as a network composed of interconnected nodes and links. Thus, alternative corridors with similar probability of use by fauna and without bottlenecks can be obtained by iteratively running GAC and NCE models. Fourth, our case study of new motorway corridors and layouts design innovatively included semi-supervised classification of landforms, filtering of LiDAR point clouds and new 3D road geometry on the Digital Surface Model (DSM). The combined used of LiDAR data processing and geomorphological indices and classifications can help decision-makers assess which road layouts produce lower impacts on the landscape, provide an overall insight into the most commonly applied value judgments, and in conclusion, define which corrective measures should be applied in terms of landscaping, and where.

Patrones y procesos espaciales en poblaciones y comunidades vegetales: nuevas herramientas e hipótesis

Generalmente los patrones espaciales de puntos en ecología, se definen en el espacio bi-dimensional, donde cada punto representado por el par ordenado (x,y), resume la ubicación espacial de una planta. La importancia de los patrones espaciales de plantas radica en que proceden como respuesta ante importantes procesos ecológicos asociados a la estructura de una población o comunidad. Tales procesos incluyen fenómenos como la dispersión de semillas, la competencia por recursos, la facilitación, respuesta de las plantas ante algún tipo de estrés, entre otros. En esta tesis se evalúan los factores y potenciales procesos subyacentes, que explican los patrones de distribución espacial de la biodiversidad vegetal en diferentes ecosistemas como bosque mediterráneo, bosque tropical y matorral seco tropical; haciendo uso de nuevas metodologías para comprobar hipótesis relacionadas a los procesos espaciales. En este trabajo se utilizaron dos niveles ecológicos para analizar los procesos espaciales, el nivel de población y el nivel de comunidad, con el fin de evaluar la importancia relativa de las interacciones intraespecíficas e interespecíficas. Me centré en el uso de funciones estadísticas que resumen los patrones de puntos para explorar y hacer inferencias a partir de datos espaciales, empezando con la construcción de un nuevo modelo nulo para inferir variantes del síndrome de dispersión de una planta parásita en España central. Se analizó la dependencia de los patrones espaciales tanto de los hospedantes afectados como de los no-afectados y se observó fuerte dependencia a pequeña y mediana distancia. Se utilizaron dos funciones (kernel) para simular la dispersión de la especie parásita y se identificó consistencia de estos modelos con otros síndromes de dispersión adicionalmente a la autodispersión. Un segundo tema consistió en desarrollar un método ANOVA de dos vías? para patrones de puntos replicados donde el interés se concentró en evaluar la interacción de dos factores. Este método se aplicó a un caso de estudio que consitió en analizar la influencia de la topografía y la altitud sobre el patrón espacial de un arbusto dominante en matorral seco al sur del Ecuador, cuyos datos provienen de patrones de puntos replicados basados en diseño. Partiendo de una metodología desarrollada para procesos uni-factoriales, se construyó el método para procesos bi-factoriales y así poder evaluar el efecto de interacción. Se observó que la topografía por sí sola así como la interacción con la altitud presentaron efecto significativo sobre la formación del patrón espacial. Un tercer tema fue identificar la relación entre el patrón espacial y el síndrome de dispersión de la comunidad vegetal en el bosque tropical de la Isla de Barro Colorado (BCI), Panamá. Muchos estudios se han desarrollado en este bosque tropical y algunos han analizado la relación síndrome-patrón espacial, sin embargo lo novedoso de nuestro estudio es que se evaluaron un conjunto amplio de modelos (114 modelos) basados en procesos que incorporan la limitación de la dispersión y la heterogeneidad ambiental, y evalúan el efecto único y el efecto conjunto, para posteriormente seleccionar el modelo de mejor ajuste para cada especie. Más de la mitad de las especies presentaron patrón espacial consistente con el efecto conjutno de la limitación de la dispersión y heterogeneidad ambiental y el porcentaje restante de especies reveló en forma equitativa el efecto único de la heterogeneidad ambiental y efecto único de limitación de la dispersión. Finalmente, con la misma información del bosque tropical de BCI, y para entender las relaciones que subyacen para mantener el equilibrio de la biodiversidad, se desarrolló un índice de dispersión funcional local a nivel de individuo, que permita relacionar el patrón espacial con cuatro rasgos funcionales clave de las especies. Pese a que muchos estudios realizados involucran esta comunidad con la teoría neutral, se encontró que el ensamble de la comunidad de BCI está afectado por limitaciones de similaridad y de hábitat a diferentes escalas. ABSTRACT Overall the spatial point patterns in ecology are defined in two-dimensional space, where each point denoted by the (x,y) ordered pair, summarizes the spatial location of a plant. The spatial point patterns are essential because they arise in response to important ecological processes, associated with the structure of a population or community. Such processes include phenomena as seed dispersal, competition for resources, facilitation, and plant response to some type of stress, among others. In this thesis, some factors and potential underlying processes were evaluated in order to explain the spatial distribution patterns of plant biodiversity. It was done in different ecosystems such as Mediterranean forest, tropical forest and dry scrubland. For this purpose new methodologies were used to test hypothesis related to spatial processes. Two ecological levels were used to analyze the spatial processes, at population and community levels, in order to assess the relative importance of intraspecific and interspecific interactions. I focused on the use of spatial statistical functions to summarize point patterns to explore and make inferences from spatial data, starting with the construction of a new null model to infer variations about the dispersal syndrome of a parasitic plant in central Spain. Spatial dependence between point patterns in a multivariate point process of affected and unaffected hosts were analyzed and strong dependence was observed at small and medium distance. Two kernel functions were used to simulate the dispersion of parasitic plant and consistency of these models with other syndromes was identified, in addition to ballistic dispersion. A second issue was to analyze altitude and topography effects on the spatial population structure of a dominant shrub in the dry ecosystem in southern Ecuador, whose data come from replicated point patterns design-based. Based on a methodology developed for uni-factorial process, a method for bi-factorial processes was built to assess the interaction effect. The topography alone and interacting with altitude showed significant effect on the spatial pattern of shrub. A third issue was to identify the relationship between the spatial pattern and dispersal syndromes of plant community in the tropical forest of Barro Colorado Island (BCI), Panamá. Several studies have been developed in this tropical forest and some focused on the spatial pattern-syndrome relationship; however the novelty of our study is that a large set of models (114 models) including dispersal limitation and environmental heterogeneity were evaluated, used to identify the only and joint effect to subsequently select the best fit model for each species. Slightly more than fifty percent of the species showed spatial pattern consistent with only the dispersal limitation, and the remaining percentage of species revealed the only effect of environmental heterogeneity and habitat-dispersal limitation joined effect, equitably. Finally, with the same information from the tropical forest of BCI, and to understand the relationships underlying for balance of biodiversity, an index of the local functional dispersion was developed at the individual level, to relate the spatial pattern with four key functional traits of species. Although many studies involve this community with neutral theory, the assembly of the community is affected by similarity and habitat limitations at different scales.

Development and implementation of an air quality integrated assessment modelling system for the Iberian Peninsula

La mejora de la calidad del aire es una tarea eminentemente interdisciplinaria. Dada la gran variedad de ciencias y partes involucradas, dicha mejora requiere de herramientas de evaluación simples y completamente integradas. La modelización para la evaluación integrada (integrated assessment modeling) ha demostrado ser una solución adecuada para la descripción de los sistemas de contaminación atmosférica puesto que considera cada una de las etapas involucradas: emisiones, química y dispersión atmosférica, impactos ambientales asociados y potencial de disminución. Varios modelos de evaluación integrada ya están disponibles a escala continental, cubriendo cada una de las etapas antesmencionadas, siendo el modelo GAINS (Greenhouse Gas and Air Pollution Interactions and Synergies) el más reconocido y usado en el contexto europeo de toma de decisiones medioambientales. Sin embargo, el manejo de la calidad del aire a escala nacional/regional dentro del marco de la evaluación integrada es deseable. Esto sin embargo, no se lleva a cabo de manera satisfactoria con modelos a escala europea debido a la falta de resolución espacial o de detalle en los datos auxiliares, principalmente los inventarios de emisión y los patrones meteorológicos, entre otros. El objetivo de esta tesis es presentar los desarrollos en el diseño y aplicación de un modelo de evaluación integrada especialmente concebido para España y Portugal. El modelo AERIS (Atmospheric Evaluation and Research Integrated system for Spain) es capaz de cuantificar perfiles de concentración para varios contaminantes (NO2, SO2, PM10, PM2,5, NH3 y O3), el depósito atmosférico de especies de azufre y nitrógeno así como sus impactos en cultivos, vegetación, ecosistemas y salud como respuesta a cambios porcentuales en las emisiones de sectores relevantes. La versión actual de AERIS considera 20 sectores de emisión, ya sea equivalentes a sectores individuales SNAP o macrosectores, cuya contribución a los niveles de calidad del aire, depósito e impactos han sido modelados a través de matrices fuentereceptor (SRMs). Estas matrices son constantes de proporcionalidad que relacionan cambios en emisiones con diferentes indicadores de calidad del aire y han sido obtenidas a través de parametrizaciones estadísticas de un modelo de calidad del aire (AQM). Para el caso concreto de AERIS, su modelo de calidad del aire “de origen” consistió en el modelo WRF para la meteorología y en el modelo CMAQ para los procesos químico-atmosféricos. La cuantificación del depósito atmosférico, de los impactos en ecosistemas, cultivos, vegetación y salud humana se ha realizado siguiendo las metodologías estándar establecidas bajo los marcos internacionales de negociación, tales como CLRTAP. La estructura de programación está basada en MATLAB®, permitiendo gran compatibilidad con software típico de escritorio comoMicrosoft Excel® o ArcGIS®. En relación con los niveles de calidad del aire, AERIS es capaz de proveer datos de media anual y media mensual, así como el 19o valor horario más alto paraNO2, el 25o valor horario y el 4o valor diario más altos para SO2, el 36o valor diario más alto para PM10, el 26o valor octohorario más alto, SOMO35 y AOT40 para O3. En relación al depósito atmosférico, el depósito acumulado anual por unidad de area de especies de nitrógeno oxidado y reducido al igual que de azufre pueden ser determinados. Cuando los valores anteriormente mencionados se relacionan con características del dominio modelado tales como uso de suelo, cubiertas vegetales y forestales, censos poblacionales o estudios epidemiológicos, un gran número de impactos puede ser calculado. Centrándose en los impactos a ecosistemas y suelos, AERIS es capaz de estimar las superaciones de cargas críticas y las superaciones medias acumuladas para especies de nitrógeno y azufre. Los daños a bosques se calculan como una superación de los niveles críticos de NO2 y SO2 establecidos. Además, AERIS es capaz de cuantificar daños causados por O3 y SO2 en vid, maíz, patata, arroz, girasol, tabaco, tomate, sandía y trigo. Los impactos en salud humana han sido modelados como consecuencia de la exposición a PM2,5 y O3 y cuantificados como pérdidas en la esperanza de vida estadística e indicadores de mortalidad prematura. La exactitud del modelo de evaluación integrada ha sido contrastada estadísticamente con los resultados obtenidos por el modelo de calidad del aire convencional, exhibiendo en la mayoría de los casos un buen nivel de correspondencia. Debido a que la cuantificación de los impactos no es llevada a cabo directamente por el modelo de calidad del aire, un análisis de credibilidad ha sido realizado mediante la comparación de los resultados de AERIS con los de GAINS para un escenario de emisiones determinado. El análisis reveló un buen nivel de correspondencia en las medias y en las distribuciones probabilísticas de los conjuntos de datos. Las pruebas de verificación que fueron aplicadas a AERIS sugieren que los resultados son suficientemente consistentes para ser considerados como razonables y realistas. En conclusión, la principal motivación para la creación del modelo fue el producir una herramienta confiable y a la vez simple para el soporte de las partes involucradas en la toma de decisiones, de cara a analizar diferentes escenarios “y si” con un bajo coste computacional. La interacción con políticos y otros actores dictó encontrar un compromiso entre la complejidad del modeladomedioambiental con el carácter conciso de las políticas, siendo esto algo que AERIS refleja en sus estructuras conceptual y computacional. Finalmente, cabe decir que AERIS ha sido creado para su uso exclusivo dentro de un marco de evaluación y de ninguna manera debe ser considerado como un sustituto de los modelos de calidad del aire ordinarios. ABSTRACT Improving air quality is an eminently inter-disciplinary task. The wide variety of sciences and stakeholders that are involved call for having simple yet fully-integrated and reliable evaluation tools available. Integrated AssessmentModeling has proved to be a suitable solution for the description of air pollution systems due to the fact that it considers each of the involved stages: emissions, atmospheric chemistry, dispersion, environmental impacts and abatement potentials. Some integrated assessment models are available at European scale that cover each of the before mentioned stages, being the Greenhouse Gas and Air Pollution Interactions and Synergies (GAINS) model the most recognized and widely-used within a European policy-making context. However, addressing air quality at the national/regional scale under an integrated assessment framework is desirable. To do so, European-scale models do not provide enough spatial resolution or detail in their ancillary data sources, mainly emission inventories and local meteorology patterns as well as associated results. The objective of this dissertation is to present the developments in the design and application of an Integrated Assessment Model especially conceived for Spain and Portugal. The Atmospheric Evaluation and Research Integrated system for Spain (AERIS) is able to quantify concentration profiles for several pollutants (NO2, SO2, PM10, PM2.5, NH3 and O3), the atmospheric deposition of sulfur and nitrogen species and their related impacts on crops, vegetation, ecosystems and health as a response to percentual changes in the emissions of relevant sectors. The current version of AERIS considers 20 emission sectors, either corresponding to individual SNAP sectors or macrosectors, whose contribution to air quality levels, deposition and impacts have been modeled through the use of source-receptor matrices (SRMs). Thesematrices are proportionality constants that relate emission changes with different air quality indicators and have been derived through statistical parameterizations of an air qualitymodeling system (AQM). For the concrete case of AERIS, its parent AQM relied on the WRF model for meteorology and on the CMAQ model for atmospheric chemical processes. The quantification of atmospheric deposition, impacts on ecosystems, crops, vegetation and human health has been carried out following the standard methodologies established under international negotiation frameworks such as CLRTAP. The programming structure isMATLAB ® -based, allowing great compatibility with typical software such as Microsoft Excel ® or ArcGIS ® Regarding air quality levels, AERIS is able to provide mean annual andmean monthly concentration values, as well as the indicators established in Directive 2008/50/EC, namely the 19th highest hourly value for NO2, the 25th highest daily value and the 4th highest hourly value for SO2, the 36th highest daily value of PM10, the 26th highest maximum 8-hour daily value, SOMO35 and AOT40 for O3. Regarding atmospheric deposition, the annual accumulated deposition per unit of area of species of oxidized and reduced nitrogen as well as sulfur can be estimated. When relating the before mentioned values with specific characteristics of the modeling domain such as land use, forest and crops covers, population counts and epidemiological studies, a wide array of impacts can be calculated. When focusing on impacts on ecosystems and soils, AERIS is able to estimate critical load exceedances and accumulated average exceedances for nitrogen and sulfur species. Damage on forests is estimated as an exceedance of established critical levels of NO2 and SO2. Additionally, AERIS is able to quantify damage caused by O3 and SO2 on grapes, maize, potato, rice, sunflower, tobacco, tomato, watermelon and wheat. Impacts on human health aremodeled as a consequence of exposure to PM2.5 and O3 and quantified as losses in statistical life expectancy and premature mortality indicators. The accuracy of the IAM has been tested by statistically contrasting the obtained results with those yielded by the conventional AQM, exhibiting in most cases a good agreement level. Due to the fact that impacts cannot be directly produced by the AQM, a credibility analysis was carried out for the outputs of AERIS for a given emission scenario by comparing them through probability tests against the performance of GAINS for the same scenario. This analysis revealed a good correspondence in the mean behavior and the probabilistic distributions of the datasets. The verification tests that were applied to AERIS suggest that results are consistent enough to be credited as reasonable and realistic. In conclusion, the main reason thatmotivated the creation of this model was to produce a reliable yet simple screening tool that would provide decision and policy making support for different “what-if” scenarios at a low computing cost. The interaction with politicians and other stakeholders dictated that reconciling the complexity of modeling with the conciseness of policies should be reflected by AERIS in both, its conceptual and computational structures. It should be noted however, that AERIS has been created under a policy-driven framework and by no means should be considered as a substitute of the ordinary AQM.

Infrared thermography and shoulder pain in wheelchair users = Termografía infrarroja y dolor de hombro en usuarios de sillas de ruedas

Las personas que usan la silla de ruedas como su forma de movilidad prioritaria presentan una elevada incidencia (73%) de dolor de hombro debido al sobreuso y al movimiento repetitivo de la propulsión. Existen numerosos métodos de diagnóstico para la detección de las patologías del hombro, sin embargo la literatura reclama la necesidad de un test no invasivo y fiable, y sugiere la termografía como una técnica adecuada para evaluar el dolor articular. La termografía infrarroja (IRT) proporciona información acerca de los procesos fisiológicos a través del estudio de las distribuciones de la temperatura de la piel. Debido a la alta correlación entre ambos lados corporales, las asimetrías térmicas entre flancos contralaterales son una buena indicación de patologías o disfunciones físicas subyacentes. La fiabilidad de la IRT ha sido estudiada con anterioridad en sujetos sanos, pero nunca en usuarios de sillas de ruedas. Las características especiales de la población con discapacidad (problemas de sudoración y termorregulación, distribución sanguínea o medicación), hacen necesario estudiar los factores que afectan a la aplicación de la IRT en usuarios de sillas de ruedas. La bibliografía discrepa en cuanto a los beneficios o daños resultantes de la práctica de la actividad física en las lesiones de hombro por sobreuso en usuarios de sillas de ruedas. Recientes resultados apuntan a un aumento del riesgo de rotura del manguito rotador en personas con paraplejia que practican deportes con elevación del brazo por encima de la cabeza. Debido a esta falta de acuerdo en la literatura, surge la necesidad de analizar el perfil termográfico en usuarios de sillas de ruedas sedentarios y deportistas y su relación con el dolor de hombro. Hasta la fecha sólo se han publicado estudios termográficos durante el ejercicio en sujetos sanos. Un mayor entendimiento de la respuesta termográfica al ejercicio en silla de ruedas en relación al dolor de hombro clarificará su aparición y desarrollo y permitirá una apropiada intervención. El primer estudio demuestra que la fiabilidad de la IRT en usuarios de sillas de ruedas varía dependiendo de las zonas analizadas, y corrobora que la IRT es una técnica no invasiva, de no contacto, que permite medir la temperatura de la piel, y con la cual avanzar en la investigación en usuarios de sillas de ruedas. El segundo estudio proporciona un perfil de temperatura para usuarios de sillas de ruedas. Los sujetos no deportistas presentaron mayores asimetrías entre lados corporales que los sedentarios, y ambos obtuvieron superiores asimetrías que los sujetos sin discapacidad reportados en la literatura. Los no deportistas también presentaron resultados más elevados en el cuestionario de dolor de hombro. El área con mayores asimetrías térmicas fue hombro. En deportistas, algunas regiones de interés (ROIs) se relacionaron con el dolor de hombro. Estos resultados ayudan a entender el mapa térmico en usuarios de sillas de ruedas. El último estudio referente a la evaluación de la temperatura de la piel en usuarios de sillas de ruedas en ejercicio, reportó diferencias significativas entre la temperatura de la piel antes del test y 10 minutos después del test de propulsión de silla de ruedas, en 12 ROIs; y entre el post-test y 10 minutos después del test en la mayoría de las ROIs. Estas diferencias se vieron atenuadas cuando se compararon las asimetrías antes y después del test. La temperatura de la piel tendió a disminuir inmediatamente después completar el ejercicio, e incrementar significativamente 10 minutos después. El análisis de las asimetrías vs dolor de hombro reveló relaciones significativas negativas en 5 de las 26 ROIs. No se encontraron correlaciones significativas entre las variables de propulsión y el cuestionario de dolor de hombro. Todas las variables cinemáticas correlacionaron significativamente con las asimetrías en múltiples ROIs. Estos resultados indican que los deportistas en sillas de ruedas exhiben una capacidad similar de producir calor que los deportistas sin discapacidad; no obstante, su patrón térmico es más característico de ejercicios prolongados que de esfuerzos breves. Este trabajo contribuye al conocimiento de la termorregulación en usuarios de sillas de ruedas durante el ejercicio, y aporta información relevante para programas deportivos y de rehabilitación. ABSTRACT Individuals who use wheelchairs as their main means of mobility have a high incidence (73%) of shoulder pain (SP) owing to overuse and repetitive propulsion movement. There are numerous diagnostic methods for the detection of shoulder pathologies, however the literature claims that a noninvasive accurate test to properly assess shoulder pain would be necessary, and suggests thermography as a suitable technique for joint pain evaluation. Infrared thermography (IRT) provides information about physiological processes by studying the skin temperature (Tsk) distributions. Due to the high correlation of skin temperature between both sides of the body, thermal asymmetries between contralateral flanks are an indicator of underlying pathologies or physical dysfunctions. The reliability of infrared thermography has been studied in healthy subjects but there are no studies that have analyzed the reliability of IRT in wheelchair users (WCUs). The special characteristics of people with disabilities (sweating and thermoregulation problems, or blood distribution) make it necessary to study the factors affecting the application of IRT in WCUs. Discrepant reports exist on the benefits of, or damage resulting from, physical exercise and the relationship to shoulder overuse injuries in WCUs. Recent findings have found that overhead sports increase the risk of rotator cuff tears in wheelchair patients with paraplegia. Since there is no agreement in the literature, the thermographic profile of wheelchair athletes and nonathletes and its relation with shoulder pain should also be analysed. Infrared thermographic studies during exercise have been carried out only with able-bodied population at present. The understanding of the thermographic response to wheelchair exercise in relation to shoulder pain will offer an insight into the development of shoulder pain, which is necessary for appropriate interventions. The first study presented in this thesis demonstrates that the reliability of IRT in WCUs varies depending on the areas of the body that are analyzed. Moreover, it corroborates that IRT is a noninvasive and noncontact technique that allows the measurement of Tsk, which will allow for advances to be made in research concerned with WCUs. The second study provides a thermal profile of WCUs. Nonathletic subjects presented higher side-to-side skin temperature differences (ΔTsk) than athletes, and both had greater ΔTsk than the able-bodied results that have been published in the literature. Nonathletes also revealed larger Wheelchair Users Shoulder Pain Index (WUSPI) score than athletes. The shoulder region of interest (ROI) was the area with the highest ΔTsk of the regions measured. The analysis of the athletes’ Tsk showed that some ROIs are related to shoulder pain. These findings help to understand the thermal map in WCUs. Finally, the third study evaluated the thermal response of WCUs in exercise. There were significant differences in Tsk between the pre-test and the post-10 min in 12 ROIs, and between the post-test and the post-10 in most of the ROIs. These differences were attenuated when the ΔTsk was compared before and after exercise. Skin temperature tended to initially decrease immediately after the test, followed by a significant increase at 10 minutes after completing the exercise. The ΔTsk versus shoulder pain analysis yielded significant inverse relationships in 5 of the 26 ROIs. No significant correlations between propulsion variables and the results of the WUSPI questionnaire were found. All kinematic variables were significantly correlated with the temperature asymmetries in multiple ROIs. These results present indications that high performance wheelchair athletes exhibit similar capacity of heat production to able-bodied population; however, they presented a thermal pattern more characteristic of a prolonged exercise rather than brief exercise. This work contributes to improve the understanding about temperature changes in wheelchair athletes during exercise and provides implications to the sports and rehabilitation programs.

Estudio de la estabilidad genética asociada a los procesos de crioconservación de ápices de menta

La crioconservación se ha descrito como una técnica de conservación ex situ a largo plazo que ha sido aplicada con éxito a numerosas especies, y resulta especialmente importante en aquellas con propagación vegetativa, infértiles o amenazadas, en las que sistemas de conservación ex situ más sencillos, como los bancos de semillas, no son posibles. También presenta ventajas frente a la conservación in vitro, ya que logra disminuir o eliminar problemas como la excesiva manipulación del material, evitando los subcultivos periódicos y disminuyendo así el riesgo de contaminaciones y de aparición de variación somaclonal. Sin embargo, someter al material vegetal a los procedimientos que implica la crioconservación provoca distintos estreses. Entre ellos, el estrés oxidativo puede potencialmente producir daños en membranas, proteínas, carbohidratos y en el ADN. En este trabajo se han evaluado diversos sistemas de crioconservación en ápices de Mentha × piperita L., híbrido estéril entre Mentha aquatica L. y Mentha spicata L. Se han utilizado ápices de dos genotipos (‘MEN 186’y ‘MEN 198’) en los cuales se compararon dos técnicas de crioconservación, encapsulación-deshidratación y vitrificación-droplet. El análisis de la supervivencia y capacidad de regeneración del material sometido a los tratamientos de crioconservación, junto con el análisis de la estabilidad genética de dicho material mediante marcadores moleculares (RAPD y AFLP) han permitido comparar los distintos protocolos y tratamientos establecidos. El estudio sobre el tipo de protocolo empleado reveló una mayor variabilidad genética en la técnica de encapsulación-deshidratación, especialmente en el genotipo ‘MEN 186’, ya que ‘MEN 198’ resultó ser más estable en todos los análisis. La inestabilidad encontrada en esta técnica no fue exclusiva de aquellos explantos crioconservados, sino que los pasos previos a la inmersión en nitrógeno líquido (NL) también provocaron variaciones en el ADN. Según el tipo de muestra analizada se encontraron diferencias en la estabilidad: muestras provenientes de callos presentaron una mayor inestabilidad que aquellas de hojas (brotes). Se utilizaron tres medios para la recuperación de los ápices tras la crioconservación con el uso de diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento: “Reed” (0,5 mgL-1 6-bencilaminopurina, BAP), “Senula” (0,5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purina, 2-iP + 0,1 mgL-1 ácido α-naftalen-acético, ANA) y “Nudos” (0,5 mgL-1 BAP + 0,1 mgL-1ANA). El medio “Reed” produjo un aumento en la supervivencia y recuperación de los ápices en ambos genotipos y técnicas, y disminuyó la formación de callo. Sin embargo, no tuvo un efecto significativo en la estabilidad genética. El medio “Senula” provocó una mayor estabilidad genética en el genotipo más inestable, ‘MEN 186’. Para reducir el daño oxidativo producido durante la encapsulación-deshidratación, e incrementar la recuperación de los ápices manteniendo su estabilidad genética, se comparó el efecto de añadir sustancias antioxidantes en el precultivo de los ápices (ácido ascórbico, vitamina E y glutatión). No se obtuvo la respuesta esperada y estos tratamientos no presentaron efectos significativos tanto en la estabilidad como en la recuperación. Para entender mejor qué sucede durante todo el proceso de encapsulación-deshidratación, se evaluó cada paso del protocolo por separado y su efecto en la estabilidad y la recuperación. Además, se determinó el estado de oxidación en cada etapa mediante la cuantificación de malondialdehído y la detección de la formación de radicales libres (mediante el ensayo del ácido tiobarbitúrico, y sondas fluorescentes específicas, respectivamente). Se determinó que a partir de los primeros pasos se genera estrés oxidativo, el cual aumenta a medida que se avanza por el protocolo hasta la inmersión en nitrógeno líquido. Esto se ve reflejado en la disminución progresiva tanto de la recuperación como de la estabilidad genética. Con el uso de antioxidantes en el precultivo (ácido ascórbico y vitamina E) no se obtuvo un efecto positivo en el mantenimiento de la estabilidad genética, y tan sólo con el uso de vitamina E se observó una recuperación mayor en uno de los pasos estudiados (después de la desecación). Sin embargo, cuando se utilizó ácido ascórbico durante el precultivo o la deshidratación osmótica se consiguió disminuir de forma significativa la formación de MDA y la acumulación del radical superóxido (O2•-) en la mayoría los pasos analizados, aunque esta reducción no parece tener un efecto directo en la estabilidad genética del material recuperado. ABSTRACT Cryopreservation has been described as an effective technique for the long term of ex situ conservation that has been successfully applied to numerous species, and is of especial relevance for those with vegetative propagation, infertile or endangered, in which simpler systems of ex situ conservation, such as seed banking, are not feasible. It also has advantages over in vitro conservation, as it reduces or eliminates excessive material handling, avoids periodic subcultures and thus limits the risk of contamination and the appearance of somaclonal variation. However, plant material is subjected to different treatments involved in the cryopreservation procedures, which impose several stresses. Among them, oxidative stress can potentially cause damage to membranes, proteins, carbohydrates and DNA. In this work, two cryopreservation techniques have been evaluated in Mentha × piperita L. shoot tips, sterile hybrid between Mentha aquatica L. and Mentha spicata L. Two genotypes ('MEN 186' and 'MEN 198') were used to compare two techniques: encapsulation-dehydration and droplet-vitrification. The analysis of survival and recovery capacity of the material after the cryopreservation treatments, and the analysis of the genetic stability by molecular markers (RAPD and AFLP) have enabled the comparison between protocols and treatments. The study of the two cryopreservation procedures revealed a higher genetic variability in the encapsulation-dehydration technique, especially in genotype 'MEN 186', as 'MEN 198' was more stable in all analyses. The instability generated in this technique was not exclusive of cryopreserved explants, pretreatments prior to immersion in NL also caused DNA variations. The type of sampled plant material revealed also differences in the stability: callus samples showed greater instability than shoots. Three different culture media were used for the recovery of shoot tips after cryopreservation, using different combinations of growth regulators: "Reed" (0.5 mgL-1 6-benzylaminopurine, BAP), "Senula" (0.5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purine, 2-iP + 0.1 mgL-1 α-naphthalene acetic acid, ANA) and "Nodes" (0.5 mgL-1 BAP + 0.1 mgL-1 ANA). "Reed" medium increased survival and recovery of shoot tips in both genotypes and techniques and decreased callus formation. However, it didn`t have a significant effect on genetic stability. "Senula" medium caused a higher genetic stability in the most unstable genotype, 'MEN 186'. To reduce oxidative damage during encapsulation-dehydration, and increase shoot tip recovery and maintain genetic stability, the effect of added antioxidants (ascorbic acid, vitamin E and glutathione) in the shoot tip preculture medium was studied. These treatments had no significant effect on both stability and recovery. To better understand the events during the encapsulation-dehydration process, the effect of each step of the protocol on stability and recovery was evaluated separately. Moreover, the oxidation level was determined by quantifying malondialdehyde (MDA) formation and detecting free radical accumulation (using the thiobarbituric acid assay, and specific fluorescent probes, respectively). The oxidative stress was detected from the first steps and increased throughout the protocol until the immersion in liquid nitrogen. This was also reflected in the gradual decline of recovery and genetic stability. The use of antioxidants (ascorbic acid and vitamin E) in the shoot tip preculture medium had no effect in maintaining genetic stability; only vitamin E increased recovery in one of the steps studied (after desiccation). However, when ascorbic acid was used during the preculture or during the osmotic dehydration, a significantly decrease was observed in MDA formation and superoxide radical accumulation in most of the steps analyzed, although this reduction did not seem to have a direct effect on the genetic stability of recovered material.

Estructura espacial y dinámica del bosque montano del sur del Ecuador. Interacciones bióticas y limitaciones abióticas

Muchos estudios han descrito la composición y diversidad de los bosques montanos tropicales, pero los patrones espaciales y las diferentes tipos de relaciones de estos, entre especies o entre grupos funcionales ha sido poco documentada. El presente trabajo se realizó en tres parcelas completamente censadas del bosque de la Estación Biológica “Chamusquin” (Zamora Chinchipe, Ecuador), y se plantea como objetivo principal conocer la estructura espacial y dinámica del bosque montano tropical del sur del Ecuador, así como las interacciones bióticas y limitaciones abióticas que influyen en esta dinámica, para ello se planteó cuatro objetivos de estudio que son: conocer los patrones espaciales de los gremios ecológicos dentro de la zona de estudio; conocer la influencia de la dependencia negativa de la densidad sobre dos especies de helechos arborescentes (Cyatheaceae); conocer si existen especies o grupos ecológicos acumuladoras o repulsoras de diversidad en el área de estudio; y conocer cómo influyen la diversidad filogenética y la densidad del vecindario en la incidencia de herbivoría y parasitismo sobre las fases iniciales del establecimiento forestal (brinzales) así como en la supervivencia de los mismos Como paso previo para el análisis del resto de objetivos, dentro de cada parcela se marcaron todos los individuos con DAP ≥5 cm y se tomaron sus coordenadas (X, Y). Además se tomaron datos de variables superficiales y muestras del suelo. Las especies encontradas se clasificaron de acuerdo a sus características biológicas, asignándolas a cada uno de los cuatro gremios forestales usualmente distinguidos en los bosques tropicales: tolerantes a la sombra (TS), tolerantes parciales a la sombra (TPS), pioneras de vida larga (PVL) y pioneras de vida corta (PVC). Para el estudio del primer objetivo tas se emplearon funciones K de Ripley inhomogéneas, ajustando la heterogeneidad en base a la variación espacial de las variables ambientales registradas . Los resultados demostraron que tanto la frecuencia relativa como el patrón espacial de las diferentes estrategias funcionales varían a lo largo de la sucesión y que éste además está influido por la variación ambiental. En adición, tanto el patrón espacial como la respuesta a la variación ambiental de los diferentes gremios es distinta entre adultos y juveniles. Todo ello sugiere que el ensamblaje de la diversidad en los bosque montanos andinos está controlado por procesos deterministas más que por procesos neutrales. Para responder el segundo objetivo se estudiaron los efectos de la dependencia negativa de la densidad (DND) y la heterogeneidad ambiental en las poblaciones de dos especies de helechos arborescentes abundantes, Cyathea caracasana y Alsophila engelii, y cómo estos efectos cambian a través de un gradiente sucesional. Los patrones de especies albergan información sobre procesos tales como la competencia que puede ser revelado fácilmente utilizando técnicas de análisis de patrones punto. Sin embargo, su detección puede ser difícil debido a los efectos de factores de confusión heterogeneidad del hábitat. Aquí, empleamos funciones K y funciones de correlación de par homogéneas y no homogéneas para cuantificar el cambio en el patrón espacial de diferentes clases de tamaño con un diseño de casos-controles para estudiar las asociaciones entre helechos arborescentes jóvenes y adultos. Usando estimaciones espaciales de la biomasa de los cuatro tipos de gremios ecológicos (PVC, PVL, TPS, TS) como covariables, hemos ajustado modelos de Poisson heterogéneos a los patrones de puntos de de los helechos juveniles y los adultos y hemos explorado además la existencia de dependencia del hábitat en estos patrones. Nuestro estudio reveló efectos de la DND para C. caracasana y un fuerte filtrado ambiental que subyace al patrón de A. engelii. Encontramos también que las poblaciones de adultos y juveniles de ambas especies respondieron de manera diferente a la heterogeneidad del hábitat y en la mayoría de los casos esta heterogeneidad se asoció con la distribución espacial de la biomasa de los cuatro tipos de gremios. Estos resultados muestran la eficacia de controlar los efectos de la heterogeneidad ambiental para evitar su confusión con los patrones derivados de interacciones biológicas cuando se estudia la DND y demuestran la utilidad de los mapas de covariables derivados de comunidades biológicas como resumen de la heterogeneidad ambiental. Para nuestro tercer objetivo nos centramos en explorar cómo influyen las especies más abundantes en la organización espacial de la diversidad a lo largo de un gradiente sucesional en el bosque montano del sur del Ecuador. Para ello utilizamos la función ISAR (Individual Species Area Relationship). Encontramos que la frecuencia de especies neutras, repulsoras y acumuladoras de diversidad taxonómica varía dependiendo del grado de sucesión. Además se comprobó que la mayoría de los gremios forestales se comportó de forma neutral, pero la proporción de acumuladores, aumentó al avanzar la sucesión hacia estados más maduros, lo que indica el establecimiento de fuertes procesos competitivos a medida que avanza la sucesión y la mayor importancia del papel de las especies individuales en dichos estados. Finalmente, examinamos el efecto de la vecindad taxonómica y filogenética, así como la estrategia de vida, sobre la incidencia de la herbivoría y el parasitismo en las poblaciones de brinzales de tres fragmentos forestales en una secuencia sucesional del bosque montano húmedo. Evaluamos además los efectos de herbivoría, parasitismo, estrategia de vida y diferentes indicadores de la vecindad sobre la supervivencia de los brinzales. Por último contrastamos la posible existencia de una tendencia compensatoria de la comunidad (CCT) a nivel de fragmento forestal. Nuestros análisis no consiguieron detectar una CCT pero si pusieron de manifiesto la existencia de efectos locales de dependencia negativa de la densidad. Por ejemplo, la presencia de herbivoría y parasitismo sobre los brinzales se relacionó significativamente con una menor supervivencia de estos. Por otro lado, indicadores del efecto de la vecindad como la densidad de brinzales del mismo género y el área basal de árboles vecinos del mismo género incrementaron la prevalencia de la herbivoría o el parasitismo en los brinzales. El incremento de la incidencia de la herbivoría o el parasitismo no está exclusivamente ligado a tener una vecindad taxonómicamente idéntica (vecinos de la misma especie) sino que categorías taxonómicas más laxas como el "género" o simplemente relaciones de semejanza filogenética son capaces de predecir los efectos negativos de la vecindad. Los efectos detectados variaron en los diferentes grupos funcionales distinguidos. Los resultados que hemos obtenido en este trabajo parecen indicar que el funcionamiento de las comunidades de brinzales del bosque montano tropical no difiere mucho del reportado para comunidades de plántulas en otros bosques tropicales y cumple las predicciones de la hipótesis de Janzen y Connell, aunque matizadas por la mayor resistencia de los brinzales al efecto de herbivoría y parasitismo. ABSTRACT Many studies have described the composition and diversity of tropical montane forests, but the different spatial patterns and types of relationships between species or between functional groups has been poorly documented. This work was made in three completely surveyed forest plots at Biological Station "Chamusquin" (Zamora Chinchipe, Ecuador). Our main objective was to know the spatial structure and dynamics of the tropical montane forest in southern Ecuador, as well as the biotic interactions and abiotic constraints affecting this dynamic. More specifically, we aimed to understand the spatial patterns of ecological guilds; to explore the influence of negative density dependence on two species of tree ferns (Cyatheaceae); to determine whether some species or ecological groups structure spatially plant diversity in these forests; and to test the effects of biological neighborhood on the incidence of herbivory and parasitism and on the survival of saplings. We mapped within each plot all trees with DBH ≥5 cm. Besides, surface data variables and soil samples they were taken. The species found were classified according to their biological characteristics in four forest guilds: shade-tolerant (ST), partial shade tolerant (PST), long-lived pioneer (LLP) and short-lived pioneer (SLP). To analyze the spatial patterns of the ecological guilds, we employed the inhomogeneous version of Ripley's K-function and adjusted heterogeneity surfaces based on the spatial variation of the measured environmental variables. The results showed that both the relative frequency of each functional guild as well as their spatial pattern varied throughout succession and that the spatial pattern is explained by environmental variation. In addition, both spatial pattern and the response to spatial variation of each guild varied throughout ontogeny. All in all suggest that diversity assembly in the studied forests is ruled by deterministic instead of neutral processes. We also addressed the negative effects of density dependence (NDD) and environmental heterogeneity in populations of two species of abundant tree ferns, Cyathea caracasana and Alsophila engelii, and how these effects change across a successional gradient.. Here, we used homogeneous and inhomogeneous K and pair-correlation functions to quantify the change in the spatial pattern of different size classes with a case-control design to study associations between young and adult tree ferns. Using spatial estimates of the biomass of the four types of ecological guilds (SLP, LLP, PST, ST) as co-variables, we fitted heterogeneous Poisson models to juvenile and adult tree fern point patterns and explored the existence of habitat dependence. Our study revealed NDD effects for C. caracasana and strong environmental filtering underlying the pattern of A. engelii. We found that adult and juvenile populations of both species responded differently to habitat heterogeneity and in most cases this heterogeneity was associated with the spatial distribution of biomass of the four functional tree types. These findings show the effectiveness of factoring out environmental heterogeneity to avoid confounding factors when studying NDD and demonstrate the usefulness of covariate maps derived from mapped communities. For our third objective we focused on exploring how the most abundant species influence the spatial organization of tree diversity in these forests. For this, we used the individual species-area relationship function (ISAR). We found that the proportion of accumulator, repeller and neutral species, varied depending on the degree of succession. We found also that most guilds behaved neutrally but the proportion of accumulator guilds increased as succession advanced to more mature stages. This point, to the existence of strong competitive effects mediated by individual species in these mature forests. Finally, we examined the effects of life strategies and taxonomic and phylogenetic neighborhood on the incidence of herbivory and parasitism in the communities of saplings in the same forest fragments. We evaluated also the effects of life strategies, herbivory, parasitism and some indicators of neighborhood on sapling survival. Finally we tested for the existences of a compensatory community trend at plot scale. We did not found a CCT but we found proof of local NND effects. For instance, the prevalence of herbivory and parasitism were related to lower sapling survival. On the other hand the density of con-generic saplings and the basal area of neighbor con-generic trees were related to a higher prevalence of herbivory or parasitism in the saplings. We demonstrated that the increase in the prevalence of herbivory or parasitism it s not exclusive of a conspecific neighborhood but instead larger taxonomic categories such as "genus" or simple phylogenetic relationships are also able to predict NND effects. The NND effects varied among functional guilds. Our results show that the dynamic of sapling communities in Ecuadorian montane forests is similar to seedling dynamics in other tropical forest and follows the predictions of Janzen-Connell hypothesis, although softened by the strong resilience of saplings in comparison to seedlings.