Mejora de la eficacia de Penicillium oxalicum como agente de biocontrol en enfermedades de plantas hortícolas

Actualmente, la reducción de materias activas (UE) y la implantación de la nueva Directiva comunitaria 2009/128/ que establece el marco de actuación para conseguir un uso sostenible de los plaguicidas químicos y la preferencia de uso de métodos biológicos, físicos y otros no químicos, obliga a buscar métodos de control menos perjudiciales para el medio ambiente. El control biológico (CB) de enfermedades vegetales empleando agentes de control biológico (ACB) se percibe como una alternativa más segura y con menor impacto ambiental, bien solos o bien como parte de una estrategia de control integrado. El aislado 212 de Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) fue aislado originalmente de la micoflora del suelo en España y ha demostrado ser un eficaz ACB frente a la marchitez vascular del tomate. Una vez identificado y caracterizado el ACB se inició el periodo de desarrollo del mismo poniendo a punto un método de producción en masa de sus conidias. Tras lo cual se inició el proceso de formulación del ACB deshidratando las conidias para su preservación durante un período de tiempo mayor mediante lecho fluido. Finalmente, se han desarrollado algunos formulados que contienen de forma individual diferentes aditivos que han alargado su viabilidad, estabilidad y facilitado su manejo y aplicación. Sin embargo, es necesario seguir trabajando en la mejora de su eficacia de biocontrol. El primer objetivo de esta Tesis se ha centrado en el estudio de la interacción ACB-patógeno-huésped que permita la actuación de P.oxalicum en diferentes patosistemas. Uno de los primeros puntos que se abordan dentro de este objetivo es el desarrollo de nuevas FORMULACIONES del ACB que incrementen su eficacia frente a la marchitez vascular del tomate. Las conidias formuladas de PO212 se obtuvieron por la adición conjunta de distintos aditivos (mojantes, adherentes o estabilizantes) en dos momentos diferentes del proceso de producción/secado: i) antes del proceso de producción (en la bolsa de fermentación) en el momento de la inoculación de las bolsas de fermentación con conidias de PO212 o ii) antes del secado en el momento de la resuspensión de las conidias tras su centrifugación. De las 22 nuevas formulaciones desarrolladas y evaluadas en plantas de tomate en ensayos en invernadero, seis de ellas (FOR22, FOR25, FOR32, FOR35, FOR36 y FOR37) mejoran significativamente (P=0,05) el control de la marchitez vascular del tomate con respecto al obtenido con las conidias secas de P.oxalicum sin aditivos (CSPO) o con el fungicida Bavistin. Los formulados que mejoran la eficacia de las conidias secas sin aditivos son aquellos que contienen como humectantes alginato sódico en fermentación, seguido de aquellos que contienen glicerol como estabilizante en fermentación, y metil celulosa y leche desnatada como adherentes antes del secado. Además, el control de la marchitez vascular del tomate por parte de los formulados de P. oxalicum está relacionado con la fecha de inicio de la enfermedad. Otra forma de continuar mejorando la eficacia de biocontrol es mejorar la materia activa mediante la SELECCIÓN DE NUEVAS CEPAS de P. oxalicum, las cuales podrían tener diferentes niveles de eficacia. De entre las 28 nuevas cepas de P. oxalicum ensayadas en cámara de cultivo, sólo el aislado PO15 muestra el mismo nivel de eficacia que PO212 (62-67% de control) frente a la marchitez vascular del tomate en casos de alta presión de enfermedad. Mientras que, en casos de baja presión de enfermedad todas las cepas de P. oxalicum y sus mezclas demuestran ser eficaces. Finalmente, se estudia ampliar el rango de actuación de este ACB a OTROS HUÉSPEDES Y OTROS PATÓGENOS Y DIFERENTES GRADOS DE VIRULENCIA. En ensayos de eficacia de P. oxalicum frente a aislados de diferente agresividad de Verticillium spp. y Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en plantas de tomate en cámaras de cultivo, se demuestra que la eficacia de PO212 está negativamente correlacionada con el nivel de enfermedad causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici pero que no hay ningún efecto diferencial en la reducción de la incidencia ni de la gravedad según la virulencia de los aislados. Sin embargo, en los ensayos realizados con V. dahliae, PO212 causa una mayor reducción de la enfermedad en las plantas inoculadas con aislados de virulencia media. La eficacia de PO212 también era mayor frente a aislados de virulencia media alta de F. oxysporum f. sp. melonis y F. oxysporum f. sp. niveum, en plantas de melón y sandía, respectivamente. En ambos huéspedes se demuestra que la dosis óptima de aplicación del ACB es de 107 conidias de PO212 g-1 de suelo de semillero, aplicada 7 días antes del trasplante. Además, entre 2 y 4 nuevas aplicaciones de PO212 a la raíces de las plantas mediante un riego al terreno de asiento mejoran la eficacia de biocontrol. La eficacia de PO212 no se limita a hongos patógenos vasculares como los citados anteriormente, sino también a otros patógenos como: Phytophthora cactorum, Globodera pallida y G. rostochiensis. PO212 reduce significativamente los síntomas (50%) causados por P. cactorum en plantas de vivero de fresa, tras la aplicación del ACB por inmersión de las raíces antes de su trasplante al suelo de viveros comerciales. Por otra parte, la exposición de los quistes de Globodera pallida y G. rostochiensis (nematodos del quiste de la patata) a las conidias de P. oxalicum, en ensayos in vitro o en microcosmos de suelo, reduce significativamente la capacidad de eclosión de los huevos. Para G. pallida esta reducción es mayor cuando se emplean exudados de raíz de patata del cv. 'Monalisa', que exudados de raíz del cv. 'Desirée'. No hay una reducción significativa en la tasa de eclosión con exudados de raíz de tomate del cv. 'San Pedro'. Para G. rostochiensis la reducción en la tasa de eclosión de los huevos se obtiene con exudados de la raíz de patata del cv. 'Desirée'. El tratamiento con P. oxalicum reduce también significativamente el número de quistes de G. pallida en macetas. Con el fin de optimizar la aplicación práctica de P. oxalicum cepa 212 como tratamiento biológico del suelo, es esencial entender cómo el entorno físico influye en la capacidad de colonización, crecimiento y supervivencia del mismo, así como el posible riesgo que puede suponer su aplicación sobre el resto de los microorganismos del ecosistema. Por ello en este segundo objetivo de esta tesis se estudia la interacción del ACB con el medio ambiente en el cual se aplica. Dentro de este objetivo se evalúa la INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA, DISPONIBILIDAD DE AGUA Y PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS SUELOS (POROSIDAD, TEXTURA, DENSIDAD...) SOBRE LA SUPERVIVENCIA Y EL CRECIMIENTO DE PO212 en condiciones controladas elaborando modelos que permitan predecir el impacto de cada factor ambiental en la supervivencia y crecimiento de P. oxalicum y conocer su capacidad para crecer y sobrevivir en diferentes ambientes. En las muestras de suelo se cuantifica: i) la supervivencia de Penicillium spp. usando el recuento del número de unidades formadoras de colonias en un medio de cultivo semi-selectivo y ii) el crecimiento (biomasa) de PO212 mediante PCR en tiempo real. En los resultados obtenidos se demuestra que P. oxalicum crece y sobrevive mejor en condiciones de sequía independientemente de la temperatura y del tipo de suelo. Si comparamos tipos de suelo P. oxalicum crece y sobrevive en mayor medida en suelos areno-arcillosos con un bajo contenido en materia orgánica, un mayor pH y una menor disponibilidad de fósforo y nitrógeno. La supervivencia y el crecimiento de P. oxalicum se correlaciona de forma negativa con la disponibilidad de agua y de forma positiva con el contenido de materia orgánica. Sólo la supervivencia se correlaciona también positivamente con el pH. Por otro lado se realizan ensayos en suelos de huertos comerciales con diferentes propiedades físico-químicas y diferentes condiciones ambientales para ESTUDIAR EL ESTABLECIMIENTO, SUPERVIVENCIA Y DISPERSIÓN VERTICAL Y MOVILIDAD HORIZONTAL DE PO212. P. oxalicum 212 puede persistir y sobrevivir en esos suelos al menos un año después de su liberación pero a niveles similares a los de otras especies de Penicillium indígenas presentes en los mismos suelos naturales. Además, P. oxalicum 212 muestra una dispersión vertical y movilidad horizontal muy limitada en los diferentes tipos de suelo evaluados. La introducción de P. oxalicum en un ambiente natural no sólo implica su actuación sobre el microorganismo diana, el patógeno, si no también sobre otros microorganismos indígenas. Para EVALUAR EL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE P. oxalicum SOBRE LAS POBLACIONES FÚNGICAS INDIGENAS PRESENTES EN EL SUELO de dos huertos comerciales, se analizan mediante electroforesis en gradiente desnaturalizante de poliacrilamida (DGGE) muestras de dichos suelos a dos profundidades (5 y 10 cm) y a cuatro fechas desde la aplicación de P. oxalicum 212 (0, 75, 180 y 365 días). El análisis de la DGGE muestra que las diferencias entre las poblaciones fúngicas se deben significativamente a la fecha de muestreo y son independientes del tratamiento aplicado y de la profundidad a la que se tomen las muestras. Luego, la aplicación del ACB no afecta a la población fúngica de los dos suelos analizados. El análisis de las secuencias de la DGGE confirma los resultados anteriores y permiten identificar la presencia del ACB en los suelos. La presencia de P. oxalicum en el suelo se encuentra especialmente relacionada con factores ambientales como la humedad. Por tanto, podemos concluir que Penicillium oxalicum cepa 212 puede considerarse un óptimo Agente de Control Biológico (ACB), puesto que es ecológicamente competitivo, eficaz para combatir un amplio espectro de enfermedades y no supone un riesgo para el resto de microorganismos fúngicos no diana presentes en el lugar de aplicación. ABSTRACT Currently, reduction of active (EU) and the implementation of the new EU Directive 2009/128 which establishing the framework for action to achieve the sustainable use of chemical pesticides and preference of use of biological, physical and other non-chemical methods, forces to look for control methods less harmful to the environment. Biological control (CB) of plant diseases using biological control agents (BCA) is perceived as a safer alternative and with less environmental impact, either alone or as part of an integrated control strategy. The isolate 212 of Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) was originally isolated from the soil mycoflora in Spain. P. oxalicum is a promising biological control agent for Fusarium wilt and other tomato diseases. Once identified and characterized the BCA, was developed a mass production method of conidia by solid-state fermentation. After determined the process of obtaining a formulated product of the BCA by drying of product by fluid-bed drying, it enables the preservation of the inoculum over a long period of time. Finally, some formulations of dried P. oxalicum conidia have been developed which contain one different additive that have improved their viability, stability and facilitated its handling and application. However, further work is needed to improve biocontrol efficacy. The first objective of this thesis has focused on the study of the interaction BCA- pathogen-host, to allow P.oxalicum to work in different pathosystems. The first point to be addressed in this objective is the development of new FORMULATIONS of BCA which increase their effectiveness against vascular wilt of tomato. PO212 conidial formulations were obtained by the joint addition of various additives (wetting agents, adhesives or stabilizers) at two different points of the production-drying process: i) to substrate in the fermentation bags before the production process, and (ii) to conidial paste obtained after production but before drying. Of the 22 new formulations developed and evaluated in tomato plants in greenhouse tests, six of them (FOR22 , FOR25 , FOR32 , FOR35 , FOR36 and FOR3) improved significantly (P = 0.05) the biocontrol efficacy against tomato wilt with respect to that obtained with dried P.oxalicum conidia without additives (CSPO) or the fungicide Bavistin. The formulations that improve the efficiency of dried conidia without additives are those containing as humectants sodium alginate in the fermentation bags, followed by those containing glycerol as a stabilizer in the fermentation bags, and methylcellulose and skimmed milk as adherents before drying. Moreover, control of vascular wilt of tomatoes by PO212 conidial formulations is related to the date of disease onset. Another way to further improve the effectiveness of biocontrol is to improve the active substance by SELECTION OF NEW STRAINS of P. oxalicum, which may have different levels of effectiveness. Of the 28 new strains of P. oxalicum tested in a culture chamber, only PO15 isolate shows the same effectiveness that PO212 (62-67 % of control) against tomato vascular wilt in cases of high disease pressure. Whereas in cases of low disease pressure all strains of P. oxalicum and its mixtures effective. Finally, we study extend the range of action of this BCA TO OTHER GUESTS AND OTHER PATHOGENS AND DIFFERENT DEGREES OF VIRULENCE. In efficacy trials of P. oxalicum against isolates of different aggressiveness of Verticillium spp. and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in tomato plants in growth chambers, shows that the efficiency of PO212 is negatively correlated with the level of disease caused by F. oxysporum f. sp. lycopersici. There is not differential effect in reducing the incidence or severity depending on the virulence of isolates. However, PO212 cause a greater reduction of disease in plants inoculated with virulent isolates media of V. dahlia. PO212 efficacy was also higher against isolates of high and average virulence of F. oxysporum f. sp. melonis and F. oxysporum f. sp. niveum in melon and watermelon plants, respectively. In both hosts the optimum dose of the BCA application is 107 conidia PO212 g-1 soil, applied on seedlings 7 days before transplantation into the field. Moreover, the reapplication of PO212 (2-4 times) to the roots by irrigation into the field improve efficiency of biocontrol. The efficacy of PO212 is not limited to vascular pathogens as those mentioned above, but also other pathogens such as Oomycetes (Phytophthora cactorum) and nematodes (Globodera pallida and G. rostochiensis). PO212 significantly reduces symptoms (50 %) caused by P. cactorum in strawberry nursery plants after application of BCA by dipping the roots before transplanting to soil in commercial nurseries. Moreover, the exposure of G. pallida and G. rostochiensis cysts to the conidia of P. oxalicum, in in vitro assays or in soil microcosms significantly reduces hatchability of eggs. The reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was greatest when root diffusates from the `Monalisa´ potato cultivar were used, followed by root diffusates from the `Désirée´ potato cultivar. However, no significant reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was found when root diffusates from the ‘San Pedro” tomato cultivar were used. For G. rostochiensis reduction in the juveniles hatching is obtained from the root diffusates 'Desirée' potato cultivar. Treatment with P. oxalicum also significantly reduces the number of cysts of G. pallida in pots. In order to optimize the practical application of P. oxalicum strain 212 as a biological soil treatment, it is essential to understand how the physical environment influences the BCA colonization, survival and growth, and the possible risk that can cause its application on other microorganisms in the ecosystem of performance. Therefore, the second objective of this thesis is the interaction of the BCA with the environment in which it is applied. Within this objective is evaluated the INFLUENCE OF TEMPERATURE, WATER AVAILABILITY AND PHYSICAL-CHEMICAL PROPERTIES OF SOILS (POROSITY, TEXTURE, DENSITY...) ON SURVIVAL AND GROWTH OF PO212 under controlled conditions to develop models for predicting the environmental impact of each factor on survival and growth of P. oxalicum and to know their ability to grow and survive in different environments. Two parameters are evaluated in the soil samples: i) the survival of Penicillium spp. by counting the number of colony forming units in semi-selective medium and ii) growth (biomass) of PO212 by real-time PCR. P. oxalicum grows and survives better in drought conditions regardless of temperature and soil type. P. oxalicum grows and survives more in sandy loam soils with low organic matter content, higher pH and lower availability of phosphorus and nitrogen. Survival and growth of P. oxalicum negatively correlates with the availability of water and positively with the organic content. Only survival also correlated positively with pH. Moreover, trials are carried out into commercial orchards soils with different physic-chemical properties and different environmental conditions TO STUDY THE ESTABLISHMENT, SURVIVAL, VERTICAL DISPERSION AND HORIZONTAL SPREAD OF PO212. P. oxalicum 212 can persist and survive at very low levels in soil one year after its release. The size of the PO212 population after its release into the tested natural soils is similar to that of indigenous Penicillium spp. Furthermore, the vertical dispersion and horizontal spread of PO212 is limited in different soil types. The introduction of P. oxalicum in a natural environment not only involves their action on the target organism, the pathogen, but also on other indigenous microorganisms. TO ASSESS THE EFFECT OF P. oxalicum APPLICATION ON SOIL INDIGENOUS FUNGAL COMMUNITIES in two commercial orchards, soil samples are analyzed by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis polyacrylamide (DGGE). Samples are taken from soil at two depths (5 and 10 cm) and four dates from the application of P. oxalicum 212 (0, 75, 180 and 365 days). DGGE analysis shows that differences are observed between sampling dates and are independent of the treatment of P. oxalicum applied and the depth. BCA application does not affect the fungal population of the two soil analyzed. Sequence analysis of the DGGE bands confirms previous findings and to identify the presence of BCA on soils. The presence of P. oxalicum in soil is especially related to environmental factors such as humidity. Therefore, we conclude that the 212 of strain Penicillium oxalicum can be considered an optimum BCA, since it is environmentally competitive and effective against a broad spectrum of diseases and does not have any negative effect on soil non-target fungi communities.

Repercusión medioambiental del uso de la cerámica estructural en España. Energía embebida y huella de carbono

La producción y el transporte a obra de los productos cerámicos de carácter estructural suponen un importante consumo energético, que conlleva la emisión de gases de efecto invernadero a la atmósfera. El objetivo de la presente Tesis es demostrar la existencia de importantes diferencias en el valor del impacto ambiental asociado a los productos de cerámica estructural fabricados en España, y que estas diferencias podrían quedar cuantificadas y reflejadas mediante un análisis de Huella de Carbono y de la Energía Embebida. Se parte de la inexistencia en España, de base de datos contrastada y consensuada, que establezca las cargas medioambientales en función del tipo de producto cerámico a utilizar. Se realiza en la primera parte del estudio una revisión del estado actual de la Huella de Carbono y la Energía Embebida en el campo de los materiales de construcción, y más concretamente en el sector de la cerámica estructural, que sirve para acotar los límites del estudio y justificar el objeto de la Tesis. La investigación se acota a las etapas de producción y transporte a obra de los productos (estudio cuna a puerta con opciones), al considerar que son éstas, a priori, las que tienen una mayor incidencia en el comportamiento ambiental del producto. Siguiendo los pasos definidos en la normativa aplicable (definición del mapa de procesos – límites y alcance – inventario – cálculo y evaluación), se establece un método específico de identificación y cuantificación de las variables que determinan la Huella de Carbono y Energía Embebida de los productos cerámicos, en función de la tipología de producto. La información necesaria (inventario) se obtiene principalmente con recogida de datos “in situ” de fábricas de productos cerámicos, lo que garantiza que la información tratada en este estudio es de primer nivel. La información se complementa/contrasta con fuentes bibliográficas. Se determinan 6 variables con influencia global en el impacto ambiental, 44 variables principales y 39 secundarias, estableciendo las fórmulas de cálculo a partir de dichas variables. Los resultados de cálculo y evaluación determinan que, para unas mismas condiciones de fabricación, las diferencias entre productos cerámicos llegan hasta un 27% para la Huella de Carbono y un 35% para Energía Embebida. La relevancia que alcanza el impacto asociado al transporte del producto a obra puede llegar hasta un 40% del total. El método de cálculo y las fórmulas desarrolladas se integran en una hoja de cálculo, para el cálculo de Huella de Carbono y Energía Embebida de los productos cerámicos, que permite, a su vez, conocer la repercusión medioambiental que tiene la introducción de modificaciones o innovaciones en el proceso de producción o transporte a obra. Así mismo, el trabajo desarrollado ha servido para poner en relieve una serie de problemas y falta de información en el campo de la cerámica estructural y el medioambiente que pueden ser objeto de futuras líneas de investigación, tanto para el sector de la edificación como para la comunidad científica, pudiendo implementar la metodología desarrollada en otras investigaciones. Se considera que la investigación realizada y sus resultados suponen una aportación importante para conocer y reducir el impacto ambiental de los edificios, desde la perspectiva del ciclo de vida y considerando que el impacto ambiental de un edificio comienza desde el momento en que se extraen las materias primas para la fabricación de los materiales con los que se construyen los edificios. ABSTRACT The production and transport of structural ceramic products involves an important energy consumption, which leads to the emission of greenhouse gases into the atmosphere. The objective of the research is to demonstrate the existence of significant differences in the value of the environmental impact of structural ceramic products manufactured in Spain, and these differences could be quantified by the Carbon Footprint and Embodied Energy. It starts from the absence in Spain, of contrasted and agreed databases that establish the environmental loads depending on the type of ceramic product. In the first part of the study reviews the current state of the Carbon Footprint and Embedded Energy in the field of building materials, and more specifically in the field of structural ceramics, which serves to limit the scope of the study and justify the purpose of this Thesis. The Research is bounded to production and transportation stages of (cradle to gate with options), considering they are the stages that have a greater impact on the environmental performance of the product. Following the steps defined in applicable rules (definition of process map - boundaries and scope – inventory analysis- calculation and impact assessment), it sets a specific method for the identification and quantification of the variables that determine the Carbon Footprint and Embedded Energy of structural ceramic products, depending on the type of product. The information (inventory) is given mainly with a data collection in ceramic factories (and in a consultation with the manufactures of the products), ensuring that the information handled in this Thesis is a first rate data. It is established 6 variables with a global influence in the environmental impact, 44 primary and 39 secondary variables, establishing calculation formula from these variables. The results of calculation and assessment determined that, for same manufacturing conditions, the differences between ceramic products reach 27% for Carbon Footprint and 35% for Embodied Energy. The relevance that reaches the impact of transport can reach 40% of the total. The method of calculation and formulas developed are integrated into a simple calculation tool, excel base, to calculate the Carbon Footprint and Embodied Energy of structural ceramic products, which allows, know the environmental impact of changes or innovations in the production process or transport to work. The work also has served to find a problems and gaps in the field of structural ceramics and the environment that may well be the subject of future research, both for the building sector to the scientific community, implementing the methodology developed in other research. It is considered that the research and its results represent an important contribution to understand and reduce the environmental impact of buildings from the perspective of the life cycle, considering that the environmental impact of a building starts from the time that the raw materials are extracted for the manufacture of building materials.

Concesión de explotación de granitos derivada del permiso de investigación “Honor de Miengo”

Este proyecto tiene por objeto el estudio de la viabilidad, tanto económica como técnica, de la apertura y explotación de una cantera de granito para su uso como roca ornamental. Para ello se ha seleccionado una zona de potencial interés en Santa Olalla del Cala (Huelva) debido a los afloramientos y la tonalidad de los mismos. En esta zona se ha realizado un estudio del medio físico y una investigación sobre los tipos de roca existentes en la superficie que comprende el Permiso de Investigación de la compañía minera Canteras Extremeñas S.L. Con todo ello, se han determinado varias áreas de interés en las que se podría realizar el emplazamiento de la cantera. Desde el punto de vista técnico, se ha definido el diseño de la cantera optando por un método de explotación combinando el Método Finlandés con el corte con hilo diamantado, proyectando a su vez una zona de emplazamiento para la futura escombrera temporal, teniendo en cuenta la realización de un estudio de impacto ambiental, plan de restauración, plan de vigilancia ambiental, explosivos y previsión de ejecución de las labores. El estudio realizado de los indicadores económicos nos muestra que el proyecto es rentable, con todo ello se concluye que, tanto técnica como económicamente, la explotación del recurso minero es viable. ABSTRACT This project aims to study the feasibility, both economic and technical, to the opening and operation of a granite quarry for use as an ornamental stone. For this we have selected an area of potential interest in Santa Olalla del Cala (Huelva) due to upwelling and tonality of these. In this area, it has made a study of the physical environment and an investigation into the types of rock on the surface comprising the Research Permit of the mining company Canteras Extremeñas SL. With all this, we have identified several areas of interest in which they could make the location of the quarry. From the technical point of view, we have defined the design of the quarry opting for a mining method combining the Finnish Method with the diamond wire cutting, projecting turn an area of the site for future temporal tip, taking into account the completion of an environmental impact, restoration plan, environmental monitoring plan, explosives and forecasting operations execution. The study of economic indicators shows that the project is profitable, yet it can be concluded that, both technically and economically, exploitation of mineral resources is viable.

Aislamiento acústico a ruido aéreo en techos con materiales ecológicos

El incremento de la contaminación acústica se ha convertido en un problema medioambiental lo cual ha generado un aumento en la demanda del aislamiento de los edificios para lograr el confort acústico. Existen métodos de medición de aislamiento acústico a ruido aéreo de fachadas bajo ensayo “in situ” pero no para techos. El objetivo de esta investigación consiste en determinar el aislamiento acústico de prototipos de techos ecológicos multicapas adaptando la metodología recomendada por normas internacionales. Se propusieron cuatro prototipos de techos con distintos materiales naturales como especies vegetales y sustratos de fibra de coco, superpuestos sobre un techo base liviano. Al sustrato se le varió su espesor de 10 a 20 cm, sus condiciones seca o húmeda y su densidad: 100%, 66% y 33% fibra de coco. En los resultados se determinó que las especies vegetales no aportaron aislamiento, pero al incrementar el espesor y densidad del sustrato mejoró el aislamiento sonoro. También se determinó que el aislamiento acústico en condición seca fue mejor que en condición húmeda. Se planteó una metodología para determinar el aislamiento acústico a ruido aéreo en techos bajo ensayo “in situ” empleando el método global con altavoz, ésta se estructuró en tres partes: la primera describe el módulo experimental y la plataforma tecnológica; la segunda aborda procedimientos para medir los niveles de presión sonora, niveles de ruido de fondo y los tiempos de reverberación, en bandas de frecuencia de tercios de octava; en la tercera se explica el cálculo de los promedios de estos parámetros, así como también la diferencia de niveles estandarizada, el índice de reducción sonora aparente con sus valores globales y su incertidumbre. Así mismo, se determinó un algoritmo de predicción del aislamiento acústico, analizando los valores obtenidos en las mediciones “in situ” como la Diferencia de nivel estandarizada ponderada y el Índice ponderado de reducción sonora, los cuales se relacionaron con el peso y el espesor de los materiales de las diferentes multicapas. A través de un análisis de regresión se establecieron modelos para predecir la Diferencia de nivel estandarizada y el Índice de reducción sonora aparente en bandas de octavas. Los resultados del modelo propuesto son cercanos a los datos medidos “in situ”. Por otra parte, se realizaron mediciones térmicas en un módulo experimental y otro de referencia en tres períodos del día. En el módulo experimental se construyeron los prototipos de techos ecológicos y en el de referencia un techo de construcción tradicional, se compararon los resultados de ambos módulos y su interacción con la temperatura exterior. Se detectó que las temperaturas internas del módulo experimental en condición seca tienden a mantener sus valores durante todo el día, en horas de la mañana sus valores son superiores a los del módulo de referencia y temperatura exterior. Al mediodía y en la tarde las temperaturas internas del módulo experimental son inferiores a las del módulo de referencia, incrementándose esta última a medida que aumenta temperatura exterior. Finalmente, a partir de las mediciones “in situ” se realizaron cuatro modelos de correlación acústica-térmica, los tres primeros relacionando la temperatura y el nivel de presión sonora en tres momentos del día, en la tarde se aprecia que a medida que aumenta la temperatura aumentan los niveles de presión sonora. En el cuarto modelo se estableció una correlación acústica-térmica entre la resistencia térmica de los materiales de las multicapas con su índice de reducción sonora, obteniéndose un coeficiente de correlación moderado. La presente investigación plantea retos desde el punto de vista ambiental, permite cuantificar el aislamiento acústico de los techos y mejorar la calidad de vida en áreas urbanas; el empleo de los materiales de procedencia local como los utilizados fomenta el respeto por la naturaleza y producen un menor impacto ambiental. ABSTRACT Sound contamination increase has generated a raise in insulation demand of buildings in order to achieve a sound comfort, and this has become into an environmental problem. There are measurements methods for air borne soundproofing in facades through “in situ” test but there are not for roofs. The purpose of this research is to determine sound insulation of multilayer green roof prototypes following the methodology suggested by international standards. Four prototypes of roofs with different types of vegetation and overlapped coconut fiber substrates over a light roof were proposed. Thickness of substrate varied from 10 to 20 cm, as well as its dry a humid condition and its density: 100%, 66% y 33% of coconut fiber. Results determined that vegetation did not contribute to insulation but when increasing substrate’s thickness and density, sound insulation was improved. Likewise, it was determined that sound insulation in dry condition was greater than in humid condition. A methodology to determine airborne sound insulation in roofs through “in situ” test using a speaker global method was stated. This was structured in three parts: the first part describes the experimental module and the technological platform; the second one establishes the procedures to measure sound pressure levels; levels of background noise and time of reverberation in frequency bands of thirds of octave, and in the third part, averages of these parameters, as well as the difference of standardized levels, the apparent sound reduction with its global values and uncertainty were calculated. Likewise, a prediction algorithm of sound insulation was determined by analyzing values obtained in “in-situ” measures such as the difference of weighted standardized level and the weighted index of sound reduction which they were related to weight and thickness of different multilayer materials. Models to predict the standardized level difference and the apparent sound reduction index in bands of octaves were established by a regression analysis. Results for the proposed model are close to data measured “in situ”. On the other hand, thermal measures were done in an experimental module, as well as in another as for reference in three periods of the day. Green prototypes roofs were built in the experimental module and a traditional roof were built in the reference one. Results of both modules were compared as well as the interaction with outside temperature. Internal temperatures of the experimental module in dry condition tend to keep their values throughout the day; in the morning, its values are higher than those of the reference module and external temperatures. Finally, four models of sound-thermal correlation were done from measures “in situ”. The first three were related to temperature and sound pressure level in three moments of the day. In the afternoon, it is observed that when temperature increases, sound pressure levels increases too. In the fourth model, a sound and thermal correlation was established between thermal resistance of multilayer materials with their sound reduction index, and a moderated correlation coefficient was obtained. This research poses challenges from the environmental point of view, and it allows quantifying sound insulation of roofs as well as improving quality of life in urban areas; the use of local vegetation promotes respect for nature and it produces a smaller environmental impact as well.