Cabeza de Hierro: un monte privado, ordenado y ejemplo de multifuncionalidad.

El monte “Cabeza de Hierro”, masa natural de pino silvestre, es un ejemplo de gestión forestal sostenible y de uso múltiple, y reúne ciertas particularidades que hacen muy interesante su caso. Monte privado, ha sido objeto de aprovechamientos madereros al menos desde su adquisición por sus actuales propietarios en 1840. Está ordenado desde 1957. La madera obtenida, de gran calidad, es transformada en su mayor parte en un aserradero cercano de los mismos propietarios. Generador de un considerable número de puestos de trabajo, ha tenido gran importancia en la economía local. Además de la producción de madera ha cumplido y cumple muy eficazmente numerosas funciones ecológicas y ambientales, entre las que podemos destacar la regulación del ciclo hidrológico y la protección frente a la erosión, la generación de un paisaje de gran belleza y el mantenimiento de la biodiversidad; en este sentido destacamos la presencia de una colonia nidificante de buitre negro de reconocida importancia mundial. Fue el primer caso de aplicación en España de los métodos de ordenación de tramo móvil y selvícola. En la tercera revisión de su ordenación, recientemente aprobada, se propone su gestión mediante entresaca regularizada, con cortas por bosquetes, con lo que se pretende mantener la actual estructura de masa irregular por cantones. A continuación se resumen las principales características del monte y las principales propuestas de gestión de su tercera revisión.

Análisis de parámetros de fendas para la estimación de las propiedades mecánicas de vigas de madera de Pinus sylvestris L. Analysis of parameters for assessing drying fissures to estimate their influence on the mechanical properties of Pinus sylvestris L. wooden beams

El principal objetivo de este estudio es evaluar la influencia de las fendas de secado en las propiedades mecánicas de vigas de madera. Para esto, se utilizan 40 vigas de Pino silvestre (Pinus sylvestris L) de 4200 mm de longitud y 150x200 mm de sección que fueron ensayadas según norma EN 408. Las fendas se registran detalladamente atendiendo a su longitud y posición en cada cara de la viga, y midiendo el espesor y la profundidad cada 100mm a lo largo de la viga. Solo el 10% de la muestra es rechazada por las fendas, según los criterios establecidos por la norma española de clasificación visual UNE 56544. Para evaluar la influencia de las fendas en las propiedades mecánicas, se usan tres parámetros globales basados en el área, el volumen o la profundad de la fenda, y dos locales basados en la profundidad máxima y la profundidad en la zona de rotura. Además se determina la densidad de las piezas. Estos parámetros se comparan con las propiedades mecánicas (tensión de rotura, módulo de elasticidad y energía de rotura) y se encuentra escasa relación entre ellos. Las mejores correlaciones se encuentran entre los parámetros relacionados con la profundidad de las fendas, tanto con el módulo de elasticidad como con la tensión de rotura. The aim of this study is the evaluation of the influence of drying fissures on the mechanical properties of timber beams. For that purpose, 40 sawn timber pieces of Scots pine (Pinus sylvestris L.) with 150x200 mm in cross-section and 4200 mm in length have been tested according to EN 408, obtaining MOR and MOE. The fissures were registered in detail measuring their length and position in each face of the beam, and the thickness and depth every 100 mm in length. Only 10 % of the pieces were rejected because fissures, according to UNE 56544 Spanish visual grading standard. To evaluate the influence of fissures in mechanical properties three global parameters: Fissures Area Ratio or ratio between the area occupied by fissures and the total area in the neutral axis plane of the beam; Fissures Volume Ratio or ratio between volume of fissures and the total volume of the beam; Fissures Average Depth and two local parameters were used: Fissures Maximum Depth in the beam, and Fissures Depth in the broken zone of the beam. Also the density of the beams was registered. These parameters were compared with mechanical properties (tensile strength, elasticity modulus, and rupture energy) and the relationship between them had not been founded. The best relationship was founded between the elasticity modulus y the tensile strength with the parameters which included the depth of the fissures.

Validez del coeficiente de amplificación dinámica como herramienta para predecir el comportamiento de tablas de madera sometidas a acciones de impacto

Las tablas de madera se emplean usualmente en construcción como parte integrante de protecciones colectivas y medios auxiliares. En estos usos, las cargas a que están sometidas son fundamentalmente de tipo dinámico y suelen aplicarse en forma de impacto. Para estas aplicaciones, en la mayoría de las ocasiones, trabajan colocadas de cara. El coeficiente de amplificación dinámica se ha usado desde hace decenios para evaluar analíticamente elementos sometidos a impacto. Sin embargo, la obtención de este coeficiente se basa en unas hipótesis que en ocasiones se alejan de la realidad. En este trabajo se han sometido a distintos tipos de impacto tablas de madera aserrada de pino silvestre, colocadas de cara, y se han comparado los resultados obtenidos con el comportamiento analítico previsto en base al empleo del coeficiente de amplificación dinámica.

Comparación del comportamiento de sistemas provisionales de protección de borde sometidos a cargas estáticas

En este trabajo se compara el comportamiento frente a cargas estáticas de sistemas provisionales de protección de borde (SPPB) fabricados con postes de tubo de acero y barandillas de dos tipos: de tubo acero y de tablas de madera de pino silvestre. Se han evaluado según la norma UNE-EN 13374 “Sistemas Provisionales de Protección de Borde. Especificaciones del producto. Métodos de ensayo” para sistemas clase A, obteniendo los diagramas carga-desplazamiento en los ensayos de flecha y de resistencia. Los resultados muestran que una parte importante de los SPPB, utilizados en las obras de construcción, no son capaces de superar los requisitos de la norma UNE-EN 13374 cuando se evalúan experimentalmente. Asimismo, para una luz entre postes de 2400 mm, los requisitos de flecha indicados por la norma son más exigentes que los requisitos de resistencia para los SPPB ensayados

Bases moleculares de la resistencia a insecticidas en la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis Capitata (Wiedemann)

La mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) está considerada una de las plagas clave para la fruticultura. El malatión es un insecticida organofosforado que fue empleado mayoritariamente en España para el control de C. capitata hasta 2009, año en el que dejó de utilizarse por no estar incluido en el anexo I de la Directiva Europea 91/414/ECC. El incremento del uso del malatión, debido a las graves pérdidas económicas causadas por C. capitata, provocó la aparición de poblaciones de campo resistentes. El estudio de una población resistente a malatión, recogida en Castelló en 2004, permitió la identificación de dos mecanismos de resistencia: una mutación puntual (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE) y un mecanismo de resistencia metabólica, probablemente mediado por carboxilesterasas. Teniendo en cuenta estos antecedentes, nos propusimos estudiar los mecanismos implicados en la resistencia a malatión en C. capitata. Además, durante el desarrollo de esta Tesis, el malatión fue sustituido por otros insecticidas como el espinosad y la lambda-cialotrina para el control de la plaga. En este nuevo contexto, es extremadamente importante analizar la susceptibilidad de poblaciones de campo frente a espinosad y estudiar la posible existencia de resistencia cruzada a estos insecticidas, así como sentar las bases para el estudio de futuros mecanismos de resistencia. En primer lugar, analizamos mediante bioensayos con dosis discriminante la susceptibilidad a malatión y espinosad en doce poblaciones de C. capitata de Andalucía, Aragón, Cataluña, Comunidad Valenciana e Islas Baleares; y nuestros resultados sugirieron la presencia de individuos resistentes a malatión en la mayoría de las poblaciones analizadas. En el caso del espinosad, observamos que la susceptibilidad a este insecticida de origen biológico fue elevada en la mayoría de las poblaciones, sin embargo, la población recogida en Xàbia (Alicante) mostró un nivel de susceptibilidad unas dos veces menor al resto de poblaciones. Mediante la selección en laboratorio, obtuvimos dos líneas resistentes a malatión, W-4Km y W-10Km, con unos niveles de resistencia con respeto a la línea susceptible C de 178 y 400 veces, respectivamente. Además, se seleccionó por primera vez en C. capitata una línea altamente resistente a espinosad (Xàbia-W-100s), que actualmente es unas 500 veces más resistente que la línea de laboratorio C. Con el objetivo de escoger la estrategia más adecuada para el manejo de la plaga, estudiamos la susceptibilidad a diferentes tipos de insecticidas en la línea resistente a malatión W- 4Km. En esta línea detectamos resistencia cruzada moderada a los organofosforados fentión, diazinón, fosmet, triclorfón y metil-clorpirifos (de 7 a 16 veces) y frente al carbamato carbaril, al piretroide lambda-cialotrina y al quimioesterilizante lufenurón (de 4 a 6 veces). Por otra parte, la resistencia cruzada frente a espinosad fue baja (1,5 veces). Es importante destacar que los niveles de resistencia estimados frente a todos los insecticidas fueron de uno o dos órdenes de magnitud inferiores al observado en la línea W-4Km frente a malatión (178 veces), hecho que podría deberse, al menos, a dos posibles hipótesis: que la mutación AChE G328A confiera mayor insensibilidad al malaoxón (forma activa del malatión) que a otros insecticidas que tienen como diana la AChE y/o, en segundo lugar, que el mecanismo de resistencia mediado por carboxilesterasas hidrolice el malatión de manera más eficiente que los otros insecticidas analizados. En el estudio de nuevos mecanismos de resistencia en C. capitata, por un lado, analizamos la diversidad de enzimas citocromo P450, asociadas con resistencia metabólica en otras especies, y por otro lado, desarrollamos un sistema para la detección de nuevas mutaciones puntuales que pudiesen aparecer en los genes que codifican la AChE (Ccace2) y la aliesterasa (Ccae7). Mediante el empleo de cebadores degenerados obtuvimos 37 genes CYP, que codifican enzimas P450, pertenecientes a cinco familias. Posteriormente, en un estudio de inducción con fenobarbital, observamos que la expresión de cuatro de los seis genes analizados era susceptible de ser inducida. Por otro lado, se puso a punto un sistema que permite amplificar y secuenciar, a partir de DNA genómico, los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 en los que se han encontrado mutaciones relacionadas con resistencia a insecticidas en otras especies. Los resultados obtenidos facilitarán el estudio de nuevos mecanismos de resistencia mediados por estas enzimas en C. capitata. Se diseñó un método PCR-RFLP para identificar los individuos portadores de la mutación AChE G328A (alelo de resistencia Ccace2R) sin la necesidad de realizar bioensayos y que, además, permite detectar resistencia cuando ésta se encuentra a baja frecuencia. Según el análisis realizado, el alelo Ccace2R se observó en 25 de las 27 localidades españolas muestreadas en el territorio español, incluyendo las Islas Baleares y Canarias. Sin embargo, este alelo no se detectó en poblaciones procedentes de once países y de cinco continentes. El análisis de la presencia del alelo Ccace2R en las líneas resistentes a malatión durante el proceso de selección en el laboratorio mostró una rápida disminución de los homocigotos, tanto para el alelo susceptible como para el alelo de resistencia, en favor de los individuos heterocigotos. Así, después de 52 generaciones de selección, se observó que la totalidad de los individuos analizados de la línea W-10Km presentaban un genotipo heterocigoto para la mutación AChE G328A. Este desequilibrio contradice la segregación mendeliana esperada para un gen con dos alelos pero podría ser explicado por la existencia de una duplicación del gen Ccace2. La demostración de la presencia de esta duplicación se realizó mediante: i) el cruzamiento de individuos heterocigotos de la línea W-10Km con homocigotos susceptibles de la línea C, que dio lugar a una descendencia en la que el 100% de los individuos eran heterocigotos; ii) la evaluación del número de copias del gen Ccace2 por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), que resultó dos veces mayor en individuos de la línea W-10Km en comparación con los de la línea C; iii) el análisis del nivel de expresión de Ccace2, que fue el doble en la línea W-10Km con respecto a la línea C, y iv) el estudio de la actividad AChE, que resultó mayor en los individuos de la línea W-10Km. Según los resultados obtenidos, una duplicación del gen Ccace2 provoca la coexistencia en un mismo cromosoma del alelo silvestre y del alelo mutado y, además, las dos copias del gen Ccace2, al estar ligadas, producen una heterocigosis permanente (Ccace2RS). De esta manera se explica que el hecho de que 100% de los individuos de la línea W-10Km mostrasen un perfil de restricción correspondiente a un individuo heterocigoto ya que, en realidad, eran homocigotos estructurales para la duplicación (genotipo CCace2RS/RS). Se ha detectado un coste biológico asociado a la duplicación que consiste en un incremento en la mortalidad acumulada de los adultos a partir del séptimo día después de la emergencia. La descripción de la duplicación Ccace2RS supone la identificación de un nuevo mecanismo de resistencia a malatión en C. capitata. Finalmente, mediante el diseño de un método de doble PCR-RFLP se determinó la presencia de la duplicación Ccace2RS en la mayoría de las poblaciones españolas. La proporción de individuos portadores de la duplicación osciló entre el 5% y el 35%, observándose los mayores valores de frecuencia en las poblaciones de C. capitata recogidas en la cuenca mediterránea. Podemos por lo tanto concluir que la resistencia a malatión asociada a la mutación AChE G328A y a la duplicación Ccace2RS está ampliamente establecida en las poblaciones españolas de C. capitata. Nuestros resultados desaconsejan la utilización del malatión (si fuera de nuevo autorizado) o de otros organofosforados para el control de esta plaga. Además, una de las líneas resistentes a malatión mostró resistencia cruzada frente a insecticidas con diferentes modos de acción y que se utilizan actualmente para el control de C. capitata, tales como lambda-cialotrina y lufenurón. La alta susceptibilidad a espinosad observada en las poblaciones españolas, así como la reducida resistencia cruzada estimada para este insecticida, sugieren que su utilización es adecuada para el control de la plaga. Sin embargo, la utilización de un sólo insecticida puede entrañar riesgos por favorecer la selección de resistencia, de hecho, mediante selección en laboratorio se obtuvo una población altamente resistente a espinosad. Por tanto, es recomendable implementar programas de control integrado y de manejo de la resistencia en C. capitata utilizando distintos sistemas de control e insecticidas con diferentes mecanismos de acción que permitan su sostenibilidad en el tiempo. Los sistemas de detección de alelos de resistencia desarrollados en este trabajo permitirán la detección precoz de resistencia en campo, facilitando la decisión sobre el sistema de control más adecuado. Además, los conocimientos generados podrán contribuir al desarrollo de nuevos sistemas de detección para otros mecanismos de resistencia. Abstract. The Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824), is considered one of the most harmful pests in fruit crops. Until 2009, when malathion use was banned due to its not inclusion in the Annex I of Directive 91/414/EEC, the application of this organophosphate (OP) insecticide in Spain increased gradually due to the large economic losses caused by C. capitata. The increase in the frequency of treatments resulted in the development of resistant field populations. The study of a malathion-resistant population, collected in 2004 in Castelló (Comunidad Valenciana), allowed the identification of two resistance mechanisms: a single point mutation (G328A) in the target acetylcholinesterase (AChE), as well as a metabolic resistance mechanism, most likely carboxylesterase-mediated. Taking all the preceding into account, we studied the malathion resistance mechanisms in C. capitata. During the development of this PhD Thesis malathion use was banned by the European Union, being replaced by other insecticides, such as spinosad and lambda-cyhalotrin. Within this new working frame, the need to analyse the possible existence of cross-resistance to these insecticides and the susceptibility to spinosad in field populations was raised. This would define the baseline for future studies on resistance mechanisms. Firstly, through discriminant dose bioassays, we analysed malathion and spinosad susceptibility in twelve C. capitata populations from Andalucia, Aragon, Cataluña, C. Valenciana and the Baleares Islands. Our results suggest the presence of malathion-resistant individuals in most of the populations analysed. Regarding spinosad, we noticed a high susceptibility to this biologically derived insecticide in most of the populations, but in the one collected in Xabia (Alicante), which had a susceptibility level two times lower than the rest of populations. Through laboratory selection, we obtained two malathion-resistant strains, W-4Km and W-10Km, with resistance levels 178- and 400-fold, respectively, compared to the control susceptible C strain. Besides, a strain highly-resistant to spinosad (Xabia-W-100s), 500-times more resistant than control C strain, was selected. In order to decide the most appropriate management strategy for the pest, we studied the susceptibility to different insecticides in the malathion-resistant W-4Km strain. We detected a moderated cross-resistance to the OPs fenthion, diazinon, phosmet, trichlorphon and methylchlorpyrifos (7- to 16-fold), and to the carbamate carbaryl, the pyretroid lambda-cyhalotrin and the chemosterilizer lufenuron (4- to 6-fold). On the other hand, cross-resistance to spinosad was low (1.5-fold). It is important to note that resistance levels to all insecticides were one or two orders of magnitude less than that observed against malathion in W-4Km strain (178-fold), a fact that might be due to, at least, two possible causes: mutation AChE G328A may provide a higher insensitivity to malaoxon (the active form of malathion) than to other insecticides having AChE as target, and/or, secondly, the carboxylesterase-mediated resistance mechanism hydrolyzes malathion more efficiently than all other analysed insecticides. To investigate new resistance mechanisms in C. capitata we analysed the diversity of the cytochrome P450 enzymes, which have been associated to metabolic resistance in insects, and we developed a new method to detect single point mutations in acetylcholinesterase (Ccace2) and aliesterase (Ccae7) genes that could appear. Using degenerate primers we obtained 37 CYP genes, coding P450 enzymes, included in five families. Afterwards, in a phenobarbital-induction study, we observed that the expression of 4 out of the 6 analysed genes could be induced. On the other hand, a system was set up to amplify and to sequence from genomic DNA the exons of genes Ccace2 and Ccae7 where mutations related to insecticide resistance have been found in other species. The results obtained could facilitate the study of new resistance mechanisms in C. capitata mediated by these enzymes. A PCR-RFLP method was designed to detect the presence of the mutation AChE G328A (resistance allele Ccace2R), with no need to perform bioassays and allowing detecting resistance at low frequency. According to the analysis, the resistance allele was found in 25 out of 27 sampled locations in Spain, including the Balearic and the Canary Islands. However, this allele was not detected in other populations collected in 11 countries from 5 continents. The follow-up of the presence of the allele Ccace2R in the malathion-resistant strains during the selection process in the laboratory showed a quick decrease in homozygous individuals, for both the susceptible and the resistant alleles, favouring heterozygous. Thus, after 52 generations of selection, all the individuals analysed from W-10Km strain showed a heterozygous genotype for mutation AChE G328A, contradicting mendelian segregation as expected for a gene with two alleles. Afterwards, we were able to demonstrate that this was caused by the presence of a duplication of the gene coding acetylcholinesterase by: i) crossing heterozygous individuals from W-10Km strain with susceptible homozygous from C strain, originating a F1 population in which 100% of individuals were heterozygous; ii) evaluating the number of copies of gen Ccace2 by quantitative PCR in real time (qPCR), that happened to be twice higher in individuals from W-10Km VII strain when compared with C strain; iii) analysing the level of expression of Ccace2, twice in W- 10Km strain when compared to C strain; iv) studying the acetylcholinesterase activity, that was higher in individuals from W-10Km strain. According to these results, duplication of gen Ccace2 originates the coexistence of the susceptible and the resistant allele in the same chromosome. The two linked copies of the gene Ccace2 provoke the existence of permanent heterozygosis (Ccace2RS). This explains why the 100% of individuals from W-10Km strain showed an heterozygous restriction pattern since, in fact, they were structural homozygotes for the duplication (genotype Ccace2RS/RS). A biological cost has been detected associated to this duplication, consisting in a rise in accumulated adult mortality from the seventh day after emergence. The Ccace2RS duplication described in this study represents a new resistance mechanism to malathion in C. capitata. Finally, by the design of a double PCR-RFLP method, the presence of Ccace2RS duplication was confirmed in most of the Spanish populations. We observed that the proportion of individuals carrying the duplication oscillated between 5 and 35%, the frequency being higher in those C. capitata populations collected in the area of the Mediterranean basin. Therefore, we can conclude that malathion resistance associated to mutation AChE G328A and to Ccace2RS duplication are widely distributed in Spanish populations of C. capitata. Our results advice against the use of malathion (if it came to be newly authorized for use) or other OPs for the control of this pest. Besides, one of the malathion-resistant strains showed cross-resistance against insecticides with diverse action modes that are currently used for pest control, such as lambdacyhalotrin and lufenuron. High susceptibility to spinosad in the Spanish populations, as well as the reduced cross-resistance estimated for this insecticide suggests its adequacy for Medfly control. However, the use of a single insecticide is a risky strategy since it favours the selection of resistance. In fact, a population highly resistant to spinosad was obtained through laboratory selection. Therefore, it is advisable to implement integrated pest management (IPM) and resistance management programs for C. capitata control. Using insecticides with different modes of action and diverse control systems would contribute to the sustainability of the pest control. The resistance allele detection systems developed through this work will allow the early detection of resistance in the field, making possible the selection of the most appropriate method for pest control. Besides, the generated knowledge may also contribute to the development of new detection systems for other resistance mechanisms.

Caracterización molecular del mutante riso 1508 de cebada : modificaciones transcripcionales y posttranscripcionales en el desarrollo de la semilla

La semilla es el principal órgano reproductivo de las plantas espermatofitas, permitiendo la dispersión de las poblaciones y asegurando su supervivencia gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad para germinar bajo condiciones ambientales óptimas. El rendimiento y valor económico de los cereales, que constituyen la primera cosecha mundial, depende, en buena medida, de la eficacia con que se acumulan en la semilla sustancias de reserva: proteínas, carbohidratos y lípidos. El principal carbohidrato acumulado en la semilla de cebada es el almidón y la fracción mayoritaria de proteínas es la de las prolaminas (solubles en etanol al 70%); estas proteínas tienen muy bajo contenido en lisina, un aminoácido esencial en la dieta de animales monogástricos. Con el fin de mejorar el valor nutricional de la semilla de cebada, se han obtenido diferentes mutantes con un mayor contenido en este aminoácido. Riso 1508 es un mutante de cebada rico en lisina cuya mutación lys3a, de efectos pleiotrópicos, segrega como un único gen mendeliano. Entre otros, presenta una reducción drástica de la expresión de algunos genes que codifican proteínas de reserva de tipo prolamina, en concreto, presenta reducida la expresión de los genes que codifican B-, C- y ϒ-Hordeínas y del inhibidor de tripsina CMe, pero no tiene alterada la expresión del gen que codifica las D-Hordeínas. Este último gen carece en su promotor del motivo GLM (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), que es reconocido por factores transcripcionales bZIP. En este trabajo, el mutante de cebada Riso 1508 se ha utilizado como herramienta para profundizar en el conocimiento de la regulación génica en semillas durante las fases de la maduración y la germinación. Para ello, en una primera aproximación, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparando el genotipo mutante con el silvestre durante la maduración de la semilla. Además de confirmar variaciones en los genes que codifican proteínas de reserva, este análisis indicó que también estaban afectados los genes relacionados con metabolismo de carbohidratos. Por ello se decidió caracterizar la familia multigénica de sacarosas sintasa (SUSy) en cebada. Se anotaron dos nuevos genes, HvSs3 y HvSs4, cuya expresión se comparó con la de los genes HvSs1 y HvSs2, previamente descritos en el laboratorio. La expresión de los cuatro genes en tejidos diferentes y su respuesta a estreses abióticos se analizó mediante RT-qPCR. HvSs1 y HvSs2 se expresaron preferencialmente durante el desarrollo del endospermo, y HvSs1 también fue un tránscrito abundante durante la germinación. HvSs1 se indujo en hojas en condiciones de anoxia y HvSs3 por estrés hídrico, y ambos genes se indujeron por tratamientos de frío. La localización subcelular de las cuatro isoformas no fue sólo citoplásmica, sino que también se localizaron en zonas próximas a retículo endoplásmico y en la cara interna de la membrana plasmática; además, se observó una co-localización de HvSS1 con el marcador de mitocondrias. Estos datos sugieren un papel distinto aunque parcialmente solapante de las cuatro Sacarosa Sintasas de cebada, descritas hasta la fecha. Las cinéticas de expresión de los genes que codifican los TFs más importantes implicados en la regulación génica durante el desarrollo del endospermo de cebada, se analizaron por RT-qPCR en ambos genotipos, demostrando que los TFs de la clase DOF aparecieron desregulados durante todo el proceso en Riso 1508 comparado con el cv. Bomi, aunque también se observaron diferencias significativas en algunos de los que codifican bZIPs. Estudios previos indicaban que el ortólogo de BLZ2 en maíz, O2, se regula post-traduccionalmente mediante un mecanismo de fosforilación/defosforilación reversible, y que la forma defosforilada es la fisiológicamente activa. En este trabajo se demostró que BLZ2 está sujeto a este tipo de regulación y que la proteín-fosfatasa HvPP2C2 está implicada en el proceso. La interacción de HvPP2C2 y BLZ2 tiene lugar en el núcleo celular únicamente en presencia de 100 μM ABA. En el mutante Riso 1508, BLZ2 se encuentra en un estado hiperfosforilado tanto durante la maduración como durante la germinación de la semilla, lo que dificultaría la unión de BLZ2 a las secuencias GLM en los promotores de los genes que codifican B-, C-,y ϒ- Hordeínas y CMe. Summary The seed is the main reproductive organ of spermatophyte plants allowing the spread of populations and ensuring their survival through its desiccation tolerance and because of their ability to germinate under optimum environmental conditions. Yield and economic value of cereal crops, that constitute the first world crop, depend largely on the efficiency with which they accumulate in the seed reserve substances: proteins, carbohydrates and lipids. The main carbohydrate accumulated in the barley seed is starch and the major protein fraction is that of prolamins (soluble in 70% ethanol); these proteins have a very low lysine content, an essential amino-acid for the diet of monogastric animals. In order to improve the nutritional value of the barley seed, different mutants have been obtained with a higher content of this amino-acid. Riso 1508 is one lysine-rich mutant whose mutation (lys3a) segregates as a single Mendelian gene with pleiotropic effects, such as a drastic reduction of genes encoding the trypsin inhibitor CMe and the B-, C-and ϒ-hordeins, but has not altered the expression of the gene encoding the D-hordeins. This latter gene lacks in its promotor the GLM motif (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), that is recognised by bZIP transcription factors In this work we have used the barley mutant Riso 1508 as a tool for better understanding gene regulation in seeds during the maturation and germination phases. To this aim, a transcriptomic analysis was performed comparing wild and mutant genotypes during seed maturation. Besides confirming variations in the expression of genes encoding reserve proteins, this analysis indicated that some genes related with carbohydrate metabolism were also affected. It was therefore decided to characterize the multigene family of sucrose synthases (SUSy) in barley. Two new genes were annotated, HvSs3 and HvSs4, and its expression was compared with that of genes HvSs1 and HvSs2, previously described in our laboratory. The expression of the four genes in different tissues and in response to abiotic stresses was analyzed by RTqPCR. HvSs1 and HvSs2 were preferentially expressed during the development of the endosperm, and the HvSs1 transcript was also abundant upon germination. HvSs1 was induced in leaves by anoxic conditions, HvSs3 by water stress, and both genes were induced by cold treatments. The subcellular localization of all four isoforms was not only cytoplasmic, but they could be found along the endoplasmic reticulum and at the inner side of the cell membrane; HvSS1, was also associated with the mitochondrial marker. These data suggest a distinct but partially overlapping roles for the barley sucrose synthases, described so far. The expression kinetics of the genes encoding the most important TFs involved in gene regulation during barley endosperm development was analyzed by RT-qPCR in both genotypes. These data show that the genes encoding DOF TFs were mis-regulated throughout the process in Riso 1508, although significant differences were also found among some of those encoding bZIPs. Previous studies indicated that the BLZ2 orthologue in maize, O2, was post-translationally regulated by reversible phosphorylation/dephosphorylation and that the dephosphorylated protein is the physiologically active form. In this work we demostrate that BLZ2 is under a similar regulation and that the proteinphosphatase HvPP2C2 is implicated in the process. The interaction between HvPP2C2 and BLZ2 takes place in the cell nucleus only in the presence of 100 μM ABA. In the Riso 1508 mutant, BLZ2 is found in a hyperphosphorylated state in the maturation phase and upon seed germination; because of this, the BLZ2 binding to the GLM promoter sequences of genes encoding B-, C- y ϒ- Hordeins and CMe would be decreased in the mutant.

Clasificación de madera estructural de gran escuadría de Pinus sylvestris l. mediante métodos no destructivos

Esta Tesis Doctoral aborda el estudio de algunas técnicas no destructivas para la clasificación de madera de pino silvestre (Pinus sylvestris L.) de procedencia española y de gruesa escuadría para uso estructural. Para la estimación del módulo de elasticidad y de la resistencia se han aplicado técnicas basadas en la propagación de una onda a través de la madera: onda de ultrasonidos (Sylvatest) o de impacto (Microsecond Timer) en dirección longitudinal, o vibración en dirección longitudinal y transversal (PLG). Para la estimación de la densidad se han utilizado métodos puntuales basados en el penetrómetro (Pilodyn) y en la resistencia al arranque de un tornillo. Las variables obtenidas han sido relacionadas con los resultados de la clasificación visual y con las propiedades de la madera determinadas mediante ensayo mecánico. Además, se ha estudiado la influencia de la humedad de la madera en la velocidad de propagación de la onda para definir factores de corrección a los equipos comerciales utilizados en esta Tesis Doctoral. La muestra de estudio está formada por 244 piezas procedentes de El Espinar, Segovia, con dimensiones nominales 150 x 200 x 4000 mm (218 piezas) y 100 x 150 x 3000 mm (26 piezas). De todas las piezas se tomaron datos de dimensiones, contenido de humedad y clasificación visual según la norma UNE 56544. En las primeras 218 vigas se aplicaron las técnicas de ultrasonidos, onda de impacto y vibraciones, se determinó la densidad de cada pieza completa y se ensayaron según la norma UNE-EN 408 para obtener el módulo de elasticidad global (en todos los casos) y local (en un porcentaje), así como de la tensión de rotura. Se extrajeron tres rebanadas para los ensayos puntuales y para el cálculo de la densidad. En las otras 26 piezas se repitieron los ensayos (transmisión de onda, vibración y clasificación visual) durante el proceso de secado natural, desde que la madera se encontraba húmeda (en torno al 40 %) hasta la humedad de equilibrio higroscópico (en torno al 9%). Respecto a la clasificación visual no se han observado diferencias significativas entre la calidad MEG o las rechazadas. Se han estudiado las consecuencias del secado (principalmente las deformaciones) y no se ha encontrado justificación para que estos defectos penalicen la clasificación. Para la densidad, el mayor R2 obtenido ha sido de un 47% a partir del uso combinado de los dos equipos puntuales (penetrómetro y arranque de tornillo). Para el módulo de elasticidad y la tensión de rotura, la mejor relación se ha obtenido a partir de la técnica de vibración longitudinal, con unos coeficientes de 79% y un 52% respectivamente. Se ha estimado que el aumento de un punto porcentual en el contenido de humedad de la madera produce una pérdida de velocidad de onda del 0,58% para Sylvatest y Microsecond Timer, y del 0,71% para PLG. Estos valores son generalizables para un rango de humedades entre 9 y 25 %. Abstract This Doctoral Thesis approach the study of some non-destructive techniques as a classification method for structural use of Scots pine wood of Spanish origin with large cross section. To estimate the modulus of elasticity and strength have been used techniques based on the propagation of a wave through the timber: ultrasonic wave (Sylvatest) or stress wave (Microsecond Timer) in longitudinal direction, or vibration in longitudinal and transversal direction (PLG). Local probing methods have been applied to estimate the density, based on penetrometer (Pilodyn) and the screw withdrawal resistance meter. The different variables obtained were compared with the results of the visual grading and the values of the properties of the wood determined by the standardized test of the pieces. Furthermore, the influence of the moisture content of the wood on the velocity of propagation of the waves through the timber has been analyzed in order to establish a correction factor for the commercial devices used in this Doctoral Thesis. The sample tested consists of 244 pieces from El Espinar, Segovia, with nominal dimensions 150 x 200 x 4000 mm (218 pieces) and 100 x 150 x 3000 mm (26 pieces). Data collection about dimensions, moisture content and visual grading according to the UNE 56544 standard were carried out on all the pieces. The first 218 pieces were tested by non destructive techniques based on ultrasonic wave, stress wave and vibration, the density was measured on each piece and bending test according to the UNE-EN 408 standard was carried out for calculating the global modulus of elasticity (all the pieces) and the local one (only a representative group), as well as the bending strength. Three slices were removed for implementing the local probing and to calculate the density. In the other 26 pieces the tests (wave transmission, vibration and visual grading) were repeated during the natural drying process, from wet timber (around 40 % moisture content) up to the equilibrium moisture content (around 9%). Regarding the visual grading no significant differences were observed between MEG or rejected pieces. The effects of drying (deformations) have been studied, and justification for the specification hasn't been found. To estimate the density, the greater R2 obtained was 47% by using both penetrometer and screw withdrawal. For the modulus of elasticity and bending strength, the best relationship has been found with the longitudinal vibration, with coefficients of 79% and 52% respectively. It has been estimated that an increase of a point of the moisture content of the wood produces a decrease on the velocity obtained from ultrasonic or stress wave of 0,58%, and 0,71 % for the one obtained from vibration. Those values can be generalized for a range of moisture content from 9 to 25 %.

Evaluación bajo cargas estáticas según la norma UNE-EN 13374 de barandillas de seguridad de obras fabricadas con tubos de acero y con tablas de madera

En este trabajo se han evaluado analítica y experimentalmente, bajo cargas estáticas, sistemas provisionales de protección de borde (SPPB), fabricados con barandillas de sección tubular de acero y con barandillas de tablas de madera de pino silvestre. En ambos casos los postes de sección tubular de acero se han separado 2400 mm. Los resultados muestran que SPPB fabricados con barandillas de tubo de acero necesitan una sección de 40·1,5. Si el SPPB está fabricado con barandilla de madera de pino silvestre de altura 150 mm, la tabla de espesor 22 mm de cualquier calidad es válida como rodapié. Como barandilla principal se necesita utilizar un espesor de 30 mm para poder garantizar que con cualquier clasificación de la madera se pueden superar los requisitos establecidos por la norma UNE-EN 13374 para la evaluación de SPPB.

Análisis experimental y por el método de los elementos finitos del estado de tensiones en uniones carpinteras de empalme de llave

In this research, the halved and tabled traditional timber scarf joint is analyzed. This joint consists in two end joint pieces usually subjected to tension. Initially, the study is discussed from an experimental point of view. In this way, 3 critical cross-sections are established (section of the notch, section of the horizontal plane and reduced section) and mechanical tests are performed to achieve the failure on each of critical sections by changing the geometry of the joint. The study is completed by developing a finite element model which allows verify experimental results and extend the analysis to other geometries. This model has to simulate the real behavior of the material which is being studied, so mechanical tests are performed to obtain the elastic constants and the coefficients of friction of the material. In the reduced section, an abrupt decrease of the effective cross-section takes place, and this effect is also experimentally analyzed. These tests indicate that a crack is initiated before the bending-tension failure occurs in the reduced section. The test material consists of wood of Pinus sylvestris L. coming from the “Valsaín´s Sawmill” (Segovia) with “premium quality” according to the nonstructural wood visual classification of sawmill. It is observed that initiation of a crack, in the mortise (bottom of reduced section), and shear stress concentration, at the initial part of the heel (beginning of horizontal plane), completely determine the mechanical behaviour of the joint, resulting in 3 failure modes: local compression failure in the section of the notch, shear failure in the horizontal plane, and failure of stresses concentration, mainly perpendicular to the grain tension, at the bottom of reduced section. The geometric optimization is obtained for halved and tabled traditional scarf joint, when the joint has made with similar properties of wood than tested specimens, for any height and width of the cross-section. It is considered the failure due to the initiation of a crack in reduced section, by applying a correction coefficient into the usual equation used to design the members subjected to both tension and bending. Therefore, it is possible to obtain, analytically, the design conditions to be met of the 3 critical cross-sections. According to the theoretical optimization, the tension strength of complete cross-section is reduced until 14%, when using this type of joint. The experimental optimization indicates even a greater reduction, until 6%. En el presente trabajo de investigación se analiza el comportamiento mecánico de las uniones tradicionales de empalme de llave, que consisten en dos piezas unidas por sus testas transmitiéndose entre ellas principalmente un esfuerzo de tracción. Inicialmente, el estudio se aborda desde un punto de vista experimental. De este modo, se establecen las 3 secciones críticas o de estudio (sección del encaje, sección rasante del cogote y sección reducida) y se realizan ensayos mecánicos, variando la geometría de la unión, para alcanzar la rotura en cada una de ellas. Se completa el estudio mediante la elaboración de un modelo por elementos finitos que permite verificar los resultados experimentales y ampliar el análisis a otras geometrías. Este modelo debe simular el comportamiento real del material objeto de estudio, por lo que se realizan ensayos para obtener las constantes elásticas y los coeficientes de rozamiento del mismo. También se analiza, experimentalmente, el efecto entalladura que reduce bruscamente la sección completa del tirante, estableciendo que el fallo por flexotracción en la sección reducida de la pieza, no llega a producirse por el inicio previo de una grieta. El material de ensayo consiste en madera de Pinus sylvestris L. (pino silvestre) procedente del Aserradero de Valsaín (Segovia) y de calidad “Extra” o “Primera” según la clasificación visual no estructural del aserradero. Se observa que el inicio de una grieta en la mortaja del rediente y la concentración de tensiones tangenciales en la parte inicial del cogote, determinan completamente el comportamiento mecánico de la unión, dando lugar a 3 modos distintos de rotura: fallo por compresión en la sección del encaje, fallo por cortante en la sección rasante y fallo por concentración de tensiones, principalmente tracciones perpendiculares, en el rebaje de la sección reducida. Se consigue optimizar geométricamente cualquier empalme de llave confeccionado con madera de características similares a la ensayada, para cualquier valor de la altura y de la anchura de la sección. Se considera el agotamiento en la sección reducida causado por el inicio de grieta, mediante la aplicación de un coeficiente corrector en la expresión habitual de agotamiento por flexotracción, en consecuencia, finalmente es posible obtener, de modo analítico, un valor del índice de agotamiento en cada una de las 3 secciones de estudio. La optimización teórica del empalme de llave indica que la capacidad resistente del tirante bruto se reduce al 14%, cuando se coloca este tipo de unión tradicional. Experimentalmente se obtiene, que, para la sección ensayada, la capacidad resistente del tirante bruto se reduce todavía más, llegando al 6%.

Análisis de elementos de madera reforzados con materiales compuestos

Gran parte del patrimonio construido cuenta con edificios cuya estructura está compuesta por elementos de madera. El volumen económico que supone el mantenimiento y renovación de dicho patrimonio es considerable, por ello, es de especial interés el estudio de las diferentes técnicas de refuerzo aplicables a este tipo de estructuras. Las estructuras de madera han sido tradicionalmente reforzadas con piezas del mismo material, aumentando la sección de los elementos dañados, o con acero. La aparición de los materiales compuestos de polímeros reforzados con fibras, y su progresiva aplicación en obras de construcción, hizo que a principios de la década de los noventa se comenzara a aplicar este material en refuerzos de estructuras de madera (Puente de Sins, 1992). La madera es un material natural con una excelente relación entre sus características mecánicas y su peso. Con el uso de materiales compuestos como refuerzo ésta característica se mantiene. En cuanto a su modelo constitutivo, se admite un comportamiento elástico lineal a tracción paralela a la fibra hasta la rotura, mientras que a compresión, se considera un comportamiento lineal elástico inicial, seguido de un tramo plástico. En vigas de madera aserrada sometidas a flexión predomina el modo de fallo por tracción localizándose la fractura frecuentemente en el canto inferior. Los FRP tienen un comportamiento elástico lineal a tracción hasta la rotura y cuentan con excelentes propiedades mecánicas en relación a su peso y volumen. Si se refuerza la viga por el canto inferior se aumentará su capacidad de absorber tracciones y por tanto, es previsible que se produzca un incremento en la capacidad de carga, así como un aumento de ductilidad. En este trabajo se analizan los beneficios que aportan distintos sistemas de refuerzos de materiales compuestos. El objetivo es contribuir al conocimiento de esta técnica para la recuperación o aumento de las propiedades resistentes de elementos de madera sometidos a flexión. Se ha llevado a cabo un estudio basado en datos obtenidos experimentalmente mediante el ensayo a flexión de vigas de madera de pino silvestre reforzadas con materiales compuestos. Las fibras que componen los tejidos utilizados para la ejecución de los refuerzos son de basalto y de carbono. En el caso de los compuestos de fibra de basalto se aplican en distintos gramajes, y los de carbono en tejido unidireccional y bidireccional. Se analiza el comportamiento de las vigas según las variables de refuerzo aplicadas y se comparan con los resultados de vigas ensayadas sin reforzar. Además se comprueba el ajuste del modelo de cálculo no lineal aplicado para predecir la carga de rotura de cada viga reforzada. Con este trabajo queda demostrado el buen funcionamiento del FRP de fibra de basalto aplicado en el refuerzo de vigas de madera y de los tejidos de carbono bidireccionales con respecto a los unidireccionales. ABSTRACT Many of the buildings of the built heritage include a structure composed by timber elements. The economic volume involved in the maintenance and renewal of this built heritage is considerable, therefore, the study of the different reinforcement techniques applicable to this type of structure is of special interest. The wooden structures have traditionally been reinforced either with steel or with pieces of the same material, increasing the section of the damaged parts. The emergence of polymer composites reinforced with fibers, and their progressive use in construction, started to be applied as reinforcement in timber structures at the beginning of the nineties decade in the 20th century (Sins Bridge, 1992). Wood is a natural material with an excellent ratio between its mechanic characteristics and its weight. This feature is maintained with the use of composites as reinforcement. In terms of its constitutive model, linear elastic behavior parallel to the fiber up to fracture is admitted when subjected to tensile stress, while under compression, an initial linear elastic behavior, followed by a section plasticizing, is considered. In sawn timber beams subjected to bending, the predominant failure is mainly due to tensile stress; and frequently the fracture is located at the beam lower face. The FRP have a linear elastic behavior until fracture occurs, and have excellent mechanical properties in relation to their weight and volume. If the beam is reinforced by its lower face, its capacity to absorb tensile stresses will increase, and therefore, an increase in its carrying capacity is likely to be produced, as well as an increase in ductility. This work analyzes the benefits different reinforcement systems of composite materials provide, with the aim of contributing to the knowledge of this technique for recovering or increasing the strength properties of timber elements subjected to bending loads. It is a study based on data obtained experimentally using bending tests of pine timber beams reinforced with composite materials. Fibers used for the execution of the reinforcement are basalt and carbon. Basalt fiber composites are applied in different grammages, whereas with carbon composites, unidirectional and bidirectional fabrics are used. The behavior of the beams was analyzed regarding the reinforcement variables applied, and the results are compared with those of the tested beams without reinforcement. Furthermore it has been proved adjunting the nonlinear calculation model applied to predict the failure load of each reinforced beam. This work proves the good behavior of fiber reinforce plastic (FRP) with basalt fiber when applied to timber beams, and that of bidirectional carbon fabrics as opposed to the unidirectional ones.

Simulation of impulse response for indoor visible light communications using 3D CAD models

n this article, a tool for simulating the channel impulse response for indoor visible light communications using 3D computer-aided design (CAD) models is presented. The simulation tool is based on a previous Monte Carlo ray-tracing algorithm for indoor infrared channel estimation, but including wavelength response evaluation. The 3D scene, or the simulation environment, can be defined using any CAD software in which the user specifies, in addition to the setting geometry, the reflection characteristics of the surface materials as well as the structures of the emitters and receivers involved in the simulation. Also, in an effort to improve the computational efficiency, two optimizations are proposed. The first one consists of dividing the setting into cubic regions of equal size, which offers a calculation improvement of approximately 50% compared to not dividing the 3D scene into sub-regions. The second one involves the parallelization of the simulation algorithm, which provides a computational speed-up proportional to the number of processors used.

Coastal floods and decadal changes: the climate factor

Observation has widely shown for nearly all last century that the Spanish (Dynamic) Maritime Climate was following around 10 to 11 year cycles in its most significant figure, wind wave, despite it being better to register cycles of 20 to 22 years, in analogical way with the semi-diurnal and diurnal cycles of Cantabrian tides. Those cycles were soon linked to sun activity and, at the end of the century, the latter was related to the Solar System evolution. We know now that waves and storm surges are coupled and that (Dynamic) Maritime Climate forms part of a more complex “Thermal Machine” including Hydrological cycle. The analysis of coastal floods could so facilitate the extension of that experience. According to their immediate cause, simple flood are usually sorted out into flash, pluvial, fluvial, groundwater and coastal types, considering the last as caused by sea waters. But the fact is that most of coastal floods are the result of the concomitance of several former simple types. Actually, the several Southeastern Mediterranean coastal flood events show to be the result of the superposition within the coastal zone of flash, fluvial, pluvial and groundwater flood types under boundary condition imposed by the concomitant storm sea level rise. This work shall be regarded as an attempt to clarify that cyclic experience, through an in-depth review of a past flood events in Valencia (Turia and Júcar basins), as in Murcia (Segura’s) as well.

Understanding extreme Spanish coastal flood events

The Santa Irene flood event, at the end of October 1982, is one of the most dramatically widely reported flood events in Spain. Its renown is mainly due to the collapse of the Tous dam, but its main message is to be the paradigm of the incidence of the maritime/littoral weather and its temporal sea level rise by storm surge accompanying rain process on the coastal plains inland floods. Looking at damages the presentation analyzes the adapted measures from the point of view of the aims of the FP7 SMARTeST Project related to the Flood Resilience improvement in urban areas through looking for Technologies, Systems and Tools an appropriate "road to de market".

Células solares de banda intermedia

Las células solares de banda intermedia se inventaron en España. Constituyen una propuesta para aumentar la eficiencia de las células solares por encima del límite de Shockley y Queisser para células de un solo gap. El número de ideas para llevarlas a la práctica (desde la utilización de puntos cuánticos a la implantación selectiva de impurezas) se ha ido expandiendo a medida que nuestra comprensión ha ido aumentando. En este artículo repasamos el concepto de célula solar de banda intermedia y algunas de estas ideas para llevarla a la práctica.

Análisis molecular de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel y eficiencia simbiótica en Rhizobium leguminosarum

Los suelos ultramáficos, que poseen elevadas concentraciones de níquel, cobalto y cromo de manera natural, son fuente de bacterias resistentes a altas concentraciones de metales. Se realizó la caracterización físico-química de seis suelos ultramáficos del suroeste europeo, seleccionándose un suelo de la región de Gorro, Italia, como el más adecuado para aislar bacterias endosimbióticas resistentes a metales. A partir de plantas-trampa de guisante y lenteja inoculados con suspensiones de ese suelo, se obtuvieron 58 aislados de Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) que fueron clasificados en 13 grupos según análisis de PCR-RAPDs. Se determinó la resistencia a cationes metálicos [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] de una cepa representante de cada grupo, así como la secuencia de los genomas de las cepas que mostraron altos niveles (UPM1137 y UPM1280) y bajos niveles (UPM1131 y UPM1136) de tolerancia a metales. Para identificar mecanismos de resistencia a metales se realizó una mutagénesis al azar en dicha cepa mediante la inserción de un minitransposón. El análisis de 4313 transconjugantes permitió identificar 14 mutantes que mostraron una mayor sensibilidad a Ni(II) que la cepa silvestre. Se determinó el punto de inserción del minitransposón en todos ellos y se analizaron en más detalle dos de los mutantes (D2250 y D4239). En uno de los mutantes (D2250), el gen afectado codifica para una proteína que presenta un 44% de identidad con dmeF (divalent efflux protein) de Cupriavidus metallidurans. Cadena arriba de dmeF se identificó un gen que codifica una proteína con un 39% de identidad con el regulador RcnR de Escherichia coli. Se decidió nombrar a este sistema dmeRF, y se generó un mutante en ambos genes en la cepa Rlv SPF25 (Rlv D15). A partir de experimentos de análisis fenotípico y de regulación se pudo demostrar que el sistema dmeRF tiene un papel relevante en la resistencia a Ni(II) y sobre todo a Co(II) en células en vida libre y en simbiosis con plantas de guisante. Ambos genes forman un operón cuya expresión se induce en respuesta a la presencia de Ni(II) y Co(II). Este sistema se encuentra conservado en distintas especies del género Rhizobium como un mecanismo general de resistencia a níquel y cobalto. Otro de los mutantes identificados (D4239), tiene interrumpido un gen que codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC. Aunque inicialmente fue identificado por su sensibilidad a níquel, experimentos posteriores demostraron que su elevada sensibilidad a metales era debida a su sensibilidad al medio TY, y más concretamente a la triptona presente en el medio. En otros medios de cultivo el mutante no está afectado específicamente en su tolerancia a metales. Este mutante presenta un fenotipo simbiótico inusual, siendo inefectivo en guisantes y efectivo en lentejas. Análisis de complementación y de mutagénesis dirigida sugieren que el fenotipo de la mutación podría depender de otros factores distintos del gen portador de la inserción del minitransposón. ABSTRACT Ultramafic soils, having naturally high concentrations of nickel, cobalt and chrome, are potential sources of highly metal-resistant bacteria. A physico-chemical characterization of six ultramafic soils from the European southwest was made. A soil from Gorro, Italy, was chosen as the most appropriated for the isolation of heavy-metal-resistant endosymbiotic bacteria. From pea and lentil trap plants inoculated with soil suspensions, 58 isolates of Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) were obtained and classified into 13 groups based on PCR-RAPDs analysis. The resistance to metallic cations [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] was analyzed in a representative strain of each group. From the results obtained in the resistance assays, the Rlv UPM1137 strain was selected to identify metal resistance mechanism. A random mutagenesis was made in UPM1137 by using minitransposon insertion. Analysis of 4313 transconjugants allowed to identify 14 mutants with higher sensitivity to Ni(II) than the wild type strain. The insertion point of the minitransposon was determined in all of them, and two mutants (D2250 and D4239) were studied in more detail. In one of the mutants (D2250), the affected gene encodes a protein with 44% identity in compared with DmeF (divalent efflux protein) from Cupriavidus metallidurans. Upstream R. leguminosarum dmeF, a gene encoding a protein with 39% identity with RcnR regulator from E. coli was identified. This protein was named DmeR. A mutant with both genes in the dmeRF deleted was generated and characterized in Rlv SPF25 (Rlv D15). From phenotypic and regulation analysis it was concluded that the dmeRF system is relevant for Ni(II) and specially Co(II) tolerance in both free living and symbiotic forms of the bacteria. This system is conserved in different Rhizobium species like a general mechanism for nickel and cobalt resistance. Other of the identified mutants (D4239) contains the transposon insert on a gene that encodes for an AraC-like transcriptional regulator. Although initially this mutant was identified for its nickel sensitivity, futher experiments demonstrated that its high metal sensitivity is due to its sensitivity to the TY medium, specifically for the tryptone. In other media the mutant is not affected specifically in their tolerance to metals. This mutant showed an unusual symbiotic phenotype, being ineffective in pea and effective in lentil. Complementation analysis and directed mutagenesis suggest that the mutation phenotype could depend of other factors different from the insertion minitransposon gene.