Influencia de la castración y la línea genética paterna sobre el rendimiento productivo y la calidad de la canal y de la carne en cerdos sacrificados a pesos elevados

El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue estudiar la influencia del sexo, el método de castración de los machos y la línea genética paterna sobre la productividad y la calidad de la canal y de la carne en cerdos blancos sacrificados a pesos elevados con destino a la industria de los productos curados de calidad. En el experimento 1, se utilizaron 360 cerdos sacrificados a 125 kg de peso vivo (PV) para estudiar la influencia del sexo y la castración [machos inmunocastrados (MI), machos castrados quirúrgicamente (MC) y hembras enteras (HE)] de dos líneas genéticas paternas Large White (Top York y Tempo) sobre los rendimientos productivos y la calidad de la canal y de la carne. La línea materna utilizada fue Large White × Landrace en todos los casos. Los MI se inmunizaron contra el factor de liberación de gonadotropina (GnRF) mediante la utilización de Improvac a los 78 (16 d en prueba) y 126 (64 d en prueba y 48 d antes del sacrificio) d de edad. Cada uno de los 6 tratamientos experimentales fue replicado 6 veces (cuadra con 10 cerdos). Desde el inicio de la prueba hasta el día de la primera inyección con Improvac (62 a 78 d de edad) los MI y las HE crecieron menos (P < 0,001) que los MC sin que se observaran diferencias en el consumo medio diario de pienso (CMD). Los MC tuvieron peor eficiencia alimenticia que las HE con los MI mostrando valores intermedios (P < 0,01). Entre las dos inyecciones de Improvac (78 a 126 d de edad), los MI crecieron y comieron menos que los MC, mostrando las HE valores intermedios (P < 0,001). Los MI fueron más eficientes que las HE y ambos más eficientes que los MC (P < 0,001). Sin embargo, desde la segunda inyección de Improvac hasta el sacrificio (126 a 174 d de edad) los MI crecieron más y fueron más eficientes (P < 0,001) que las HE y los MC. Al final de la prueba, MI y MC crecieron más (P < 0,01) que HE. Asimismo, los MI fueron más eficientes (P < 0,001) pero presentaron menor rendimiento de canal (P < 0,001) que los MC y las HE. Por otro lado, los MI y las HE depositaron menos grasa dorsal que los MC (P < 0,001). Las hembras tuvieron mayor rendimiento de lomo y menos grasa intramuscular que MI y MC (P < 0,01). Asimismo, las HE tuvieron mayor rendimiento de jamón en fresco y perfilado que los MC con los MI mostrando valores intermedios (P < 0,05). Los cerdos híbridos procedentes de machos Tempo crecieron más (P < 0,001) que los procedentes de machos Top York, sin que se encontraran diferencias para el CMD o para la eficiencia alimenticia. Los híbridos de los cruces con Top York tuvieron mejores rendimientos de jamones frescos y perfilados (P < 0,05) pero menor rendimiento de lomo y menos grasa intramuscular que los cruces con Tempo (P < 0,01). En conclusión, los MI presentaron mejor eficiencia alimenticia, pero menor rendimiento de canal que los MC y las HE. El contenido en grasa intramuscular fue similar entre MC y MI y superior para ambos que para las HE. Los cruces procedentes de la línea paterna Tempo crecieron más y tuvieron mayor contenido en grasa intramuscular, pero un rendimiento en jamón perfilado ligeramente inferior al de los cruces procedentes de la línea paterna Top York. Se concluye que la inmunocastración de los machos es una alternativa viable a la castración quirúrgica para la producción de cerdos pesados destinados a la industria de los productos curados. Debido a su mayor potencial de crecimiento y mayor contenido en grasa intramuscular, los híbridos procedentes de la línea paterna Tempo presentan ventajas frente a los híbridos procedentes de la línea paterna Top York cuando se destinan a la industria de productos curados de calidad. En el experimento 2, se utilizaron 240 cerdos para comparar los rendimientos productivos y los parámetros de calidad de la canal de MI, MC y HE destinados a la industria de productos cárnicos curados procedentes del cruce de la línea materna Large White × Landrace con la línea genética paterna Duroc o Pietrain. Entre las 2 inyecciones de Improvac (87 a 137 d de edad), los MI y las HE crecieron menos que los MC (P < 0,01). Asimismo, los MI comieron menos pienso que las HE y ambos menos que los MC (2,33, 2,55 y 2,77 kg/d; respectivamente; P < 0,001). Como resultado, los MI fueron más eficientes que los MC y las HE (P < 0,001). Desde la segunda inyección de Improvac hasta el momento del sacrificio (137 a 164 d de edad), los MI fueron más eficientes que las HE y ambos más que los MC (0,346, 0,323 y 0,300, respectivamente; P < 0,001). Las diferencias observadas en este periodo entre los sexos en cuanto a rendimientos productivos fueron más pronunciadas en los cerdos procedentes de la línea paterna Pietrain que los de la línea Duroc (P < 0,05 para la interacción). En el global de la prueba (87 a 164 d de edad) el sexo no afectó al crecimiento en los cerdos procedentes de la línea paterna Duroc pero en los cerdos procedentes de la línea paterna Pietrain, los MI y los MC crecieron más que las HE (P < 0,05 para la interacción). Asimismo, los MI tuvieron mejor eficiencia alimenticia (0,406, 0,364 y 0,380, P < 0,001) y menor rendimiento de la canal (76,6, 78,1 y 78,8%; P < 0,001) que los MC y las HE. Las canales de las HE fueron más magras que las canales de los MC, con las canales de los MI mostrando valores intermedios (P < 0,01). El rendimiento en jamones y lomos fue mayor para las HE que para los MI y los MC (P < 0,001). El contenido en grasa intramuscular fue menor en las HE que en los MC, con los MI mostrando valores intermedios (3,5 vs. 3,9 y 3,7%; P < 0,05). Por otra parte, los híbridos procedentes de machos Duroc crecieron más rápido (1,167 vs. 0,986 kg/d; P < 0,001), consumieron más pienso (3,07 vs. 2,56 kg/d; P < 0,001) y tuvieron más grasa intramuscular (P < 0,001), pero menor rendimiento en jamones y lomos (P < 0,01) que los híbridos procedentes de machos Pietrain. Se concluye que los MI presentaron mejores productividades pero menores rendimientos de canal que MC y HE. El contenido en grasa intramuscular en el músculo longissimus dorsi fue menor para las HE que para los MC con valores intermedios para los MI. Los cruces procedentes de la genética paterna Duroc crecieron más y tuvieron más grasa intramuscular pero menos rendimiento de jamón que los cerdos procedentes de machos Pietrain. Por tanto, los MI deben ser preferidos a los MC y los cruces con la línea paterna Duroc deben ser preferidos a los cruces con Pietrain para producir canales cuando sus partes nobles están destinadas a la industria de productos cárnicos curados. En base a estos resultados, se concluye que la inmunocastración es una alternativa factible a la castración quirúrgica y que líneas genéticas paternas Tempo y Duroc son mejores para la producción de cerdo blanco pesado que las líneas Top York y Pietrain. Las interacciones entre el sexo y las líneas genéticas paternas estudiadas, sugieren que el resultado final depende en parte de la línea genética paterna utilizada. En cualquier caso, la inmunocastración es una alternativa factible a la castración quirúrgica para la producción de canales destinadas a la industria de los productos cárnicos curados. ABSTRACT The general aim of this PhD Thesis was to study the influence of sex, method of castration, and genetic background of the sire line on growth performance and carcass and meat quality merits of heavy white pigs destined to the dry-cured industry. In experiment 1, 360 pigs slaughtered at 125 kg of body weight were used to study the influence of sex and castration methodology [immunocastrated males (ICM), surgically castrated males (SCM), and intact females (IF)] of 2 terminal Large White sire lines (Top York and Tempo) on growth performance and carcass and meat quality. The female line was Large White × Landrace in all cases. The ICM pigs were immunized against gonadotropin-releasing factor with Improvac at 78 (16 d on trial) and 126 (64 d on trial and 48 d before slaughter) d of age. Each of the 6 treatments was replicated 6 times (10 pigs/pen). From the start of the experiment to the day of the first Improvac injection (62 to 78 d of age), ICM and IF grew slowlier (P < 0.001) than SCM but no differences in feed intake were detected. The SCM pigs had greater gain to feed ratio (G:F) than the IF with the ICM pigs being intermediate (P < 0.01). Between the 2 Improvac injections (78 to 126 d of age), the ICM pigs ate less feed (P < 0.001) and grew slowlier rate than the SCM pigs, with the growth of IF being intermediate. The ICM pigs were more efficient than the IF, and both were more efficient than the SCM pigs (P < 0.001). However, from the second Improvac injection to slaughter (126 to 174 d of age), the ICM pigs grew at a faster rate (P < 0.001) and were more efficient (P < 0.001) than the IF and the SCM pigs. Cumulatively, ICM and SCM pigs grew faster (P < 0.01) than IF and the ICM pigs were more efficient than the other two sexes (P < 0.001). However, the ICM pigs had reduced (P < 0.001) carcass yield compared with SCM and IF. The ICM and IF pigs also had less (P < 0.001) backfat depth than the SCM pigs. Intact females had higher (P < 0.01) loin yield but less intramuscular fat (P < 0.01) than ICM and SCM pigs and higher (P < 0.05) fresh and trimmed ham yields than SCM pigs, with ICM pigs being intermediate. Crossbreds from the Tempo sires grew faster (P < 0.001) than crossbreds from the Top York sires but no differences (P > 0.10) were detected for feed intake or feed efficiency. Crossbreds from the Top York sires had higher (P < 0.05) fresh and trimmed ham yields but less (P < 0.01) loin yield and intramuscular fat content than crossbreds from the Tempo sires. In conclusion, ICM pigs are more efficient, but have less carcass yield than SCM and IF pigs. The intramuscular fat content was lowest for the IF and similar for ICM and SCM pigs. Crossbreds from Tempo sires were heavier and had greater intramuscular fat content, but had less trimmed ham yield as compared with crossbreds from the Top York sires. Immunocastrated pigs can replace SCM pigs for the production of heavy pigs destined for the dry-cured industry. Because of increased carcass weight and the higher intramuscular content, crossbreds from Tempo sires may have an advantage over crossbreds from Top York sires for the dry-cured industry. In experiment 2, a total of 240 pigs were used to compare growth performance and carcass quality traits of immunocastrated males, surgically castrated males, and intact females of crossbreds from Large White × Landrace females and Duroc or Pietrain sires destined to the dry-cured industry. Between the 2 Improvac injections (87 and 137 d of age), ICM and IF pigs had lower average daily gain (ADG) than SCM pigs (P < 0.01). Also, ICM pigs ate less feed than IF and both type of pigs ate less than SCM pigs (2.33, 2.55, and 2.77 kg/d; P < 0.001). Consequently, ICM pigs had better G:F than SCM and IF (P < 0.001). From the second Improvac injection to slaughter (137 to 164 d of age), ICM pigs were more efficient than IF and both were more efficient than SCM pigs (0.346, 0.323, and 0.300 g/g; P < 0.001). The differences in growth performance among genders observed in this period were more pronounced for the Pietrain than for the Duroc crossbreds (P < 0.05 for the interaction). For the entire experimental period (87 to 164 d of age), gender did not affect ADG for Duroc crossbreds but for Pietrain crossbreds ICM and SCM had higher ADG than IF (P < 0.05 for the interaction). The ICM pigs had better feed efficiency (0.406, 0.364, and 0.380; g/g; P < 0.001) and lower carcass yield (76.6, 78.1, and 78.8%; P < 0.001) than SCM or IF. Carcasses from IF were leaner than carcasses from SCM with carcasses from ICM being intermediate (P < 0.01). Ham and loin (P < 0.001) yields were higher for IF than for ICM or SCM pigs. Intramuscular fat content was lower for IF than for SCM pigs with that of ICM pigs being intermediate (3.5 vs. 3.9 and 3.7%; P < 0.05). Cumulatively, crossbreds from Duroc sires had higher ADG (1.167 vs. 0.986 kg/d; P < 0.001) and average daily feed intake (3.07 vs. 2.56 kg/d; P < 0.001) and more intramuscular fat (P < 0.001) but less ham and loin yields (P < 0.01) than crossbreds from Pietrain sires. It is concluded that growth performance was better, but carcass yield lower, for ICM pigs than for SCM and IF. Intramuscular fat content in longissimus dorsi muscle was lower for IF than for SCM pigs with ICM pigs being intermediate. Crossbreds from Duroc sires grew faster and had more intramuscular fat but less ham yield than crossbreds from Pietrain sires. Therefore, ICM pigs should be preferred to SCM pigs, and Duroc crossbreds should be preferred to Pietrain crossbreds to produce carcasses destined to the production of primal cuts for the dry-cured industry. We conclude that immunocastration might be a sound alternative to surgical castration in pigs and that Tempo and Duroc might be better for the production of heavy pigs than Top York and Pietrain. The interactions reported between sex and genetic sire line, suggested that the benefits of immunocastration as an alternative to surgical castration might depend at least part on the sire line used. In any case, immunocastration is a good alternative to surgical castration for the production of carcasses destined to the dry-cured industry.

Programación genética guiada por gramáticas

Este trabajo fin de grado, presenta una herramienta para experimentar con técnicas de la Programación Genética Guiada por Gramáticas. La mayor parte de los trabajos realizados hasta el momento en esta área, son demasiado restrictivos, ya que trabajan con gramáticas, y funciones fitness predefinidas dentro de las propias herramientas, por lo que solo son útiles sobre un único problema. Este trabajo se plantea el objetivo de presentar una herramienta mediante la cual todos los parámetros, gramáticas, individuos y funciones fitness, sean parametrizables. Es decir, una herramienta de carácter general, valida para cualquier tipo de problema que sea representable mediante una gramática libre de contexto. Para abordad el objetivo principal propuesto, se plantea un mecanismo para construir el árbol de derivación de los individuos de acuerdo a una gramática libre de contexto, y a partir de ahí, aplicar una serie de operadores genéticos guiados por gramáticas para ofrecer un resultado final, de acuerdo a una función fitness, que el usuario puede seleccionar antes de realizar la ejecución. La herramienta, también propone una medida de similitud entre los individuos pertenecientes a una determinada generación, que permite comparar los individuos desde el punto de vista de la información semántica que contienen. Con el objetivo de validar el trabajo realizado, se ha probado la herramienta con una gramática libre de contexto ya predefinida, y se exponen numerosos tipos de resultados de acuerdo a distintos parámetros de la aplicación, así como su comparación, para poder estudiar la velocidad e convergencia de los mismos. ---ABSTRACT---This final project presents a tool for working with algorithms related to Genetic Grammar Guided Programming. Most of the work done so far in this area is too restrictive, since they only work with predefined grammars, and fitness functions built within the tools themselves, so they are only useful on a single problem. The main objective of this tool is that all parameters, grammars, individuals and fitness functions, are can be easily modified thought the interface. In other words, a general tool valid for any type of problem that can be represented by a context-free grammar. To address the main objective proposed, the tool provides a mechanism to build the derivation tree of individuals according to a context-free grammar, and from there, applying a series of grammar guided genetic operators to deliver a final result, according to a fitness function, which the user can select before execution. The tool also offers a measure of similarity between individuals belonging to a certain generation, allowing comparison of individuals from the point of view of semantic information they contain. In order to validate the work done, the tool has been tested with a context-free grammar previously defined, and numerous types test have been run with different parameters of the application. The results are compared according to their speed convergence

Simulación de evolución dirigida de bacteriófagos en poblaciones de bacterias en 2D

The research group is currently developing a biological computing model to be implemented with Escherichia Coli bacteria and bacteriophages M13, but it has to be modelled and simulated before any experiment in order to reduce the amount of failed attempts, time and costs. The problem that gave rise to this project is that there are no software tools which are able to simulate the biological process underlying that com- putational model, so it needs to be developed before doing any experimental implementation. There are several software tools which can simulate most of the biological processes and bacterial interactions in which this model is based, so what needs to be done is to study those available simulation tools, compare them and choose the most appropriate in order to be improved adding the desired functionality for this design. Directed evolution is a method used in biotechnology to obtain proteins or nucleic acids with properties not found in nature. It consists of three steps: 1) creating a library of mutants, 2) selecting the mutants with the desired properties, 3) replicating the variants identified in the selection step. The new software tool will be verified by simulating the selection step of a process of directed evolution applied to bacteriophages. ---ABSRACT---El grupo de investigación está desarrollando un modelo de computación biolóogica para ser implementado con bacterias Escherichia Coli y bacteriofagos M13, aunque primero tiene que ser modelizado antes de realizar cualquier experimento, de forma que los intentos fallidos y por lo tanto los costes se verán reducidos. El problema que dio lugar a este proyecto es la ausencia de herramientas software capaces de simular el proceso biológico que subyace a este modelo de computación biológica, por lo que dicha herramienta tiene que ser desarrollada antes de realizar cualquier implementación real. Existen varias herramientas software capaces de simular la mayoría de los procesos biológicos y las interacciones entre bacterias en los que se basa este modelo, por lo que este trabajo consiste en realizar un estudio de dichas herramientas de simulación, compararlas y escoger aquella más apropiada para ser mejorada añadiendo la funcionalidad deseada para este diseño. La evolución dirigida es un método utilizado en biotecnología para obtener proteínas o ácidos nucleicos con propiedades que no se encuentran en la naturaleza. Este método consiste en tres pasos: 1) crear una librería de mutantes, 2) seleccionar los mutantes con las propiedades deseadas, 3) Replicar los mutantes deseados. La nueva herramienta software será verificada mediante la simulación de la selección de mutantes de un proceso de evolución dirigida aplicado a bacteriofagos.

El papel de la selección genética en el bienestar de las vacas de leche

Hasta hace relativamente poco tiempo, el bienestar de las vacas lecheras en las granjas de EE.UU. y U.E. se asumía como correcto. Sin embargo en los últimos años, con el considerable incremento de la productividad de las vacas y los cambios en el manejo, tamaño y estructura de las granjas, los estudiosos del bienestar han comenzado a expresar su seria preocupación al respecto en las vacas de alta producción y en sus terneros. Hoy día, los principales problemas de bienestar en el vacuno lechero se derivan de la mayor incidencia de mamitis y de problemas de pezuñas y de patas, de problemas reproductivos, de su incapacidad para mostrar comportamientos normales, de respuestas fisiológicas de emergencia que consumen recursos energéticos y de lesiones. Estos problemas de bienestar incluyen los originados por el entorno productivo (por ejemplo suelos deslizantes que provocan lesiones en patas, o suelos abrasivos que dañan las pezuñas) y por el manejo (falta de especialización de la mano de obra) y elevada rotación de ésta, que contribuye a una menor atención a la detección de enfermedades o síntomas de estrés), así como esquemas de selección dirigidos únicamente a mejorar los caracteres productivos. Todo ello ha provocado a que las modernas granjas lecheras tengan serios problemas de bienestar en sus animales.

Creación de una base de datos para almacenar datos de secuenciación genética y su integración con BLAST

Este Trabajo de Fin de Grado (TFG) consiste en el diseño y el desarrollo de una base de datos para almacenar datos de secuenciación genética. Además, también será necesario poder utilizar la herramienta BLAST, que está formada por un conjunto de programas para buscar por similitud y alinear secuencias, con los datos que se encuentran almacenados en dicha base de datos.---ABSTRACT---The aim of this Bachelor’s Thesis is to design and develop a database to store data of genetic sequences. Furthermore, it will be necessary to use BLAST, which is a suite of programs to search and match similarities sequences into a database.

Efectos de la gestión selvícola pasada y presente sobre la diversidad genética actual y futura de Quercus pyrenaica Willd. en Sierra Nevada

Quercus pyrenaica Willd. es un roble mediterráneo-occidental, ampliamente distribuido en la península ibérica que presenta una extraordinaria capacidad de rebrote, especialmente de raíz. Tradicionalmente ha sido aprovechado para leñas en monte bajo y, menos frecuentemente, adehesado para el uso ganadero. El abandono de la gestión tradicional mayoritaria ha puesto de manifiesto el estado de degradación de sus masas (falta de crecimiento, puntisecado, ausencia de fructificación), que de forma teórica se había atribuido al agotamiento de las cepas y a la falta de diversidad genética. Sin embargo, el análisis reciente mediante marcadores moleculares microsatélites de numerosos rebollares, incluidos los que aquí se presentan, permite descartar la supuesta falta de variabilidad genética. No obstante, la falta de concordancia entre la estructuras forestales de montes bajos y adehesados y el origen asexual o sexual de sus pies, junto a la heterogeneidad en el tamaño y composición de las cepas dificulta la interpretación de la estructura clonal actual en cada monte. Este trabajo, en el que se evalúa el estado de conservación de los recursos genéticos de Q. pyrenaica en uno de los territorios más intensamente aprovechados por el hombre a lo largo de la historia, ilustra la importante resiliencia que presenta la especie frente al manejo tradicional en monte bajo. Mediante el estudio de tres rodales localizados en el mismo robledal en el Parque Nacional de Sierra Nevada, se analiza el efecto de la gestión pasada (en monte bajo y adehesado) y presente (en un rodal de monte bajo resalveado) sobre la diversidad genética y la estructura clonal de la especie. Además, se evalúa la evolución futura de la diversidad genética a través del análisis del regenerado en los tres rodales en función del manejo selvícola que han experimentado. A pesar de que los montes bajos presentan mayores niveles de diversidad genética para la cohorte adulta, el origen asexual de la cohorte juvenil podría limitar la evolución de la diversidad genética en el futuro. Por el contrario, en el monte adehesado, la regeneración mayoritaria

Ampliación de la variabilidad genética de la colección de Aegilops conservada en ell CRF-INIA y caracterización molecular de las especies Neglecta y Geniculata

En este trabajo se expone el doble objetivo de incrementar la representación de la variabilidad genética de las especies Ae. geniculata, Ae. ventricosa, Ae. neglecta, y Ae. triuncialis que han evolucionado en España, y diferenciar correctamente las especies neglecta y geniculata.

Native bradyrhizobial symbionts of Lupinus mariae-josephae, a unique endemism thriving in alkaline soils in Eastern Spain

Lupinus mariae-josephae (Lmj) es una especie de lupino endémica de una pequeña y específica área de Comunidad Valenciana (Este de España), donde prospera en suelos alcalinoscalcáreos, un hábitat singular para los altramuces, que crecen preferentemente en suelos ácidos o neutros. Esto hace de Lmj una especie de lupino única. Cuando se inició este trabajo, la extensión conocida de este endemismo abarcaba unos 700 kilómetros cuadrados, confinados en la provincia de Valencia. En esta área, Lmj prospera en pequeñas poblaciones aisladas que contienen un número reducido de plantas por lo que se la consideró una especie en peligro de extinción. Todos los esfuerzos, utilizando estrategias clásicas dirigidas a ampliar el área de crecimiento de Lmj y garantizar su conservación, han tenido un éxito limitado. El trabajo que se presenta está dirigido a mejorar el conocimiento de la ecología de Lmj, en particular la interacción simbiótica que establece con bacterias del suelo denominadas rizobios y se centra en la caracterización fenotípica, filogenética y genómica de esos rizobios. También se investiga la posible contribución de la simbiosis en mejorar la conservación de Lmj. Para este fin, se han estudiado diferentes aspectos que se describen a continuación. El primero objetivo se centró en aislar y estudiar de la diversidad genética de las bacterias endosimbióticas de Lmj. . Se realizó un análisis filogenético de genes esenciales que mostró que las cepas de Lmj pertenecen al género Bradyrhizobium y que presentan una gran diversidad con características fenotípicas y simbióticas diferentes de cepas de Bradyrhizobium que nodulan otras especies de lupinos nativos de España (cepas ISLU). Las cepas estudiadas se dividieron en dos grupos (Clado I y Clado II). El Clado I, incluye a las cepas Lmj, definiendo un nuevo linaje, filogenéticamente relacionado con otras especies de Bradyrhizobium, como B. jicamae y B. elkanii. El Clado II contiene cepas ISLU relacionadas con cepas de B. canariense y B. japonicum que establecen simbiosis con lupinos de suelos ácidos. Otro análisis filogenético basado en genes simbióticos, distribuyó las cepas de Lmj en sólo dos grupos diferentes. La singularidad y gran diversidad de estas cepas en una pequeña área geográfica, hacen de este, un atractivo sistema para el estudio de la evolución y adaptación de las bacterias simbióticas a su respectiva planta huésped. Adicionalmente, se estudio la presencia de bacterias capaces de nodular Lmj en suelos básicos de Chiapas, México. Sorprendentemente, estos suelos contienen bacterias capaces establecer interacciones simbióticas eficientes con Lmj en ensayos de invernadero. A continuación se investigó la taxonomía de los endosimbiontes de Lmj analizando la secuencia de cuatro genes esenciales (16S rRNA, recA, glnII y atpD) y el promedio de identidad de nucleótidos de genomas completos de algunas cepas representativas de la diversidad (ANIm). Se identificaron nuevas especies de Bradyrhizobium dentro del Clado I y se definió una de ellas: 'Bradyrhizobium valentinum' sp. nov (cepa tipo LmjM3T = CECT 8364T, LMG 2761T). También se abordó cómo conservar Lmj en su hábitat natural mediante inoculación con alguna de las cepas aisladas. Se demostró la ausencia de bacterias capaces de nodular Lmj en suelos rojos alcalinos o ‘‘terra rossa’’ de la Península Ibérica y Baleares. Dos cepas, altamente eficientes en cuanto a la fijación de nitrógeno, LmjC y LmjM3T, fueron seleccionadas para ser empleadas como inoculantes. Dos experimentos de campo llevados a cabo en años consecutivos en áreas con características edafoclimáticas similares a las que presentan las poblaciones de Lmj, lograron la reproducción exitosa de la planta. Se concluyó que un ciclo reproductivo exitoso de Lmj es absolutamente dependiente de la inoculación con sus simbiontes naturales y que la simbiosis debe ser considerada un factor esencial en estrategias de conservación de leguminosas en peligro. La obtención de varias secuencias genómicas de cepas aisladas de Lmj y de otras cepas de Bradyrhizobium reveló una alta similitud entre los genomas de las cepas del Clado I, y permitió la identificación de cinco posibles nuevas especies. Además, se estudiaron tres agrupaciones de genes relacionados con la simbiosis (nod, nif y fix) definiendo un nuevo linaje para las cepas de Lmj, diferente del symbiovar “genistearum” de B. canariense y B. japonicum. La baja diversidad encontrada en el análisis filogenético de los genes simbióticos contrasta con la gran diversidad asociada a genes esenciales. La presencia de plásmidos en cepas del género Bradyrhizobium ha sido descrita en muy pocas ocasiones, sin embargo el análisis de la secuencia genómica de la cepa ISLU101, aislada de Lupinus angustifolius, reveló la presencia de un origen de replicación extracromosómico homólogo al operón repABC, presente en el plásmido de Bradyrhizobium sp BTAi1. Gracias a esta secuencia se identificaron genes homólogos en 19 de 72 cepas ISLU. Filogenéticamente, las secuencias de repABC se agruparon en un grupo monofilético con las de pBTAi1 y separadas de los rizobios de crecimiento rápido. Finalmente, se identificaron sistemas de secreción de proteínas de tipo III (T3SS) en nueve genomas de cepas de Lmj. Los T3SS pueden inyectar proteínas efectoras al interior de células vegetales. Su presencia en rizobios se ha relacionado con la gama de hospedador que pueden nodular y puede tener un efecto beneficioso, neutro o perjudicial en la simbiosis. Los T3SS de las cepas de Lmj codifican para una proteína efectora similar a NopE, un efector dependiente de T3SS descrito en B. diazoefficiens USDA 110T. La proteína NopE de la cepa LmjC se ha caracterizado bioquímicamente. ABSTRACT Lupinus mariae-josephae (Lmj) is a lupine species endemic of a unique small area in Valencia region (Eastern Spain) where the lupine plants thrive in alkaline-limed soils, which preferentially grow in acid or neutral soils. This is the type of soils native lupines of Spain. When this work was initiated, the extension of the endemic area of Lmj was of about 700 squared kilometers confined to the Valencia province. In this area, Lmj thrives in small, isolated patches containing a reduced number of plants, and points to an endemism that can easily became endangered or extinct. Consequently, the Valencia Community authorities gave a ‘‘microreserve” status for conservation of the species. All efforts, using classical strategies directed to extend the area of Lmj growth and ensure its conservation have been so far unsuccessful. The work presented here is directed to improve our knowledge of Lmj ecology and it is centered in the characterization of the rhizobial symbiosis by phenotypic, phylogenetic and genomic analysis as well as in investigate the potential contribution of the symbiosis to improve its conservation. To this end, five different topics have been studied, and results are briefly described here. Extensive details can be followed en the attached, published articles. The first topic deals with the indigenous rhizobial symbionts of the Lmj endemism, and its genetic diversity was investigated. The Lmj root symbionts belong to the Bradyrhizobium genus, and phylogenetic analysis based on core genes identified a large diversity of Bradyrhizobium strains with phenotypic and symbiotic characteristics different from rhizobia nodulating other Lupinus spp. native of Spain. The strains were split in two clades. Clade II contained strains close to classical B. canariense and B. japonicum lineages that establish symbioses with lupines in acid soils of the Mediterranean area. Clade I included Lmj strains that define a new lineage, close to other Bradyrhizobium species as B. jicamae and B. elkanii. The phylogenetic analysis based on symbiotic genes identified only two distinct clusters. The singularity and large diversity of these strains in such a small geographical area makes this an attractive system for studying the evolution and adaptation of the rhizobial symbiont to the plant host. Additionally, the presence of bacteria able to nodulate Lmj in basic soils from Chiapas, Mexico was investigated. Surprisingly, these soils contain bacteria able to effectively nodulate and fix nitrogen with Lmj plants in greenhouse assays. In the second topic, the taxonomic status of the endosymbiotic bacteria of Lmj from Valencia endemism and Chiapas was investigated. Results from phylogenetic analysis of core genes and Average Nucleotide Identity (ANIm) using draft genomic sequences identified new Bradyrhizobium species within strains of Clade I of Lmj endosymbiotic bacteria. Only one of these potentially new species has been defined, meanwhile the others are under process of characterization. The name ‘Bradyrhizobium valentinum’ sp. nov. was proposed for the defined species (type strain LmjM3T= CECT 8364T, LMG 2761T). The third topic was directed to conservation of endangered Lmj in its natural habitat. The relevant conclusion of this experimentation is that the symbiosis should be considered as a relevant factor in the conservation strategies for endangered legumes. First, we showed absence of bacteria able to nodulate Lmj in all the inspected ‘‘terra rossa’’ or alkaline red soils of the Iberian Peninsula and Balearic Islands. Then, two efficient nitrogen fixing strains with Lmj plants, LmjC and LmjM3T, were selected as inoculum for seed coating. Two planting experiments were carried out in consecutive years under natural conditions in areas with edapho-climatic characteristics identical to those sustaining natural Lmj populations, and successful reproduction of the plant was achieved. The relevant conclusion from these assays was that the successful reproductive cycle was absolutely dependent on seedling inoculation with effective bradyrhizobia The forth topic deep into the analysis of the genomic of Lmj representative strains. To this end, draft genomic sequences of selected Lmj strains and type strains of Bradyrhizobium spp. were assembled. The comparison analysis of the draft genomic sequences of Lmj strains and related Bradyrhizobium species grouped in Clade I, revealed a high genomic homology among them, and allowed the definition of five potentially new species of Lmj nodulating bacteria. Also, based on the available draft genomic sequences, only three clusters of nod, fix and nif genes from Lmj strains were identified and showed to define a new symbiotic lineage, distant from that of B. canariense and B. japonicum bv. genistearum. The low diversity exhibited by the phylogenetic analysis of symbiotic genes contrast with the large diversity of strains as regards the housekeeping genes analyzed. Besides, the genomic analysis of a Lupinus angustifolius strain ISLU101, revealed the presence of an extrachromosomal replication origin homologous to repABC cluster from plasmid present in Bradyrhizobium spp BTAi1. This repABC cluster gene sequence allowed the identification of extrachromosomic replication origin in 19 out of 72 Bradyrhizobium strains from Lupinus spp., a highly significant result since the absence of plasmids in the Bradyrhizobium genus was traditionally assumed. The repABC gene sequences of these strains grouped them in a unique monophyletic group, related to B. sp. BTAi1 plasmid, but differentiated from the repABC gene cluster of plasmids in fast growing rhizobium strains. The last topic was focused on characterization of type III secreted effectors present in Lmj endosymbiotic bacteria. Type III secretion systems (T3SS) are specialized protein export machineries which can deliver effector proteins into plant cells. The presence of T3SS in rhizobia has frequently been related to the symbiotic nodulation host-range and may have a beneficial or detrimental effect on the symbiosis with legumes. In this context, the presence of T3SS in genomes of nine Lmj strains was investigated, and it was shown the presence of clusters encoding NopE type III-secreted protein similar to the NopE1 and NopE2 of B. diazoefficiens USDA 110T. The putative NopE protein of LmjC strain is at present being characterized regarding its structure and function.

Diseño y desarrollo de un modelo booleano probabilístico de regulación genética en el simulador de colonias bacterianas GRO

Resulta interesante comprender como microorganismos sencillos como la bacteria Escherichia coli poseen mecanismos no tan simples para responder al entorno en el que está gestionada por complicadas redes de regulación formadas por genes y proteínas, donde cada elemento de la red genética debe tomar parte en armonía, en el momento justo y la cantidad adecuada para dar lugar a la respuesta celular apropiada. La biología sintética es un nuevo área de la biología y la tecnología que fusiona la biolog ía molecular, la ingeniería genética y las herramientas computacionales, para crear sistemas biológicos con funcionalidades novedosas. Los sistemas creados sintéticamente son ya una realidad, y cada vez se acumulan más trabajos alrededor del mundo que muestran su factibilidad. En este campo no solo se hacen pequeñas modificaciones en la información genética, sino que también se diseñan, manipulan e introducen circuitos genéticos a los organismos. Actualmente, se hace un gran esfuerzo para construir circuitos genéticos formados por numerosos genes y caracterizar la interacción de los mismos con otras moléculas, su regulaci ón, expresión y funcionalidad en diferentes organismos. La mayoría de los proyectos de biología sintética que se han desarrollado hasta ahora, se basan en el conocimiento actual del funcionamiento de los organismos vivos. Sin embargo, la información es numerosa y creciente, por lo que se requiere de herramientas computacionales y matem áticas para integrar y hacer manejable esta gran cantidad de información. El simulador de colonias bacterianas GRO posee la capacidad de representar las dinámicas más simples del comportamiento celular, tales como crecimiento, división y comunicación intercelular mediante conjugación, pero carece de la capacidad de simular el comportamiento de la colonia en presencia de un circuito genético. Para ello, se ha creado un nuevo módulo de regulación genética que maneja las interaciones entre genes y proteínas de cada célula ejecutando respuestas celulares específicas. Dado que en la mayoría de los experimentos intervienen colonias del orden de 105 individuos, es necesario un módulo de regulación genética simplificado que permita representar de la forma más precisa posible este proceso en colonias de tales magnitudes. El módulo genético integrado en GRO se basa en una red booleana, en la que un gen puede transitar entre dos estados, on (expresado) o off (reprimido), y cuya transición viene dada por una serie de reglas lógicas.---ABSTRACT---It is interesting to understand how simple organisms such as Escherichia coli do not have simple mechanisms to respond to the environment in which they find themselves. This response is managed by complicated regulatory networks formed by genes and proteins, where each element of the genetic network should take part in harmony, at the right time and with the right amount to give rise to the appropriate cellular response. Synthetic biology is a new area of biology and technology that combines molecular biology, genetic engineering and computational tools to create biological systems with novel features. The synthetically created systems are already a reality, and increasingly accumulate work around the world showing their feasibility. In this field not only minor changes are made in the genetic information but also genetic circuits designed, manipulated and introduced into the organisms. Currently, it takes great effort to build genetic circuits formed by numerous genes and characterize their interaction with other molecules, their regulation, their expression and their function in different organisms. Most synthetic biology projects that have been developed so far are based on the current knowledge of the functioning of living organisms. However, there is a lot of information and it keeps accumulating, so it requires computational and mathematical tools to integrate and manage this wealth of information. The bacterial colonies simulator, GRO, has the ability to represent the simplest dynamics of cell behavior, such as growth, division and intercellular communication by conjugation, but lacks the ability to simulate the behavior of the colony in the presence of a genetic circuit. To this end, a new genetic regulation module that handles interactions between genes and proteins for each cell running specific cellular responses has been created. Since most experiments involve colonies of about 105 individuals, a simplified genetic module which represent cell dynamics as accurately and simply as possible is needed. The integrated genetic GRO module is based on a Boolean network, in which a gene can be in either of two states, on (expressed) or off (repressed), and whose transition is given by a set of logical rules.

Patrones y procesos espaciales en poblaciones y comunidades vegetales: nuevas herramientas e hipótesis

Generalmente los patrones espaciales de puntos en ecología, se definen en el espacio bi-dimensional, donde cada punto representado por el par ordenado (x,y), resume la ubicación espacial de una planta. La importancia de los patrones espaciales de plantas radica en que proceden como respuesta ante importantes procesos ecológicos asociados a la estructura de una población o comunidad. Tales procesos incluyen fenómenos como la dispersión de semillas, la competencia por recursos, la facilitación, respuesta de las plantas ante algún tipo de estrés, entre otros. En esta tesis se evalúan los factores y potenciales procesos subyacentes, que explican los patrones de distribución espacial de la biodiversidad vegetal en diferentes ecosistemas como bosque mediterráneo, bosque tropical y matorral seco tropical; haciendo uso de nuevas metodologías para comprobar hipótesis relacionadas a los procesos espaciales. En este trabajo se utilizaron dos niveles ecológicos para analizar los procesos espaciales, el nivel de población y el nivel de comunidad, con el fin de evaluar la importancia relativa de las interacciones intraespecíficas e interespecíficas. Me centré en el uso de funciones estadísticas que resumen los patrones de puntos para explorar y hacer inferencias a partir de datos espaciales, empezando con la construcción de un nuevo modelo nulo para inferir variantes del síndrome de dispersión de una planta parásita en España central. Se analizó la dependencia de los patrones espaciales tanto de los hospedantes afectados como de los no-afectados y se observó fuerte dependencia a pequeña y mediana distancia. Se utilizaron dos funciones (kernel) para simular la dispersión de la especie parásita y se identificó consistencia de estos modelos con otros síndromes de dispersión adicionalmente a la autodispersión. Un segundo tema consistió en desarrollar un método ANOVA de dos vías? para patrones de puntos replicados donde el interés se concentró en evaluar la interacción de dos factores. Este método se aplicó a un caso de estudio que consitió en analizar la influencia de la topografía y la altitud sobre el patrón espacial de un arbusto dominante en matorral seco al sur del Ecuador, cuyos datos provienen de patrones de puntos replicados basados en diseño. Partiendo de una metodología desarrollada para procesos uni-factoriales, se construyó el método para procesos bi-factoriales y así poder evaluar el efecto de interacción. Se observó que la topografía por sí sola así como la interacción con la altitud presentaron efecto significativo sobre la formación del patrón espacial. Un tercer tema fue identificar la relación entre el patrón espacial y el síndrome de dispersión de la comunidad vegetal en el bosque tropical de la Isla de Barro Colorado (BCI), Panamá. Muchos estudios se han desarrollado en este bosque tropical y algunos han analizado la relación síndrome-patrón espacial, sin embargo lo novedoso de nuestro estudio es que se evaluaron un conjunto amplio de modelos (114 modelos) basados en procesos que incorporan la limitación de la dispersión y la heterogeneidad ambiental, y evalúan el efecto único y el efecto conjunto, para posteriormente seleccionar el modelo de mejor ajuste para cada especie. Más de la mitad de las especies presentaron patrón espacial consistente con el efecto conjutno de la limitación de la dispersión y heterogeneidad ambiental y el porcentaje restante de especies reveló en forma equitativa el efecto único de la heterogeneidad ambiental y efecto único de limitación de la dispersión. Finalmente, con la misma información del bosque tropical de BCI, y para entender las relaciones que subyacen para mantener el equilibrio de la biodiversidad, se desarrolló un índice de dispersión funcional local a nivel de individuo, que permita relacionar el patrón espacial con cuatro rasgos funcionales clave de las especies. Pese a que muchos estudios realizados involucran esta comunidad con la teoría neutral, se encontró que el ensamble de la comunidad de BCI está afectado por limitaciones de similaridad y de hábitat a diferentes escalas. ABSTRACT Overall the spatial point patterns in ecology are defined in two-dimensional space, where each point denoted by the (x,y) ordered pair, summarizes the spatial location of a plant. The spatial point patterns are essential because they arise in response to important ecological processes, associated with the structure of a population or community. Such processes include phenomena as seed dispersal, competition for resources, facilitation, and plant response to some type of stress, among others. In this thesis, some factors and potential underlying processes were evaluated in order to explain the spatial distribution patterns of plant biodiversity. It was done in different ecosystems such as Mediterranean forest, tropical forest and dry scrubland. For this purpose new methodologies were used to test hypothesis related to spatial processes. Two ecological levels were used to analyze the spatial processes, at population and community levels, in order to assess the relative importance of intraspecific and interspecific interactions. I focused on the use of spatial statistical functions to summarize point patterns to explore and make inferences from spatial data, starting with the construction of a new null model to infer variations about the dispersal syndrome of a parasitic plant in central Spain. Spatial dependence between point patterns in a multivariate point process of affected and unaffected hosts were analyzed and strong dependence was observed at small and medium distance. Two kernel functions were used to simulate the dispersion of parasitic plant and consistency of these models with other syndromes was identified, in addition to ballistic dispersion. A second issue was to analyze altitude and topography effects on the spatial population structure of a dominant shrub in the dry ecosystem in southern Ecuador, whose data come from replicated point patterns design-based. Based on a methodology developed for uni-factorial process, a method for bi-factorial processes was built to assess the interaction effect. The topography alone and interacting with altitude showed significant effect on the spatial pattern of shrub. A third issue was to identify the relationship between the spatial pattern and dispersal syndromes of plant community in the tropical forest of Barro Colorado Island (BCI), Panamá. Several studies have been developed in this tropical forest and some focused on the spatial pattern-syndrome relationship; however the novelty of our study is that a large set of models (114 models) including dispersal limitation and environmental heterogeneity were evaluated, used to identify the only and joint effect to subsequently select the best fit model for each species. Slightly more than fifty percent of the species showed spatial pattern consistent with only the dispersal limitation, and the remaining percentage of species revealed the only effect of environmental heterogeneity and habitat-dispersal limitation joined effect, equitably. Finally, with the same information from the tropical forest of BCI, and to understand the relationships underlying for balance of biodiversity, an index of the local functional dispersion was developed at the individual level, to relate the spatial pattern with four key functional traits of species. Although many studies involve this community with neutral theory, the assembly of the community is affected by similarity and habitat limitations at different scales.

Spawning and habitat management in salmonid populations at the southern edge of their natural ranges = Reproducción y gestión del hábitat en poblaciones de salmónidos en el extremo meridional de sus distribuciones naturales

Las poblaciones de salmónidos en la Península Ibérica (trucha común, Salmo trutta; y salmón atlántico, Salmo salar) se encuentran cerca del límite meridional de sus distribuciones naturales, y por tanto tienen una gran importancia para la conservación de estas especies. En la presente Tesis se han investigado algunos aspectos de la reproducción y de la gestión del hábitat, con el objeto de mejorar el conocimiento acerca de estas poblaciones meridionales de salmónidos. Se ha estudiado la reproducción de la trucha común en el río Castril (Andalucía, sur de España), donde se ha observado que la freza ocurre desde diciembre hasta abril con el máximo de actividad en febrero. Este hecho representa uno de los periodos reproductivos más tardíos y con mayor duración de toda la distribución natural de la especie. Además, actualmente se sabe que el resto de poblaciones andaluzas tienen periodos de reproducción similares (retrasados y extendidos). Análisis en la escala de la distribución natural de la trucha común, han mostrado que la latitud explica parcialmente tanto la fecha media de reproducción (R2 = 62.8%) como la duración del periodo de freza (R2 = 24.4%) mediante relaciones negativas: a menor latitud, la freza ocurre más tarde y durante más tiempo. Es verosímil que un periodo de freza largo suponga una ventaja para la supervivencia de las poblaciones de trucha en hábitats impredecibles, y por tanto se ha propuesto la siguiente hipótesis, que deberá ser comprobada en el futuro: la duración de la freza es mayor en hábitats impredecibles que en aquellos más predecibles. La elevada tasa de solapamiento de frezaderos observada en el río Castril no se explica únicamente por una excesiva densidad de reproductores. Las hembras de trucha eligieron lugares específicos para construir sus frezaderos en vez de dispersarse aleatoriamente dentro del hábitat adecuado para la freza que tenían disponible. Estas observaciones sugieren que las hembras tienen algún tipo de preferencia por solapar sus frezaderos. Además, en ríos calizos como el Castril, las gravas pueden ser muy cohesivas y difíciles de excavar, por lo que el solapamiento de frezaderos puede suponer una ventaja para la hembra, porque la excavación en sustratos que han sido previamente removidos por frezas anteriores requerirá menos gasto de energía que en sustratos con gravas cohesivas que no han sido alteradas. Por tanto, se ha propuesto la siguiente hipótesis, que deberá ser comprobada en el futuro: las hembras tienen una mayor preferencia por solapar sus frezaderos en ríos con sustratos cohesivos que en ríos con sustratos de gravas sueltas. En el marco de la gestión del hábitat, se han empleado dos enfoques diferentes para la evaluación del hábitat físico, con el objeto de cuantificar los cambios potenciales en la disponibilidad de hábitat, antes de la implementación real de determinadas medidas sobre el hábitat. En primer lugar, se ha evaluado el hábitat físico del salmón atlántico en el río Pas (Cantabria, norte de España), en la escala del microhábitat, empleando la metodología IFIM junto con un modelo hidráulico bidimensional (River2D). Se han simulado una serie de acciones de mejora del hábitat y se han cuantificado los cambios en el hábitat bajo estas acciones. Los resultados mostraron un aumento muy pequeño en la disponibilidad de hábitat, por lo que no sería efectivo implementar estas acciones en este tramo fluvial. En segundo lugar, se ha evaluado el hábitat físico de la trucha común en el río Tajuña (Guadalajara, centro de España), en la escala del mesohábitat, empleando la metodología MesoHABSIM. Actualmente, el río Tajuña está alterado por los usos agrícolas de sus riberas, y por tanto se ha diseñado una restauración para mitigar estos impactos y para llevar al río a un estado más natural. Se ha cuantificado la disponibilidad de hábitat tras la restauración planteada, y los resultados han permitido identificar los tramos en los que la restauración resultaría más eficaz. ABSTRACT Salmonid populations in the Iberian Peninsula (brown trout, Salmo trutta; and Atlantic salmon, Salmo salar) are close to the southern limit of their natural ranges, and therefore they are of great importance for the conservation of the species. In the present dissertation, some aspects of spawning and habitat management have been investigated, in order to improve the knowledge on these southern salmonid populations. Brown trout spawning have been studied in the river Castril (Andalusia, southern Spain), and it has been observed that spawning occurs from December until April with the maximum activity in February. This finding represents one of the most belated and protracted spawning periods within the natural range of the species. Furthermore, it is now known that the rest of Andalusian populations show similar (belated and extended) spawning periods. Broad-scale analyses throughout the brown trout natural range showed that latitude partly explained both spawning mean time (R2 = 62.8%) and spawning duration (R2 = 24.4%) by negative relationships: the lower the latitude, the later the spawning time and the longer the spawning period. It is plausible that a long spawning period would be an advantage for survival of trout populations in unpredictable habitats, and thus the following hypothesis has been proposed, which is yet to be tested: spawning duration is longer in unpredictable than in predictable habitats. High rate of redd superimposition observed in the river Castril was not only caused by high density of spawners. Trout females chose specific sites for redd construction instead of randomly dispersing over the suitable spawning habitat. These observations suggest that female spawners have some kind of preference for superimposing redds. Moreover, in limestone streams such as Castril, unused gravels can be very cohesive and hard to dig, and thus redd superimposition may be an advantage for female, because digging may require less energy expenditure in already used redd sites than in cohesive and embedded unused sites. Hence, the following hypothesis has been proposed, which is yet to be tested: females have a higher preference for superimposing redds in streambeds with cohesive and embedded substrates than in rivers with loose gravels. Within the topic of habitat management, two different approaches have been used for physical habitat assessment, in order to quantify the potential change in habitat availability, prior to the actual implementation of proposed habitat measures. Firstly, physical habitat for Atlantic salmon in the river Pas (Cantabria, northern Spain) has been assessed at the microhabitat scale, using the IFIM approach along with a two dimensional hydraulic model (River2D). Proposed habitat enhancement actions have been simulated and potential habitat change has been quantified. Results showed a very small increasing in habitat availability and therefore it is not worth to implement these measures in this stream reach. Secondly, physical habitat for brown trout in the river Tajuña (Guadalajara, central Spain) has been assessed at the mesohabitat scale, using the MesoHABSIM approach. The river Tajuña is currently impacted by surrounding agricultural uses, and thus restoration was designed to mitigate these impacts and to drive the river to a more natural state. Habitat availability after the planned restoration has been quantified, and the results have permitted to identify in which sites the restoration will be more effective.

Posibilidades de cultivo de nuevas especies marinas en el área mediterránea

La acuicultura, el cultivo y cría de animales y plantas acuáticas, representa en la actualidad una fuente esencial de proteína animal y vegetal altamente saludable y nutritiva, proporcionando un sistema de vida y de ingresos en todo el mundo. La acuicultura además de ser un motor para el desarrollo social y económico de las áreas costeras marinas y fluviales mundiales, supone en muchas regiones subdesarrolladas una garantía de alimento de alta calidad y es clave en la seguridad alimentaria de sus poblaciones. El desarrollo de la acuicultura se ha realizado fundamentalmente en los últimos 50 años, y ha sido sobre todo en la década de los años 80, cuando la acuicultura ha experimentado un fuerte crecimiento con tasas anuales que superan el 6%. Con el estancamiento de la producción pesquera y el incremento de la población mundial, la acuicultura se presenta como la única fuente posible de suministro de proteínas (vegetales y animales) de alta calidad, ricas en aceites omega 3 (EPA y DHA) de origen acuático. En la actualidad la producción procedente de la acuicultura supera los 95 millones de toneladas anuales, siendo ligeramente superior a los 94 millones de toneladas anuales provenientes de la pesca extractiva. De este total mundial acuícola, la producción asiática representa el 89%, mientras que la europea el 4,2% Aunque el 46% de la producción mundial acuícola se concentra únicamente en solo 10 especies, una de las principales características de la acuicultura es la gran diversidad de especies cultivadas, más de 500, realizándose su cría bajo diferentes tecnologías y sistemas productivos. El ámbito de esta tesis, es únicamente la acuicultura marina que se desarrolla en las aguas del mar mediterráneo, indistintamente de los sistemas y tecnología de producción utilizados. Los principales grupos de cultivo que se realizan en las aguas del Mediterráneo son los moluscos y los peces, siendo muy escasos los cultivos de otros grupos como crustáceos y macroalgas. La piscicultura marina mediterránea está dominada por el cultivo en jaulas flotantes de dos especies, la dorada (Sparus auratus) y la lubina (Dicentrarchus labrax). Estas dos especies y tras 30 años de experiencia de cultivo, mantienen todavía una ineficiencia productiva alta (reducida selección genética, lento crecimiento hasta talla comercial, alto factor de conversón del pienso…) y además ocupan un estrecho nicho de mercado, ya que prácticamente toda la comercialización de la dorada y lubina se realiza en fresco y sin elaborar ni transformar, a una talla media de 500 g. Para dar respuesta desde la acuicultura mediterránea al alto consumo y a la creciente demanda que en la Unión Europea existe de los productos acuícolas, y en especial los productos elaborados y transformados, es necesario de manera urgente, un aumento de la producción de las especies ya cultivadas (dorada y lubina) mediante la mejora de su eficiencia productiva, al mismo tiempo que se debe iniciar la producción industrial de nuevas especies piscícolas, mediante la diversificación de los cultivos. Para llevar a cabo esta diversificación, se hace necesario el establecimiento de una metodología clara, que asegure una selección de especies apropiadas y rentables para la industria acuícola mediterránea, cuyo cultivo sostenible debiera cumplir con los desafíos que el sector tiene. Nuevas especies que complementen y cubran las demandas actuales y futuras del mercado Europeo e Internacional de productos acuícolas. Nuevas especies con parámetros productivos eficientes, que garanticen unos costes productivos competitivos. Nuevas especies que puedan ser cultivadas utilizando como base la tecnología de producción ya existente en el sector. El objetivo de esta tesis es la definición y desarrollo de una metodología sencilla para la selección de nuevas especies piscícolas marinas para su cultivo eficiente y sostenible Y bajo la aplicación de esta metodología, la selección de un grupo de especies piscícolas para su cultivo rentable a corto y medio plazo (6-8 años) en el Mediterráneo. Para ello se ha definido y aplicado una metodología con la que se han evaluado diez especies candidatas, previamente escogidas de una serie de listas previas originadas en los distintos estudios y trabajos de diversificación realizados con anterioridad por otros equipos de investigación. Estas especies candidatas han sido: Seriola dumerili. (Seriola) , Argyrosomus regius (Corvina), Polyprion americanus (Cherna), Ephinephelus marginatus (Mero), Dentex dentex (Dentón), Pagrus pagrus (Pargo), Solea senegalensis (Lenguado del Senegal), Thunnus thynnus (Atún rojo), Mugil cephalus (Lisa), Coryphaena hippurus (Lampuga). El conjunto de estas especies ocupa un amplio y variado espectro dentro de las distintas áreas de mercado, productiva, tecnológica, y medioambiental . Y en todas ellas existe una experiencia mínima en sus diferentes fases de cultivo. En el desarrollo de la metodología de selección, en esta tesis se han definido diversos parámetros de evaluación, considerados como los más significativos y sencillos de aplicar. Los parámetros se han agrupado en tres bloques, el comercial, el productivo y el medioambiental. El Bloque de Mercado, comprende aquellos criterios que están relacionados con la comercialización de la especie. Calidad de la carne del pescado. Competencia con otras especies en el mercado. Potencial de Transformado. Precio de venta del pescado. El bloque Medioambiental incluye criterios del grado de idoneidad de la especie en la región y del grado de impacto ambiental de su cultivo. Rango de temperaturas del agua óptimo para el cultivo. Potencial impacto ambiental de su cultivo. Eslabón trófico de la especie.. El bloque Productivo, engloba los criterios y parámetros relacionados con el nivel de conocimiento y control que sobre su cultivo existen ( larvario, engorde, tecnología) Grado de control de la fase larvaria. Disponibilidad de alevines en el sector Crecimiento. Factor de conversión Aprovechamiento de la capacidad productiva instalada, Coste de inversión. Previa a la evaluación se han descrito las principales características de las especies candidatas en función del estado y experiencia actual sus cultivos. En la aplicación de estos criterios se han establecido matrices de evaluación y a cada criterio se le ha asignado un valor diferente en función de sus características y propiedades selectivas. Los resultados obtenidos mediante la aplicación de la metodología de evaluación propuesta, han señalado la seriola y la corvina como especies más recomendadas para su puesta en cultivo en el Mediterráneo a corto y medio plazo. Las otras dos especies seleccionadas han sido la lisa y la lampuga. Como conclusión final podemos señalar que el cultivo de nuevas especies es fundamentalmente para el desarrollo sostenible de la acuicultura mediterránea. Esta diversificación debe basarse en la aplicación de una metodología sencilla y práctica, que garantice una selección de especies cuyo cultivo sea rentable y abarquen nuevos segmentos de mercado. ABSTRACT Aquaculture, the cultivation and breeding of aquatic animals and plants, currently represents an essential source of highly nutritious and healthy protein that provides a way of life and income all over the world. Apart from being a social and economic driver in coastal and marine areas, it also entails a guaranteed high quality nourishment in many undeveloped areas being key to the alimentary safety of their population. Aquaculture has developed mainly in the last 50 years and experienced a high growth especially during the Eighties when the annual rates were above 6%. With fishing production stagnating and the global population increasing, aquaculture emerges as the only possible animal and vegetable protein source of aquatic origin, high in quality and omega 3 oils (EPA and DHA). Here and now, aquaculture production is over 95 million tons per year, which is slightly higher than the 94 million tons per year that come from extractive fisheries. From this aquaculture total, Asiatic production represents 89% while Europe´s is only 4.2%. Even though 46% of the global aquaculture production focuses just on 10 species, one of the main characteristics of aquaculture is the wide diversity of cultivated species –over 500– using different technologies and production systems. This PhD’s scope is only marine aquaculture in Mediterranean water, regardless of the technology or systems used. The main crop groups in the Mediterranean sea are molluscs and finfish, while crustacean and macroalgae cultivations are very limited. Mediterranean fish culture is dominated by the cultivation in floating cages of two species: Bream (Sparus auratus) and Bass (Dicentrarchus labrax). After 30 years of farming, these two species still keep a high productive inefficiency –reduced genetic selection, slow growth to marketable size, high feed conversion rate– and fill a narrow niche market as practically all bream and bass is sold fresh and whole, unprocessed and untransformed, with an average size of 500 grams. To meet the high consumption and growing demand of aquaculture products, in the European Union (especially those prepared and transformed), Mediterranean aquaculture needs to urgently increase the production of the species already under cultivation (Bass and Bream) by means of improving its productive efficiency and at the same time begin initiating industrial production of new species by diversifying the cultivation. To carry out this diversification it is necessary to establish a clear methodology that ensures the selection of adapted and profitable species for the Mediterranean aquaculture industry. The sustainable farming of these new species needs to meet the challenges this sector faces: New species that complement and meet the current and future needs of the European and International markets for aquaculture products. New species with efficient production parameters that ensure competitive production costs. New species that can be cultivated using already existing production technologies. The aim of this PhD is to define and develop a simple methodology for the selection of new marine fish species for their efficient and sustainable cultivation. And by applying this methodology, to select a group of fish species for its profitable crop in the short and medium term (6-8 years) in the Mediterranean. For this, a methodology has been defined and applied evaluating ten candidate species selected from a series of lists originated from different studies and from diversification works previously conducted by other research teams. These candidate species are: Seriola dumerili. (Greater amberjack), Argyrosomus regius (Meagre), Polyprion americanus (Wreckfish), Ephinephelus marginatus (Dusky grouper), Dentex dentex (Common dentex), Pagrus pagrus (Red porgy), Solea senegalensis (Senegal sole), Thunnus thynnus (Bluefin tuna), Mugil cephalus (Grey mullet), Coryphaena hippurus (Dolphinfish). All these species occupy a broad and varied spectrum within different productive, technological and environmental market areas. There is minimal experience in their different stages of cultivation for all of them. While developing the selection methodology several evaluation parameters have been defined in this PhD, considered the most significant and simple to apply. The parameters are grouped in three blocks: commercial, productivity and environmental. Market block comprises criteria related to the marketing of the species. Quality of the fish meatCompetition with other species in the marketTransformation potentialFish selling price Environment block includes criteria related to the degree of suitability of the species in the region and the degree of environmental impact of their cultivation. Optimal water temperature range for cultivationPotential environmental impact of their cultivationTrophic chain level. Productivity block includes criteria and parameters related to the level of knowledge and control over their cultivation (larval, ongrowing, technology) Degree of control of the larval stageAvailability of alevin in the sector GrowthFeed conversion rate. Exploitation of installed capacityInvestment cost Prior to the evaluation, the main characteristics of the candidate species have been described based on the current status and experience of their cultivations. When applying these criteria evaluation matrices have been established assigning to each criteria a different value depending on their characteristics and selective properties. The results obtained by applying the proposed assessment methodology have identified the Greater Amberjack and Meagre as the most recommended species for farming in the Mediterranean in the short and medium term. The other two selected species were the Grey Mullet and the Dolphinfish. In conclusion, the cultivation of new species is crucial for the sustainable development of Mediterranean aquaculture. This diversification has to be based on the application of a simple and practical methodology that guarantees a selection of species whose cultivation is profitable and covers new market segments.

Contribuciones para el tratamiento de aguas residuales con sistemas alternativos de bajo coste. Aplicaciones para el desarrollo en poblaciones reducidas y cooperación

Este trabajo se ha centrado en la búsqueda y análisis de técnicas de saneamiento y depuración que proporcionen soluciones a poblaciones pequeñas, que por su situación económica o de desarrollo, carecen de estos servicios básicos. Es bien conocido los problemas que genera la falta de acceso al saneamiento básico en contextos de subdesarrollo, agravado en numerosos casos, por los incrementos en la dotación de agua sin introducir las infraestructuras para el tratamiento de las aguas residuales. Esta situación incide directamente sobre la salud de las personas y del medioambiente. Afortunadamente existen Organismos Internacionales y Agencias de Desarrollo y de Medioambiente, que intervienen directamente en estos temas. Los problemas no sólo se presentan en los llamados países en vías de desarrollo, sino que se ha comprobado que también afecta a poblaciones pequeñas con escasos recursos, del mundo más desarrollado. Muchas han sido las técnicas utilizadas con gran éxito en programas de cooperación, pero algunas han fracasado por pérdida de funcionalidad, por errores de diseño, por rápido deterioro de los materiales, o simplemente por falta de adaptabilidad al terreno o no previsión de controles y mantenimiento. La solución a estos eventos pasa por la innovación tanto tecnológica como de gestión, sin olvidar la componente socioeconómica y cultural. Tomar conciencia de un buen diseño adaptado a las características del terreno y de la población, evitaría fracasos por colapso, por falta de mantenimiento, de financiación etc. Por otra parte, se considera necesaria la implementación de programas educativos que incluyan mejoras en los hábitos higiénicos y el conocimiento de las infraestructuras que permitan a la población de destino, adquirir una formación sobre las propias instalaciones, su uso, su mantenimiento y conservación. El desarrollo y mejora de las técnicas de saneamiento y depuración requiere una continuidad en las investigaciones que facilite la adaptación de las instalaciones ya existentes a las diferentes coyunturas que puedan presentarse, garantizando su funcionamiento a largo plazo. Las técnicas denominadas “no convencionales” se caracterizan por ser soluciones económicas y sostenibles, que en algunos casos, requieren poco mantenimiento e incluso éste puede realizarse por personal no especializado, esto es, por los propios usuarios del servicio. Concretamente en el presente trabajo se ha llevado a cabo una revisión general de las tipologías conocidas, tanto convencionales como no convencionales y de su posible aplicación en función de la población de destino, con especial incidencia en las poblaciones más desfavorecidas. Una vez realizada, se han seleccionado las técnicas de saneamiento y depuración no convencionales por el interés personal en las poblaciones con mayores dificultades socioeconómicas. Se han estudiado distintas situaciones en diferentes países y contextos Nicaragua, Ecuador, India y España. Es en esta última, donde se han tenido más facilidades para la obtención de datos y análisis de los mismos, concretamente de la instalación del municipio de Fabara en la provincia de Zaragoza, situado en el Bajo Aragón. ABSTRACT The focus of this project lies on the research and analysis of sanitation and waste water treatment techniques able to provide solutions to small settlements which lack such basic services out of economic or underdevelopment reasons. The problems generated by the absence of access to basic sanitation services in underdevelopment contexts are well known, and many cases can be found where increase of water provision doesn’t involve installation of waste water treatment infrastructures. This situation has a direct impact on people’s health and also on the environment. Fortunately, there are International Organizations and Development Agencies which act directly on these matters. These problems don’t only occur in so called developing countries, as it has been confirmed that small settlements with scarce resources in the more developed world can also be affected. Many techniques have been successfully used in cooperation programs, but also some of them have failed due to loss of functionality, design mistakes, rapid material deterioration, or simply site inadequacy or lack of control and maintenance precautions. The solution to these incidents requires technological as well as management innovation, regarding for all cases the socioeconomic and cultural factors. The awareness of a good design, adapted to the site and population characteristics, would prevent from failures due to collapse, lack of maintenance, funding, etc. Furthermore, the implementation of education programs for improving hygienic habits and for transmitting the understanding of the infrastructures is considered necessary for allowing the aimed population to gain proper knowledge on their own infrastructure, its use, maintenance and preservation. The improvement of sanitation and waste water treatment techniques requires a continuous process of investigation, in order to adapt the existing infrastructure to the different situations that may come up, being able to ensure its long-term functioning. The so called non conventional techniques are characterized by being economic and sustainable solutions, requiring in some cases low maintenance, conducted even by non specialized personnel, that is, by the users themselves. In the present project a general overview of the already developed typologies has been carried out, taking into account the conventional as well as the non conven tional techniques and their possible application according to the aimed population, regarding especially the most underprivileged settlements. Thereupon, out of interest for the settlements with most socioeconomic difficulties, the non conventional sanitation and waste water techniques have been selected. A variety of situations in different countries and contexts has been examined, specifically in Nicaragua, Ecuador, India and Spain. The latest has proven easier for data collection and analysis, focusing finally on the existing infrastructure in the village of Fabara, province of Zaragoza, in the Bajo Aragón.

Estudio de la estabilidad genética asociada a los procesos de crioconservación de ápices de menta

La crioconservación se ha descrito como una técnica de conservación ex situ a largo plazo que ha sido aplicada con éxito a numerosas especies, y resulta especialmente importante en aquellas con propagación vegetativa, infértiles o amenazadas, en las que sistemas de conservación ex situ más sencillos, como los bancos de semillas, no son posibles. También presenta ventajas frente a la conservación in vitro, ya que logra disminuir o eliminar problemas como la excesiva manipulación del material, evitando los subcultivos periódicos y disminuyendo así el riesgo de contaminaciones y de aparición de variación somaclonal. Sin embargo, someter al material vegetal a los procedimientos que implica la crioconservación provoca distintos estreses. Entre ellos, el estrés oxidativo puede potencialmente producir daños en membranas, proteínas, carbohidratos y en el ADN. En este trabajo se han evaluado diversos sistemas de crioconservación en ápices de Mentha × piperita L., híbrido estéril entre Mentha aquatica L. y Mentha spicata L. Se han utilizado ápices de dos genotipos (‘MEN 186’y ‘MEN 198’) en los cuales se compararon dos técnicas de crioconservación, encapsulación-deshidratación y vitrificación-droplet. El análisis de la supervivencia y capacidad de regeneración del material sometido a los tratamientos de crioconservación, junto con el análisis de la estabilidad genética de dicho material mediante marcadores moleculares (RAPD y AFLP) han permitido comparar los distintos protocolos y tratamientos establecidos. El estudio sobre el tipo de protocolo empleado reveló una mayor variabilidad genética en la técnica de encapsulación-deshidratación, especialmente en el genotipo ‘MEN 186’, ya que ‘MEN 198’ resultó ser más estable en todos los análisis. La inestabilidad encontrada en esta técnica no fue exclusiva de aquellos explantos crioconservados, sino que los pasos previos a la inmersión en nitrógeno líquido (NL) también provocaron variaciones en el ADN. Según el tipo de muestra analizada se encontraron diferencias en la estabilidad: muestras provenientes de callos presentaron una mayor inestabilidad que aquellas de hojas (brotes). Se utilizaron tres medios para la recuperación de los ápices tras la crioconservación con el uso de diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento: “Reed” (0,5 mgL-1 6-bencilaminopurina, BAP), “Senula” (0,5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purina, 2-iP + 0,1 mgL-1 ácido α-naftalen-acético, ANA) y “Nudos” (0,5 mgL-1 BAP + 0,1 mgL-1ANA). El medio “Reed” produjo un aumento en la supervivencia y recuperación de los ápices en ambos genotipos y técnicas, y disminuyó la formación de callo. Sin embargo, no tuvo un efecto significativo en la estabilidad genética. El medio “Senula” provocó una mayor estabilidad genética en el genotipo más inestable, ‘MEN 186’. Para reducir el daño oxidativo producido durante la encapsulación-deshidratación, e incrementar la recuperación de los ápices manteniendo su estabilidad genética, se comparó el efecto de añadir sustancias antioxidantes en el precultivo de los ápices (ácido ascórbico, vitamina E y glutatión). No se obtuvo la respuesta esperada y estos tratamientos no presentaron efectos significativos tanto en la estabilidad como en la recuperación. Para entender mejor qué sucede durante todo el proceso de encapsulación-deshidratación, se evaluó cada paso del protocolo por separado y su efecto en la estabilidad y la recuperación. Además, se determinó el estado de oxidación en cada etapa mediante la cuantificación de malondialdehído y la detección de la formación de radicales libres (mediante el ensayo del ácido tiobarbitúrico, y sondas fluorescentes específicas, respectivamente). Se determinó que a partir de los primeros pasos se genera estrés oxidativo, el cual aumenta a medida que se avanza por el protocolo hasta la inmersión en nitrógeno líquido. Esto se ve reflejado en la disminución progresiva tanto de la recuperación como de la estabilidad genética. Con el uso de antioxidantes en el precultivo (ácido ascórbico y vitamina E) no se obtuvo un efecto positivo en el mantenimiento de la estabilidad genética, y tan sólo con el uso de vitamina E se observó una recuperación mayor en uno de los pasos estudiados (después de la desecación). Sin embargo, cuando se utilizó ácido ascórbico durante el precultivo o la deshidratación osmótica se consiguió disminuir de forma significativa la formación de MDA y la acumulación del radical superóxido (O2•-) en la mayoría los pasos analizados, aunque esta reducción no parece tener un efecto directo en la estabilidad genética del material recuperado. ABSTRACT Cryopreservation has been described as an effective technique for the long term of ex situ conservation that has been successfully applied to numerous species, and is of especial relevance for those with vegetative propagation, infertile or endangered, in which simpler systems of ex situ conservation, such as seed banking, are not feasible. It also has advantages over in vitro conservation, as it reduces or eliminates excessive material handling, avoids periodic subcultures and thus limits the risk of contamination and the appearance of somaclonal variation. However, plant material is subjected to different treatments involved in the cryopreservation procedures, which impose several stresses. Among them, oxidative stress can potentially cause damage to membranes, proteins, carbohydrates and DNA. In this work, two cryopreservation techniques have been evaluated in Mentha × piperita L. shoot tips, sterile hybrid between Mentha aquatica L. and Mentha spicata L. Two genotypes ('MEN 186' and 'MEN 198') were used to compare two techniques: encapsulation-dehydration and droplet-vitrification. The analysis of survival and recovery capacity of the material after the cryopreservation treatments, and the analysis of the genetic stability by molecular markers (RAPD and AFLP) have enabled the comparison between protocols and treatments. The study of the two cryopreservation procedures revealed a higher genetic variability in the encapsulation-dehydration technique, especially in genotype 'MEN 186', as 'MEN 198' was more stable in all analyses. The instability generated in this technique was not exclusive of cryopreserved explants, pretreatments prior to immersion in NL also caused DNA variations. The type of sampled plant material revealed also differences in the stability: callus samples showed greater instability than shoots. Three different culture media were used for the recovery of shoot tips after cryopreservation, using different combinations of growth regulators: "Reed" (0.5 mgL-1 6-benzylaminopurine, BAP), "Senula" (0.5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purine, 2-iP + 0.1 mgL-1 α-naphthalene acetic acid, ANA) and "Nodes" (0.5 mgL-1 BAP + 0.1 mgL-1 ANA). "Reed" medium increased survival and recovery of shoot tips in both genotypes and techniques and decreased callus formation. However, it didn`t have a significant effect on genetic stability. "Senula" medium caused a higher genetic stability in the most unstable genotype, 'MEN 186'. To reduce oxidative damage during encapsulation-dehydration, and increase shoot tip recovery and maintain genetic stability, the effect of added antioxidants (ascorbic acid, vitamin E and glutathione) in the shoot tip preculture medium was studied. These treatments had no significant effect on both stability and recovery. To better understand the events during the encapsulation-dehydration process, the effect of each step of the protocol on stability and recovery was evaluated separately. Moreover, the oxidation level was determined by quantifying malondialdehyde (MDA) formation and detecting free radical accumulation (using the thiobarbituric acid assay, and specific fluorescent probes, respectively). The oxidative stress was detected from the first steps and increased throughout the protocol until the immersion in liquid nitrogen. This was also reflected in the gradual decline of recovery and genetic stability. The use of antioxidants (ascorbic acid and vitamin E) in the shoot tip preculture medium had no effect in maintaining genetic stability; only vitamin E increased recovery in one of the steps studied (after desiccation). However, when ascorbic acid was used during the preculture or during the osmotic dehydration, a significantly decrease was observed in MDA formation and superoxide radical accumulation in most of the steps analyzed, although this reduction did not seem to have a direct effect on the genetic stability of recovered material.

Conservación de plantas regeneradas in vitro y análisis de la variación somaclonal de Cinchona officinalis, Linneo

Cinchona officinalis (Rubiaceae), especie endémica del Valle de Loja, ubicado en la región sur del Ecuador, es un recurso forestal de importancia medicinal y ecológica, además la especie ha sido catalogada como planta nacional y es un ícono de la región sur por su aporte a la farmacopea mundial. Esta especie, entre los siglos XVII-XIX sufrió una gran presión en sus poblaciones debido a la extracción masiva de la corteza para la cura del paludismo. Aunque la actividad extractiva generó grandes ingresos a la Corona Española y a la región Sur del Ecuador, ésta fue poco o nada sustentable ecológicamente, provocando la desaparición de la especie en muchos sitios de la provincia, pues, en su momento, no se consideraron alternativas de recuperación de las poblaciones naturales. Actualmente la extracción y consumo de la corteza en la zona de origen es baja o nula, sin embargo esta zona enfrenta nuevas amenazas. La deforestación a causa de proyectos de desarrollo en infraestructuras, la práctica de actividades agrícolas y de ganadería, y los efectos del cambio climático han ocasionado, en estos últimos años, la fragmentación de los ecosistemas. La mayoría de los bosques del sur del Ecuador se han convertido en parches aislados (los bosques en los que se distribuye C. officinalis no son la excepción) siendo esta la principal causa para que la especie se encuentre en estado de amenaza. Los individuos de la especie tienen una alta capacidad de rebrote y producen semillas durante todo el año; sin embargo la capacidad germinativa y la tasa de sobrevivencia son bajas, además de estas dificultades la especie requiere de la asociación con otras especies vegetales para su desarrollo, lo cual ha limitado su distribución en pequeños parches aislados. Con esta problemática, la recuperación natural de las poblaciones es una necesidad evidente. Varios trabajos y esfuerzos previos se han realizado a nivel local: i. Identificación de la distribución actual y potencial; ii. Determinación de la fenología y fructificación iii. Programas de educación ambiental, iv. Análisis moleculares para determinar la diversidad genética. v. Ensayos de propagación vegetativa; y otras acciones de tipo cultural. No obstante, el estado de conservación y manejo de las poblaciones naturales no ha mejorado significativamente, siendo necesaria la aplicación de estrategias integradas de conservación in situ y ex situ, que permitan la recuperación y permanencia de las poblaciones naturales a largo plazo. El presente trabajo tiene como fin dar alternativas para el cultivo de tejidos in vitro de Cinchona officinalis centrados en la propagación masiva a partir de semillas, análisis de la fidelidad genética y alternativas de conservación de tejidos. Los objetivos específicos que se plantean son: i. Analizar el proceso de germinación y proliferación in vitro. ii. Evaluar la estabilidad genética en explantes cultivados in vitro, mediante marcadores ISSR. iii. Establecer protocolos de conservación in vitro mediante limitación del crecimiento y criopreservación de segmentos nodales y yemas. Los resultados más significativos de esta investigación fueron: i. El desarrollo de protocolos eficientes para mejorar los porcentajes de germinación y la proliferación de brotes en explantos cultivados in vitro. Para evaluar el efecto de los fenoles sobre la germinación, se determinó el contenido total de fenoles y el porcentaje de germinación en semillas de C. officinalis comparados con una especie de control, C. pubescens. Para inducir a proliferación, se utilizaron segmentos nodales de plántulas germinadas in vitro en medio Gamborg (1968) suplementado con diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas). Los resultados obtenidos sugieren que el contenido de compuestos fenólicos es alto en las semillas de C. officinalis en comparación con las semillas de C. pubescens. Estos fenoles pueden eliminarse con peróxido de hidrógeno o con lavados de agua para estimular la germinación. La formación de nuevos brotes y callos en la mayoría de las combinaciones de reguladores de crecimiento se observó en un período de 45 días. El mayor porcentaje de proliferación de brotes, formación de callos y presencia de brotes adventicios se obtuvo en medio Gamborg (B5) suplementado con 5.0 mg/l 6-bencil-aminopurina y 3.0 mg/l de ácido indol-3-butírico. ii. La evaluación de la fidelidad genética de los explantes obtenidos con distintas combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal y diversos subcultivos. Se realizó el seguimiento a los explantes obtenidos de la fase anterior, determinando el índice de multiplicación y analizando la fidelidad genética de los tejidos obtenidos por las dos vías regenerativas: brotación directa y regeneración de brotes a partir de callos. Este análisis se realizó por amplificación mediante PCR de las secuencias ubicadas entre microsatélites-ISSR (Inter simple sequence repeat). El medio Gamborg (B5) con 3.0 mg/l de AIB y 5.0 mg/l de BAP usado como medio de inducción en la primera etapa de cultivo generó el mayor índice de proliferación (11.5). Un total de 13 marcadores ISSR fueron analizados, 6 de éstos fueron polimórficos. El mayor porcentaje de variación somaclonal fue inducido en presencia de 1.0 mg/l 2,4-D combinado con 0.2 mg/l Kin con un 1.8% en el segundo sub-cultivo de regeneración, la cual incrementó a 3.6% en el tercer sub-cultivo. Todas las combinaciones con presencia de 2,4-D produjeron la formación de callos y presentaron variación genética. Por su parte la fidelidad genética se mantuvo en los sistemas de propagación directa a través de la formación de brotes a partir de meristemos preformados. iii. El establecimiento de protocolos de conservación in vitro y crioconservación de segmentos nodales y yemas. Para la conservación limitando el crecimiento, se cultivaron segmentos nodales en los medios MS y B5 en tres concentraciones de sus componentes (25, 50 y 100%); y en medio B5 más agentes osmóticos como el manitol, sorbitol y sacarosa en diferentes concentraciones (2, 4 y 8%); los cultivos se mantuvieron por 12 meses sin subcultivos. Para el establecimiento de protocolos para la crioconservación (paralización del metabolismo) se usaron yemas axilares y apicales a las cuales se les aplicaron los métodos de encapsulación-deshidratación y vitrificación. La efectividad de los protocolos usados se determinó en función de la sobrevivencia, reducción del crecimiento y regeneración. Los resultados obtenidos en este apartado reflejan que un crecimiento limitado puede mantener tejidos durante 12 meses de almacenamiento, usando medio B5 más manitol entre 2 y 8%. En los protocolos de crioconservación, se obtuvo el mayor porcentaje de recuperación tras la congelación en NL en el tratamiento control seguido por el método crioprotector de encapsulación-deshidratación. Este trabajo brinda alternativas para la propagación de C. officinalis bajo condiciones in vitro, partiendo de material vegetal con alta diversidad genética. El material propagado puede ser fuente de germoplasma para la recuperación y reforzamiento de las poblaciones naturales así como una alternativa de producción para las comunidades locales debido a la demanda actual de corteza de la zona de origen para la elaboración de agua tónica. ABSTRACT Cinchona officinalis (Rubiaceae) is endemic to the Loja Valley, located in the southern area of Ecuador. The importance of this plant as medical and ecological resource is so great that it has been designated as the national flower and is an icon of the southern region for its contribution to the world pharmacopoeia. Between XVII-XIX centuries its population suffered great reduction due to massive harvesting of the bark to cure malaria. Although extraction activity generated large revenues to the Spanish Crown and the southern region of Ecuador, this was not ecologically sustainable, causing the disappearance of the species in many areas of the province, because during that time alternatives to prevent extinction and recover natural populations were not taken in account. Currently the extraction and consumption of bark in the area of origin is almost absent, but this species faces new threats. Deforestation due to infrastructure development, the practice of farming and ranching, and the effects of climate change had led to the fragmentation of ecosystems during the recent years. Most of the forests of southern Ecuador have become isolated patches, including those where C. officinalis is diffused. The lack of suitable habitat is today the main threat for the species. The species has a high capacity for regeneration and produces seeds throughout the year, but the germination rate is low and the growth is slow. In addition, the species requires the association with other plant species to develop. All these factors had limited its distribution to small isolated patches. The natural recovery of populations is essential to face this problem. Several studies and previous efforts had been made at local level: i. Identification of current and potential distribution; ii. Phenology determination. iii. Environmental education programs, iv. Molecular analisis to determine the genetic diversity. v. Testing of vegetative propagation; and other actions of cultural nature. Despite these efforts, the state of conservation and management of natural populations has not improved significantly. Implementation of integrated in situ and ex situ conservation strategies for the recovery and permanence of long-term natural populations is still needed. This work aims to provide alternatives for in vitro culture of tissue of Cinchona officinalis focused on mass propagation from seeds, genetic fidelity analysis and tissue conservation alternatives. The specific aims are: i. Analyze the process of germination and proliferation in vitro. ii. To evaluate the genetic stability of the explants cultured in vitro by ISSR markers. iii. Establish protocols for in vitro conservation by limiting growth and cryopreservation of nodal segments and buds. The most significant results of this research were: i. The development of efficient protocols to improve germination rates and proliferation of buds in explants cultured in vitro. To study the effect of phenols on germination, the total phenolic content and percentage germination was measured in C. officinalis and in a control species, C. pubescens, for comparison. The content of phenolic compounds in C. officinalis seeds is higher than in C. pubescens. These phenols can be removed with hydrogen peroxide or water washes to stimulate germination. To analyze the regeneration, we used nodal explants from seedlings germinated in vitro on Gamborg medium (1968) supplemented with different combinations of growth regulators (auxins and cytokinins) to induce proliferation. The formation of new shoots and calluses was observed within a period of 45 days in most combinations of growth regulators. The highest percentage of shoot proliferation, callus formation and adventitious buds were obtained in B5 medium supplemented with 5.0 mg/l 6-benzyl-aminopurine and 3.0 mg/l indole-3-butyric acid. ii. Evaluating genetic fidelity explants obtained with various combinations of plant growth regulators and different subcultures. The genetic fidelity was analyzed in tissues obtained by the two regenerative pathways: direct sprouting and shoot regeneration from callus. This analysis was performed by PCR amplification of the sequences located between microsatellite-ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Among a total of 13 ISSR markers analyzed, 6 were polymorphic. The highest percentage of somaclonal variation was induced in the presence of 1.0 mg/l 2,4-D combined with 0.2 mg/l Kin with 1.8% in the second round of regeneration, and increased to 3.6% in the third round. The presence of 2,4-D induced genetic variation in all the combinations of growth regulators. Meanwhile genetic fidelity remained systems propagation through direct shoot formation from meristems preformed. iii. Establishing conservation protocols in vitro and cryoconservation of nodal segments and buds. For medium-term conservation (limited growth) nodal segments were cultured in MS and B5 media at three concentrations (25, 50 and 100%); we tested B5 medium with different concentrations of osmotic agents such as mannitol, sorbitol and sucrose (2, 4 and 8%); cultures were maintained for 12 months with regular subculturing. To establish protocols for cryoconservation (cessation of metabolism) different methods of encapsulation-dehydration and vitrification were applied to axillary and apical buds. The effectiveness of the used protocols is determined based on the survival, growth and regeneration success. The results show that these tissues can be maintained in storage for 12 months, using B5 medium plus mannitol between 2 and 8%. The cryoconservation protocol with highest percentage of recovery was obtained by contral treatment, followed by freezing in NL with encapsulation-dehydration method. This work provides alternatives for the propagation in vitro of C. officinalis, starting from plant material with high genetic diversity. The obtained material represents a source of germplasm to support the recovery and strengthening of natural populations as well as a creation of alternative sources for local communities due to the current demand of bark for the preparation of tonic water.